ЭКСЛРЕСС-МЕГОД ОЦЕНКИ ОНЦЕТОКСНЧЕСКОГО И КОЖНОРАЗДРАЖАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ПАРФЮМЕРНО-КОСМЕТИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ IN УТЛЮ (НА КУЛЬТУРЕ ПОДВИЖНЫХ КЛЕТОК)
Mcnamtaam .......ими»
Мширш Росам
МОСКВА
«УТВЕРЖДАЮ»
Заместитель главного государственного санитарного врача Российской Федерации
Е.Н.Беляев
<?/- я/,
1.2. Гигиена, токсикология, санитария
ЭКСПРЕСС-МЕТОД ОЦЕНКИ ОБЩЕТОКСИЧЕСКОГО И КОЖНОРАЗДРАЖАЮЩЕЮ ДЕЙСТВИЯ ПАРФЮМЕРНО-КОСМЕТИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ IN VITRO (НА КУЛЬТУРЕ ПОДВИЖНЫХ КЛЕТОК).
Методические рекомендации
Разработаны НИИ медицины труда РАМН (Измерова Н.И., Мигукина Н.В., Мальцева НМ., Петрова Л.П., Котова Л.Г.), Всероссийским научно-исследовательским и испытательным институтом медицинской техники Минздрава РФ (Еськов А.П.), Акционерным обществом «БМК-Инвест» (Каюмов Р.И.), Центром госсанэпиднадзора в г.Москве (Завьялов Н.В.).
Методические рекомендации одобрены Лабораторным советом Госсанэпидслужбы России (протокол № 1 от 22.01.2002г.)
Содержание
1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
2. ОПИСАНИЕ МЕТОДА
3. ОБОРУДОВАНИЕ, ХИМИЧЕСКАЯ ПОСУДА И РЕАКТИВЫ
4. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЙ
5. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИСПЫТАНИЙ
1.Область применения
Методические рекомендации содержат описание метода тестирования парфюмерно-косметической (ПК) продукции с применением кратковременной суспензионной культуры подвижных клеток (сперматозоидов быка) и определяют порядок проведения испытаний следующих видов ПК продукции: жидкие моющие средства, дезодоранты и дешшягории в аэрозольной упаковке, туалетная и парфюмированная вода, духи, одеколон, спиртосодержащие лосьоны
Методические рекомендации предназначены для скрининговой оценки вновь разрабатываемой и серийно выпускаемой ПК продукции с учетом общетоксического и кожно-раздражающего действия.
Методика может быть применена в качестве самостоятельного экспресс-метода или в сочетании с другими токсиколого-гигиеническими методами.
Методические рекомендации предназначены для учреждений научно-исследовательского и практического профиля, осуществляющих разработку новых видов ПК продукции и контроль сс качества
2.0писание метода.
В качестве тест-объекта используется сперма крупного рогатого скота, замороженная в парах жидкого азота Г ранулы замороженной бычьей спермы получают на станциях искусственного осеменения и хранят в сосудах Дьюара, наполненных жидким азотом.
Критерием токсического действия является изменение двигательной активности сперматозоидов под воздействием химических соединений, содержащихся в экстрактах ПИТ продукции, по сравнению с таковой для пробы с раствором, не содержащей токсических веществ. Изменение двигательной активности измеряется показателем подвижности «т» и регистрируется шггомапт*
5
чески анализатором токсичности по изменению интенсивности светового потока при движении
сперматозоидов через оптический зонд.
т -d Cn -V, где d - постоянный коэффициент,
Сп - концентрация подвижных клеток,
V - средний модуль скорости клеток Количественная оценка параметра тест-реакции выражается индексом токсичности «I t», представляющего собой отношение суммарной двигательной активности сперматозоидов опытно? и контрольной проб, выраженное в процентах Величина индекса токсичности, гарантирующая безопасность ПК изделий, находится в интервале от 70 до 120% Сравнительная оценка результатов исследования общей токсичности и кожно-раздражающего действия ПК изделий в эксперименте на лабораторных животных и их различных разведений на культуре сперматозоидов послужила основанием для выбора эталонных разведений перечисленных ранее групп ПК из дели! с учетом допустимого интервала индекса токсичности
З.Оборудование, химическая посуда и реактивы
3.1 Анализатор токсичности АТ-4
3.2. Сосуд Дьюара типа СДС, объемом не менее 25 л и диаметром горла не менее 50 мм
3 3 .Термостат типа ТС-80М-2 (25-80°С).
3.4.Весы аналитические с погрешностью взвешивания не более 1мг, ГОСТ 24104-88
3.5 Пробирки с притертыми пробками объемом 3-5 мл - 10 шт, ГОСТ 1770-74,
3.6. Дозаторы пипеточные на объемы 0,5 мл, 0,2 мл и 0,1 мл, ТУ 2Т2.993.053,
3.7 Мерные колбы с притертыми пробками объемом 50 мл - 2 шт., ГОСТ 1770-74.
3.6 Пинцет анатомический длиной 250 мм
3.7Глюкоза ч.. ГОСТ 6038-74.
3.8 Цитрат натрия трехзамещенный ч , ГОСТ 22280 -76
3 9 Сперма быка, замороженная в жидком азоте, ГОСТ 26030-83 3.10 Фильтры АФА-ВП-10. ТУ 95-743-80
4.Провсдение испытаний
4.1 .Приготовление экстрактов из образцов ПК продукции
4.1.1. Экстракты из испытуемых образцов готовят путем настаивания в дистиллирошишой воде Соотношения веса образца и объема модