МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

НЕИНВАЗИВНЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДАПТАЦИОННОГО СТАТУСА В ДИАГНОСТИКЕ ДОНОЗОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ ОРГАНИЗМА ПРИ АНТРОПОГЕННЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

№94/255

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЬЧШЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

НЕИНВАЗИВНЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДАПТАЦИОННОГО СТАТУСА В ДИАГНОСТИКЕ ДОНОЗОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ ОРГАНИЗМА ПРИ АНТРОПОГЕННЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ

Методические рекомендации » 94/255

Санк^г-Петербург 1995

-10-

ру выращивает на питательном агаре 48 ч при 37°С, смывает физиоло-гичес( гм раствором, Фильтрует через слой ваты, триады отмывает дистиллированной водой и четыре раза ацетоном на холоде, высушивает при комнатной температуре. Полученный порошок можно длительно хранить в сухом месте при температуре 4-6°С.

Ход исследования. Слону разводят I : 20 ФБР и в ряду пробирс к делают двойные ее разведения в объеме 0,5 мл до I : 40960. При исследовании большого числа проб предельное разведение определяется опытно, предварительном титрованием. Во все пробирки добавляют равный объем двухмиллиардной взвеси суточной агаровой культуры или порошка микрококка в ФБР* В качестве контроля используют пробирку с 0,5 мл взвеси микрококка и 0,5 мл ФБР. Пробирки встряхивают и выдерживает 3 ч при 37°С в термостате.

Учет и интерпретации результатов. Учет реакции производится по последней пробирке ряда, в которой наблюдается лизис тест-культуры при сравнении с контрольной и выражается в виде титра - максимального разведения слюны, давшего феномен лизиса.

Среднегеометрическое значение титров лизоцима у здоровых детей в экологически благополучных регионах I 20000 - I : 30000. В промышленшх центрах, в районах с загрязненным атмосферным воздухом значение титров лизоцима I : 5000 - I : 7000.

Количественный турбидиметрический метод определения активности лизоцима в слюне

Принцип метода :    турбидиметрическое    измерение

степени светопропускания микробной взвеси микрококка до и после контакта с лизоцимом исследуемого материала (Каграмова К.А., Ермольева З.В., 1966).

- нгредиенты и принадлежности. Исследуемый материал, кристаллический лизоцим (коммерческий препарат), фосфатный буферный раствор, pH 6_f2 (ФБР), суточная агаровая культура или порошок микрококка, вата гигроскопическая, фильтровальная бумага, пробирки бактериологические, пипетки бактериологические на <Г и 5 мл, штативьч воронки стеклянные, термостат, фотов л ектоо колориметр, работавший а режиме турбидиметрического учета и имеющий'в комплекте зеленый светофильтр (длина волны 540 нм).

Тод исследования. Для количественного определения лизецгма строят калибровочную кривую, исходя из концентрации фермента 2. 4 6, 8 мкг в пробе (большие и меньшие кенцечтраиия лизоцима брать нецелесообразно), используя стандартный раствор    sqs    г

-и -

лизоцима, который может храниться длительное время в запаянных аи-пупах в эзмсрсженном состоянии. Из него готовят исходный раствор лизоцима (8 мкг/мл).

Для приготовления микробной взвеси суточную агаровую культуру микрококка смывают ФБР, Фильтруют через слой ваты, стандартизируют на ФЭК с зеленым светофильтром (длина волны 540 нм). Сухо! поровок растворяют в ФБР и станлартиэируют на ФЭК. Оптическая плотность

взвеси должна быть 0,6-0,7.

Для построения калибровочной кривой берут 10 пробирок: I и 2 -контроль без лизоцима (I мл ФБР), 3 и 4 - 2 мкг/мл лизоцима (0,25 мл .«сходного раствора лизоцима 0,75 мл ФБР), 5 и 6 - 4 мкг/мл лизоцима (0,5 мл исходного раствора лизоцима 4- 0,5 мл ФБР), 7 ■ 8 -6 мкг/мл лизоцима (0,75 мл исходного растворе лиэощыв + 0,25 мл ФБР), 9 и 10 - 8 мкг/мл лизоцима (I мл исходного раствора лиэокршв).

В каждую пробирку с интервалом ЭО с вносят по 6 ш суспензии микрококка. Сразу после прилива ни я суспензии измеряет гатшшьцуи гн-тическую плотность контрольных растворов, а через ЭО при 37°С - конечную оптическую плотность omirmx, mwai с го и делая последующее измерение через ЭО с после предыдущего. По полученным результатам измерений строят калибровочную крылу*.

Для определения лизоцима в стоне ее разводит f : 40 ФБР. If ¥ разведения прибавляют 6 мл суспензии микрококка. Дальнейшее исследование проводят как изложено выие. Полученный результат опгачесис? плотности согласно калибровочной кривой рыражаюг в мкг/мл едины.

При определении лизоцима необходимо строго выдерживать рЯ среды, температурный и пкстюз.шионтй режимы, точно дозировать игре-лиенты, пользоваться химически чистой посудой.

Учет и интерпретация результатов. У здоровых детей в экологически благопслучных регионах содержание лизоцима в слюне составляет ТОО-120 мкг/ч?. Ь оегионях с загрязненным атиосфершм воэдуот ~изоиим слюни ^Ticpo^vx детей содержится в количестве. 20-ТО ют/ш.

ы^ЩЦЫ

Чет од проведения знт ишфянгвого теста

Принцип метод® сп^к^рофотометричеевге иэме-

пение 4-нтг розова чпирина. образующегося при взаимодействии антики» ринэ с нитритом натрия в присутствии серной кислоты.

Реактивы г (ГОС г Z*$C_A • VH^O и 40 мл 6»1^$0₄ в t л НуО), 1''Я ГО,751*'    #3 ,'JH Н-5С₄З_г Р4 'О,Н NaN0₂).

- 12 -

Ход определения. Чистый антипирин (без чапоя^-ителя) принимают утром натогак в дозе 11-°0 мг на I кг массы тела ^но не более I г), растворив в 0,5 стакана воды комнатной температуры. Слюну собирают через 2, 1, 6 ч и центрифугируют Т5 мин при 3000 об/мин (осадок отбросить). К 2 мл отцентрифугированной слюны последовательно добавляют 2 ял реактива № I и 2 мл реактива # 2. Полученную смесь тщате: ^но перемешивают и ;ентрифугируют в течение 15 мин при 6000 об/мин. К 3 мл супернатанта добавляют 0,1 мл реактива »3 и 0,2 мл свежеприготовленного реактива * 4. Через 20 мин инкубации при 20°С измеряют оптическую плотность проб при Л 340 нм против контроля, состоящего из 3 мл HgC, 0,1 мл реактива № 3 и 0,2 реактива № 4. Количество антипирина (в мкг) находят по калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой готовят раствор антипирина, содержащий 2 мг вещества в 100 мл 0,07 Л HgSO^, Для определения времен’' полувыьедения антипирина строят график зависимости между натуральным логарифмом концентрации антипирина и временем взятия пробы (в ч~сах).

Метод определения активности глутатион-,?-трансФеразы (Г-$-Т) в слюне

Принцип метода. Активность Г-$-Т определяют с помощью субстрата !-С^-2,4-динитробензола (ХДНБ) по накоплению продуктов реакции - конъюгата глутатиона с ХДНБ. Накопление продукта реакции сопровождается изменением оптической плотности реакционной смеси при X 340 нм.

Реактивы: калий-фосфатный буфер 0,1 М, pH о,5; глутатион восстановленной (Г-З-Н) 25 мМ раствор в 0,1 М калий-фосфатном буфере, pH 6,5; ХДНБ 100 ммоль (растворяется в спирте при нагревании).

Ход определения. Определение активности производится в термостатированных кюветах при 25°С. В кювету последовательно вносят 2,72 мл калий-^юсфатного буфера, 0,12 мл восстановленного глутати-Она, 0,1 мл слюны и 0,06 мл ХДНБ и включают секуццомер. Определение проводится через каждые 30 с в течение 3 мин. Снимают показания против контроля (3 мл калий-фосфатного буфера и 0,05 мл слюны) при X 340 нм. Кроме того снимают показания в холостой пробе (в кювету вносят те же реактигы, только без слюны).

Расчет производится по формуле:

д а Е • 3 « I0³

" t ‘К » с ’ ИГ

- 13 -

где дЕ - изменение оптической плотности за 3 мин (^Е0пьгта"^Ехолс ^той^

пробы

3 - объем расть:ра в Кювете; Г - время « секундах; К - коэффициент молярной экстинкции конъюгата глутатиона и ХДНБ, равный 9,6 •    ■    см“^;    с    -    концентрагня белка в пробе, If - объем слю

ны, взятый в пробу.

Метод определения активности Z*-, Сц.-зависимой супероксиддисмутазы (СОД) в слюне

Принцип метода. Используется система, состоящая из рибофлавина и тетраметилэтиле^ттдиамина в фосфатном буфере, облучаемых лампой дневного света мощностью 20 Вт на расстоянии 20 см. Время облучения 5 мин. Образующийся в процессе облучения супероксидный радикал подвергается оеакции дисмутации и конкурирующей реакции взаимодействия с парэ-нитротетразолием хлористым (n-HLO. В опытной пробе скорость ферментативной реакции дисмутации значительно превышает скорость восстановлен ;я п-НГХ, поэтому ст пень образования формазана низкая. В опытной пробе, 1де СОД ингибирована кипячением, скорость восстановления п-НГХ больше скорости спонтанной дисмутации 0£, в силу чего степень образования формазана высокая.

В контроле на реактивы и эндогенное восстановление п-КГХ отсутствует тетраметилэтилендиамин, поэтому фотохимическая система продукции 0£ не работает.

Реактивы: 0,5 мМ воддай раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДГА); 0,05 М раствор тетраметилэтилендиамина (ТЭЙЭД) на 0,5 мМ растворе ЭДГА (гсден через 2 ч после приготовления, хранится в течение суток); 0,034 мМ водный раствор рибофлавина (хранится в течение рабочего дня в темной посуде) 0,85 мМ пара-нитро^ зтраг-э-лий хлористый; К,№а-фосфатный буфер 0,1 М, pH 7,8; К,Ма-фосфатный буфер 0,05 М, pH 9,1; 10^ водный раствор йодистого калия.

Ход определения.

Реактивы и проводимая процедура	Контрольная проба, мл	Опытная проба 4 I, мл	Опытная проба И 2, мл
Слюна	0,2	0,2	0,*
н20	3	2,5	2,5
Кипячение	-	15 мин	-
Фосфатный буфер, pH 9,Т		-	-
Фосфатный б'/*ортг>Н 7,0	-	0,5	0,5

Реактивы и проводимая процедура	Контрольная проба, мл ;	Опытная проба ^ 4, мл	Опытная проба u 2, мл
ТЭИ1ЭД	-	0,5	0,5
п-НГХ	0,5	0,5	0,5
Рибофлавин	т.0	т.о	т.о
Облучение лампой доевнс го	5 мин	5 мин	5 мин
света Яодистый калий	0,5	0,5	0,5

Пробы Фотометрируот при Я 490 нм*

Расчет реактивности СОД в процентах торможения образования формазана проводят по формул?:

^ЕфД*Д-^Е0Р-Д_-2 ,₁₀₍$ торможения).

^СОД * 4 ^контр.

Условная единица активности СОД соответствует 50^ торможен/ы в пересчете на 4 с и 1 г белка в пробе.

*етод определения активности глутатионперок идазы (ГПО) в слоне

геактивп: и,1 .4    ph    7,4;    ГРИС-0,1    Ь₍4;

0,0Ь мМ этилеициаминтеграуксусная кислота, натриевая соль l/Va-OJiTA), 4.9*    азид    натрия;    2    мм глутатиона восстановленного в ТРИС-Ж#,

pH 7,4; ТО мМ раствор перекиси водорода; трихлоруксусная кислота 10% (ТХУ); реактив Эллмана 0,04% в 0,4% цитрате натрия*

Ход определения. В контрольные и опытные пробирки последсва тельно вносят Т,1 мл М_о0; 0,5 мл ТРИС-HCi, pH 7,4; 0,1 мл ЭДТА,

0,1 мл раствора азида натрия; Г мл раствора восстановленного гау-татиона; 0,2 мл стони. Дополнительно в контрольные пробирки вносят 1,0 мл Н^О и помечают все пробирки в водяную баню при 37°С на 3 мин для претнубации. Б опытные пробы добавляют 1,0 мл раствора Н₂0₂ и инкубируют Н мин. Реакцию останавливают д бавление" во все пробирЕ<и I мл ТХУ, а помещают пробы в лед н; 5 мин. После Фильтрования в пробирки вносят 1,0 мл Фильтрата, 2,Ь мл Т^ПИС-НС£, pH Б,*, 0,1 мл реэктива Оллмана. Через 10 гчн пробы Фотометрируют при \ 412 нм.

-15-a F • fi i TO^

Расчет активности: A = -—— мкМ/с*г белка, где дЕ -

t-K-c V

разница в оптической плотности между контрольной и опытной пробами;

6 - разведение сл.ны; t - время инкубации проб в секундах; К -коэффициент молярной экстинкции, равный 11400    * см”^; с - кон

центрация белка в пробе; 1S - объем слюны, взятой на определение.

Метод определения глутатионредуктазы (ГР) в слюне

Принцип метода:    глутатионредуктаза катализиру

ет реакцию восстановления окисленного глутатиона (Г$-$!Г) по ~хеме:

г$ - sr + ндден + н+ -Л— 2Г -$н + надо⁺.

Уменьшение содержания НАДОН в пробе определяют спектрофгтометричес-ки при Я 340 нм.

Реактивы: 1 М ТРИС-НС£ на 5 мМ ЭДГА, pH 8,0; 0,033 мМ глутатион окисленный (Г$-$Г); нейтрализоЕ нный NaOH до pH 7,С; 2 мМ НАДОН.

Ход определение. В пробирки последовательно вносят 0,15 мл Т?ИС-НС£, 2,2 мл Н₂0, 0,2 мл слюны, взятой натощак, тщательно перемешивают и инкубируют на водяной бане при 37°С. Через 10 мин в опытные пробирки добавляют 0,15 мл раствора НАДОН, спектрофотометрируют и помещают снова в водяную баню (37°С). Уменьшение оптической плотности измеряют через 30 мин. Снимают показания против контроля (0,15 мл слюны + 2,85 мл Н₂0). Контроль обрабатывают так же, как опытные пробы. Расчет производят по Формуле:

А ₌ Дв : 3. Г ДО. нмоль/с*г,

К- t•с*#

где дЕ - изменение оптической плотности (Ejq _мин -    );

3 - объем раствора в кювете; К - коэффициент молярной экстинкции НАДОН, равный 6,°2 • 10^    •    см“*;    t - время в секувдах; с - со

держание белка в пробе; ^ - объем слота в пробе.

Метод количественного определения общих сульфгццрильных и дисульфвдных гюупп обратным змперометрт'ческим титрованием

Принцип метода. Титрование растворов, содер-

- 16 -

жащих тиоловые группы, производят в присутствии избытка ионов серебра (Ад⁺), которые с ^с'Н-группами образуют прочную меркаптиднук-

связь по уравнению: R - £Н + Ад⁺ ->    R    -    3    - Ag + Н*. Избыток

ионов Ag^J оттитровывается эквимолярным раствором унитиола. По полученным данным проводят соответствующий подсчет ЗН-групп в молекулах белка. Расщепление -Jf-5-групп сульфитом fJa (NagSOg) производят также j присутствии избыт а ионов Ад⁺. Образующиеся при восстановлении -S-S-групп -5Н-глуппы связываются с ионами Aj⁺ по уравнению:

R -5-5“ R + Atj⁺ + 50^ -^    R    -    50₃А^    +    R    -    £    -    Aj.    Избыток

ионов Ад⁺ отти ровывается раствором унитиола.

Оборудование. Для обратного амперомефического титрования £Н-и -5-5-групп используется установка с рабочим Pt-электродом и соответствующим электродом сравнения. Для перемешивания жидкостей в сосуде для титрования применяют магнитную мыпалку.

Реактлвы: 30% водный раствор КС£; 0,001 М водный раствор Ад 0₃; аммиачный бу*ер (0,2 М водный раствор аммиака и 0,2 И водный раствор аэотно ислого аммония смешивают в соотношении Я:1); электролит (4,2 г KI и 1,3 г Hgl 2 ь 100 мл 30% КПI); гель агаровый для заполнения мостика (3 г агара растворяют на водяной бане в 100 мл 25% КСИ; 5 * Ю"⁴ М водный раствор унитиола.

Ход определения ,?Н-групп. В сосуд для титрования вносят 50 мл аммиачного буфера \ 0,15 «л разведенной слюны (1:3), с эда же погружают платиновый электрод и конец мостика, и ьктачают магнитную мешалку. Пипеткой добавляют 0,5 мл раствора AgMOg. После того, как стрелка прибора займет стабильное положение, начинают титрование, добавляя из пипетки по 0,05 мл унитиола и отмечая показания прибора. Для определения результатов титрования строят график, на оси ординат которого откладывают величину тока, возникающего в ходе титрования, а на оси абсцисс - соответствующие им величины объема добавленного унииола. Две прямые, проходящие через полученные точки, пересекаются в конечной точке титрования. Учитывая, что 4 мл 5 • I0*⁴ М раствора унитиола эквивалентен I мкМ £Н-групп, производят расчет:

К во SH-групп Т^Р^&створа унитиола. затраченного на титрование*Р 15* раствора слюны, взятого на титрование

мкмоль/мл,

где if - объем, 1 - разведение.

Ход определения -$-8^групп. В сосуд для титрования, содержащий 50 мл аммиачного буфера, вносят 0,15 мл разбавленной слюны (1:3);

- 17 -

0,5 мл раствора A^NOg и на кончике скальпеля сухого Na^Og. После того, как стрелка прибора займет стабильное положение, начинают титрование раствором унитиола, добавляя ег^г по 0,05 мл. После построения графика проводят расчет по формуле:

— Ес*и) * Р

К-во ^-5-групп = -=-—-мкмоль/мл,

* * ^ пробы

где Р - разведение; Е - количество унитиола, затраченное на титрования; U - объем пробы (мл).

Примеры интерпретации биохимических параметров неспецифической резистентности организма

Приводим результаты обследования здоровых детей дошкольного возраста (5-7 лет), проживающих в 2 экологически неравноценных районах: крупного промышленного города и загородной зоны.

Показатели системы НРО у детей, проживающих в условно "чистом” районе, составляют: белок - (22, 0 + 2,8) *10“^ г/мл; активность ферментов Г-i'-T - 128,2 + °,2 мкмоль/с*г; СОД - 6,3 + 0,о ед.акт./ С’Г; ГПО - 852,9 + 74 мкмоль/с*г; ГР - 0,054 ± 0,006 мкмоль/с*г. Содержание сульфгидрильных групп (-$Н) - 4,3 + 0,1 мкмоль/мл, ди-сульфидных (SS) групп - 1,75 ± 0,02 мкмоль/мл; тиолдисульфидный коэффициент - <,Н/,$£ - 2,5 + 0,01.

У детей, проживающих в экологически неблагоприятном районе, наблюдается смещение окислительно-восстановительного гомеостаза в сторону окисленных форм (УН/W = 2,0 + 0,08) в результате снижения тиоловых (SH = 3,8 + 0,1 мкмоль/мл) и нарастания дисульфидных (    = 1,9 + 0,04 мкмоль/мл) групп. Падение восстановительного по

тенциала у этих детей может быть связано со снижением активности ГР до 0,037 + 0,003 мкмоль/с*г - ведущего фермента, участвующего в регенерации восстановительных тиолов. Кроме того, судя по возрастанию активности ГПО до 1011,9 ± 101,5 мкмоль/с*г, у детей в экологически неблагоприятном районе усиливаются процессы свободно радикального и перекисного окисления. Эти факты свидетельствуют о напряжении системы неспецифич^ской защиты у детей и необходимости проведения у них оздоровительных мероприятий, направленных на коррекцию звеньев антиоксидантной и антирадикальной защиты.

- 18

Методика сбора, хранения и предварительная обработка слюны

Для иммунологических и биохимических исследований собирают смешанную слюну из полости рта утром натощак, прополоскав рот несколько раз водой. Перед забором слюны обследуемый для стимуляции слюнос:деления жует парж{ :н. Можно собирать слюну без стимуляции.

У детей усилен..е слюноотделения можно вызвать рефлекторно, предложив им мысленно представить, что они едят кислые лимон, клюкву, яблоко. Чрезвычайно важно проконтролировать и проследить, чтобы дети не сосали десны» щеки! Это приведет к поя >лению в слюне посторонних материалов: крови, содержимого десневых карманов и т.д. Подобные пробы слюны следует исключать из дальнейшей обработки. Простым сливанием из полости рта испытуемый собирает слюну в чистые стеклянные флакончики с резиновой пробкой (пенициллиновые флакончики) Слюну собирают через 1-3 ^тт после приема пищи (для иммунологических исследований в объеме 2-3 мл). Флаконы закрывают резиновой пробкой и транспортируют (без специальны^ требований)"¹ лабораторию. Полученный субстрат загрязнен большим количеством микроорганизмов, что создает условия деградации иммуноглобулинов, антител и других субстратов, которые могут¹ тестироваться. Поэтому собранный материал центрифугируют при 3000 ot/мин в течение 30 мин на холоде (+4°С>. Иммуноглобулины, в частности секреторные, желательно определять сразу же. При невозможности постановки опытов в день обследования слюну сохраняют в замороженном состоянии при температуре от -6 до -20°С. Периодическое размораживание нежелатепьно. Нельзя хранить при комнатной температуре. При исследовании слюны на лизоцим условия те же, хранение слюны при этом может быть более продолжительным (до одного года). Тестирование материала проводится в соответствии с изложенными в рекомендациях методами.

Для биохимических исследований смешанную слюну собирают в количестве 3,5-4 мл. Транспортировать и хранить слюну для определения активности ферментов следует на холоде (+4°С) не более 5 ч. Слюна для определения тиолдисульфидного соотношения и антипирино-вого теста может храниться в замороженном состоянии в течение 5 сут.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предлагаемые неинвазивные методы определения адаптационного статуса организма ури антропогенных воздействиях обладают высокой чувствительностью, простотой и апробированы при массовых обследова-

- 19 -

ииих детских контингентов и взрослого населения. Использование нетрадиционного материала - слюны для определения биохимических и иммунологических показателей неспецифической резистентности организма позволяет проводить массовые обследования в неблагоприятных санитарно-эпидемиологических условиях (опасность СПИДа, сывороточного гепатита и других инфекций) и отрицательного отношения населения к разного рода обследованиям в экспериментальных целях. Высокая чувствите [ьность етодов дает возможность при обследовании здоровых лиц выявить ^ жние изменения функционального состояния организма и разработать необходимые профилактичес ив и коррекционные мероприятия.

Методические рекомендации содержат описание неинвазивных гы-соксчувствите.-ьньгх и информативных иммунологических, биохимических и цитологических методов исследования системы неспецифической резистентности организма, позволяющих осуществлять диагностику доно-зологических состоян :й и оценивать влияние t ггропогенных загрязнителей на растущий организм. Приведены величины показателей ведущих защитно-гтоиспособительных реакций организма, полученные в результате апробации описанных методов на больших контингентах детей дошкольного возоаста, проживающих в условиях антропогенных загрязнителей разной интенсивнс ,ти.

Издание предназначено для специалистов практического здравоохранения и научных учреждений, осуществляющих скрининговые обследования населения с целью интегральной оцен и и прогнозирования здоровья человека в разных условиях жизнедеятельности.

Методические рекомендации подготовлены сотрудниками Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им.И.И.М( чникова В.Г.Маймуловым, В.'"'.Тимофеевым, О.И.Пересыпкиным, В.А.Дадали, Г.А.Баскович, И.Н.Макаловой, Н.Н.Киселевой, В,В.Галушко, Н.П.Канды-бором, В.С.Лучкевичем, Л.Б.Гайковой, О.И.Ивгчовой, Т.С.ЧернякиноЙ, А.В.Леванчуком, А.В.Суворовой.

@ Санкт-Петербупгская государственная

медицинская академия им.И.И.Мечникова, 3995

ЛР # 020496

Подписано в печать 26.c9.95. Заказ №    ,    Формат    бумаги

60x04/16. 1,25 усл.печ.л. Тираж 300 экз. Цена свободная. ^{1 2}

- 3 -

ВВЕДЕНИЕ

В последние годы в связи с ухудшением экологической обстановки и здоровья населения страны, особенно детского, возникла необходимость в массовом изучении иммунологического и биохимического статуса с целью раннего выявления нарушений адаптационных возможностей организма.

Наш : ноголе\²ий опыт исследований показывает, что наиболее пригодными для этих целей являются показатели неспецифической резистентности организма. В результате обследования больших контингентов детей отобран комплекс неинвазивных, информативных и чувствительных методов изучения ведущих звеньев системы неспецифической защиты организма: антимикробной, акгитс, :сической, антирадинальной и других, позволяющих оценить на донозсюгическом уровне степень неблагоприятного воздействия средовых факторов антропогенного происхождения.

Впервые при проведении массовых медико-биологических обследований по комплексу биохимических и иммунологических показателе² рекомендуется использование слюны в отличие от традиционного материала - крови. Изложены методы оценки неспецифической иммунологической резистентности, основа² гые на изучении функций кожи и слизистых.

Рекомендуемые методы неинвазивны, поэтому для их использования нет противопоказаний.

В известные унифицирование методики нами внесены технические изменения, позволившие их упростить, повысить точность, ..дформатив-ность и адаптировать для работы с таким нетрадиционным материалом, как слюна. Методы характеризуются простотой технического выполнения, не требуют дефицитных реактивов и приборов, высокой квалификации исследователя. Они атравматичны, эпидемически безопасны, быстро выполнимы и позволяют проводить массовые скрининговые обследования больших контингентов населения разного возраста в любых условиях (стационарно, а также при выездах в учреждения).

Предлагаемые методы неспецифичны и выявляют нарушения, возникающие не только при воздействии неблагоприятных средовых факторов, но и дри патологических состояниях. Поэтому для установлении причинно-следственных связей ме^ду выявляемыми нарушениями адаптацио1 -кого статуса организма и действием средовых факторов необходимо включать в исследуемые контингенты только лиц I и П группы здоровья.

- 4

В рекомендациях приведены показатели иммунологического и биохимического статуса здоровых детей дошкольного возраста, позволяющие судить о степени варьирования их величин. В конкретных климатогеографических и эколого-г*., иенических условиях с учетом особенностей контингентов следует устанавливать свои значения параметров нормы.

ИШС 'ШОПЛЕСКИЕ МЕТОДЫ Метод определения нормальной микрофлоры и кожи

Принцип метода:    количественный и качественный

учет микроорганизмов, вырастающих на поверхностях дифференциально-диагностических питательных сред, снятых с исследуемого участка кожи способом отпечатков (модифицированный метод Н.Н.Клемпарской, 1959).

Ингредиенты и принадлежности. Среды: ?чдо, кровяной агар, желчно-солевой агар; бакпечатки (6 - одного обследуемого); пипетки на 10 мл; флакон с 0,255? раствором нашатырного спирта, стерильные ватные тампоны на палочке, карандаш по стеклу, термостат.

Ход исследования. Накануне или в день исследования бакпечатки заполняют заранее приготовленными дифференциально-диагностическими средами (по две на каждую среду). Для определения микробной обсеме-ненности поверхностного слоя кожи отпечатки делают с ладонной поверхности предплечья на три разные среды, плотно прижимая поверхность питательной среды к коже на 1-2 с.

Для определения глубокой микрофлоры с кожи этого участка через I мин после обработки тампоном, смоченным в стерильном 0,255? растворе нашатырного спирта, что усиливает секрецию желез и выход на поверхность глубокой микрофлоры, делают аналогичные отпечатки. Бакпечатки маркируют, инкубируют 18-к.О ч при 37°С, учитывают результаты.

Учет и интерпретация результатов. После инкубации на каждой бакпечатке подсчитывают общее количество колоний, выделяемых с поверхностях и глубоких слоев кожи с оценкой их диффере циально-диаг-ностических признаков. При необходимости микроорганизмы идентифицируют до вида.

Нарушение неспецифической резистентности характеризуется тремя осногчыми признаками: значительным увеличением числа микроорганизмов в биотопе, появлением у них ферментов защиты и агрессии, появлением в биотопах не свойственных им микроорганизмов, обычно пред-

- 5 -

.„мтелей кишечной флоры (например, кишечной палочки на коже).

Потенциометрический метод определения pH поверхности кожи

Принцип метода:    электродная    система    рН-метра

при контакте с увлажненной кожей развивает ЭДС, линейно зависящую от активна ^ти иоч^в водорода и температуры. Разность потенциалов переводится в pH и считывается с индикатора с точностью до 0,01.

Ингредиенты и принадлежности. Портогивный с автономным питанием pH-метр ("рН-150"), электроды ЭСЛ-45-И и ЭВЛ-1М4, нейтральный физиологический раствор хлорида натрия.

Ход исследования. Ручным компенсат^ром устанавливают температуру 25°С (до этой температуры в комнатных условиях нагреваются электроды при контакте с ^тзжей). При этом ошибка измерения pH поверхности кожи не превышает допустимой погрешности прибора +0,05. Электроды pH-метра смачивают физиологическим раствором комнатной температуры и прижимают к коже ладонной поверхности предплечья с образованием между электродами "мостика" из раствора контактной жидкости.

Учет и интерпретация реэ' тьтатов. Показания прибора снимают через минуту после начала измерения и установки постоянного pH на индикаторе прибора. Значение pH определяют в трех близлежащих точках кожи и высчитывают средний результат. Среднегрупповое значение pH кожи здоровых детей дошкольного возраста в экологически благополучных райснах составляет 5,48 ± 0,004. В условиях химического загрязнения атмосферного воздуха среднее значение pH кожи составляет 5,73 + 0,02. При повышении pH кожи возможно развитие гнойно-воспалительных заболеваний кожи и подкожной клетчатки.

Метод определения бактерицидной активности кожи (БАК)

Принцип метода:    оценка    самоочищающей    способ

ности кожи в отношении аллохтонного микроорганизма - кишечной палочки М-17 (колибактерич), искусственно наносимого на кожу (Клсмпар-ская Н,Н., 1959). При этом учитывается число вырастающих колоний в момент нанесения кишечной палочки на кожу и через заданный промежуток времени (БАК выражается в виде процента погибших микроор-ганиэмов).

- 6 -

Ингредиенты и принадлежности. Среда Эндо, бакпечатки однократного 1 рименения, пипетки на 10 мл, микропипетка, суточная бульонная культура кишечной палочки 14-17 (можно использовать коммерческий биопрепарат колибактерин), стерильный физиологический раствор хлорида натрия, стерильные ватные тампоны на палочке, карандаш по стеклу, термостат.

Ход исследования. Накануне или в день исследования в бакпечатки наливают пипеткой сред./ Эндо. На кожу ладонной поверхности предплечья ватным тампоном равномерно наносят взвесь суточной бульонной культуры кишечной палочки, разведенной I : 50 ООО физиологическим раствором (10 мл ку.гтуры на 500 мл физиологического раствора).

Сразу после нанесения бактерий и через 5 мин делают отпечатки с разнь.. мест исследуемого участка кожи. Для этого среду бакпечатки плотно прижимают к поверхности кожи на 1-2 с. Бакпечатки надписывают, инкубируют 12-18 ч при 37°С.

Учет и интерпретация результатов. Подсчитывают количество колоний кишечной палочки (малиново-красного цвета с металлическим блеском) на обеих бакпечатках и высчитывают индекс бактерицидной активности - количество (%) погибших кишечных палочек через 5 мин после нанесения микробной взвеси на кожу по формуле:

К* - Ко ИБ - ------- • 100%,

где ИБ - индекс бактерицидной активности кожи, Kj - количество колоний кишечной палочки на первой бакпечат.:е, - количество колоний кишечной палочки на второй б&.;печатке.

Иццекс бактерицидной активности нормальной кожи здоровых детей через 5 мин составляет 80-96%. В е сологически неблагополучных регионах ИБ резко изменяется. При проживании детей в условиях химического загрязнения атмосферного воздуха ИБ составляет 37-58%. В регионе с повышенным уровнем радиоактивного фона он повышается до 100%.

Цитологическое изучение состояния барьерной функции слизистой оболочки полости нося (риноцитоскогтия)

Принцип метода:    микроскопическое    исс    1едование

окрашенных отпечатков со слизистой полости но^а по составу и процентному соотношению клеточных элементов, характеризующих состояние слизистой (Колядицкая Е.А., 1947),

- 7 -

Ингредиенты и принадлежности. Предметные стекла для риноцито-скопии (пластинки из стекла 80 х 5 х 1,5 мм со шлифованными краями), тщательно вымытые и обезжиренные, фиксатор (метиловый спирт или ацетон), краска Романовского - Гимзы, микроскоп биологический иммерсионный.

Ход исследования. Под контролем зрения при помощи носового расширителя л лобного рефлектора предметное стекло осторожно вводят в носовую полость, общий носовой ход, плотно прижимают к нижней носовой раковиье, быстро извлекают. Препарат высушивают на воздухе, фиксируют 10 мин, окрашивают по Романовскому - Гимзе и микроскопн-руют.

Учет и интерпретация результатов. Основные клетки в мазках-отпечатках здорового ребенка предстар~ею палочко- и сегментноядерными ьейтрофилами и эпителиальными клетками. Оценка проводится по степени дистрофических изменений клеток (пикноэ, лизис, набухание ядер), по характеру их расположения (единичные, многочисленные, группы или пласты клеток), по виду эпителиальных клеток (плоские, мерцательные, вставочные), по наличию эозинофилов и тучных кле*ок.

Подсчет эпителиальных клеток и гранулоцитов ведется со следующим обозначением: (♦) - единичные клетки, редкие в полях зрения;

(+) - единичные клетки, частыг в пол :х зрения, редко - небольшие их группы; (++) - многочисленные отдельные клетки и часто небольшие их группы; (+++) - часто встречающиеся пласты клеток* Определяют процентное соотношение нейтрофильных гранулоцитов и эпителиальных клеток.

Норма, ьный отпечаток здорового человека: единичные поле зрения лейкоциты и эпителиальные клетки (преимущественно плоскоклеточные эпителиальные), качественная оценка клеток - (+, реже +); соотношение нейтрофилов и эпителиальных клеток соответственно 80-100% и 0-20%. Эозинофилы - единичные на весь препарат (от 0 до 5). Клетки с признаками дистрофических изменений отсутствуют либо встречаются в единичном количестве. Эозинофилы встречаются у 60% обследуемых с аллергическими ринопатиями химической этиологии. Единичные тучные клетки обнаруживаются при полинозах.

Метод определения секреторного иммуноглобулина А в слюне

Принцип метода. Взаимодействие секреторного иммуноглобулина, радиально диффундирующего из лунки в агаровый гетть.

- 8 -

с гомологичной антисывороткой приводит к образованию в местах встречи специфического преципитата в виде кольца, диаметр которого пропорционален концентрации иммуноглобулина. Его количество определяют относительно стандарта с известной концентрацией секреторного иммуноглобулина А (Манчини, 1963).

Ингредиенты и принадлежности. Исследуемый материал в виде слюны, отобранной и подготовленной по изложенному в соответствующем разделе способу, коммерческий набор для определения секреторного иммуноглобулина А (предприятие по производству бактерийных препаратов ЦНИИВС им.И.И.Мечникова), веронал, мадинал, хлорид натрия, хлорид магния, хлорид кальция, агароза (агар Дифко или любой другой аналогичного качества и степени очистки), чашки Петри разового использования, диаметром 90 мм, пробирки, пипетки на I и 5 мл, игла-пробойник диаметром 2 мм, микропкпетки (для взятия дозы 2 мкл), водяная баня, термостат, миллиметровая бумага для построения калибровочного графика, измерительная линейка фирм "Берингверке" (можно использовать штангенциркуль с точностью измерения 0,1 мм), столик с регулируемой горизонтальной поверхностью.

исследования. Ход исследования регламентирован Наставлением по применению коммерческого набора препаратов для определения секреторного иммуноглобулина А. Поэтому освещаются некоторые моменты, требующие пояснений. Рекомендуем состав мединал-вероналового буфера pH 8,6, дающий оптимальные результаты при проведении радиальной иммунодиффузии и реакции иммуноэлектрофореза: хлорид натрия - 17 г, веронал - 1,15 г, мединал - 1,75 г, хлорид кальция - 0,3 мл ^т М раствора, хлорид магния - I мл М раствора. Компоненты растворяют в 300 мл горячей дистиллированной воды, после охлаждения доводят объем раствора до 400 мл. Буфер хранят при температуре 4°С в течение месяца. В день опыта к одной части буфера добавляют 4 части дистил-лиров. .ной воды. Рабочий раствор используют в течение 12 ч. Смесь агара с преципитиругощей антис^кретсгной сывороткой можно заливать в горизонтально установленные чашки Петри разового пользования. Полистироловые чашки обладают гидрофобностью, что предупреждает подтекание испытуемого материала под пластинку агаре и не требует изготовления подложки. При постановке реакции образуются четкие зоны преципитации, не требующие дополнительного контрастного подкрашивания.

У тет и интерпретация результатов. Результат учитывается по построенной калибровочной кривой относительно стандартного препарата.

Для стандартизации расчета показателя содержания секреторного

- 9 -

иммуноглобулина рекомендуется использовать формулу:

С_х = С : Р • ^ -d²) ; (d² -d²) • (Р - 1) + 1,

где С_х - концентрация иммуноглобулина в исследуемом материале,

С - концентрация иммуноглобулина в неразведеннс сыворотке, Р - степень разведения стандартной сыворотки, ot_x * диаметр кольца преципитации исследуемого образца, d - диаметр зоны преципитации стандартной сыворотки, dp - диаметр зоны преципитации разведенной стандартной сыворотки. Исключение графического метода позволяет стандартизировать определение, повысив его надежность и точность.

Содержание секреторного иммуноглобулина А зависит от региона, где проводятся исследования. У детей дошкольнс о возраста, проживающих на юге Гомельской области, количество секреторного иммуноглобулина А с поны составляет 0,042 мг/мл, в Смоленской области (запад России) - 0,05 мг/мл, в Санкт-Петербурге - 0,06 мг/мл, на юге Астраханской области - 0,09 мг/мл. Проявляется закономерность климато-географической зависимости показателя: чем севернее и континенталь-нее регион, тем больше секреторного иммуноглобулина А в слюне. При химическом загрязнении тмосферного воздуха значение показателей разнонаправлено (повышение или понижение, сочетанное с увеличением среднегрупповьгх показателей заболеваемости ОРЗ). По данным литературы, концентрации секреторного иммуноглобулина А в слюне составляют 0,03-0,15 мг/мл.

Полуколичественный ти рационный метод определения активности лизоцима в слюне

Принцип метода заключается в Способности лизоцима растворять индикаторный микроорганизм микрококк (/Micrococcus ^sodeaticus * 26Г5). Активность лизоцима выражают его титром - наибольшим разведением, вызывающим лизис тест-культуры (Алексеева О.Г. Клемпарская Н.Н., 1959).

Ингредиенты и принадлежности. Исследуемая жидкость (слюна),

0,1 М фосфатный бу*ер, pH 6,2, приготовлений на 0,5& р^ствопа хлористого натрия (ФБР), суточная агаровая культура микрококка (или ацетонш лй порошок культуры), оптический стандарт мут юсти на ТО ед., пробирки бактериологические, пипетки на I и 5 мл, штативы, термостат.

Вместо культуры микрококка можно использовать коммерческий или самостоятельно приготовленный ацетоновый порошок. Для этого кулы,>-

1

Санкт-Петербургская государственная медиц тская академия им.И.И.Мечнике па

2

95067, Сснкт-Петербурт", Пискаревский пр., 47 Типография ТОО ’’Доверие"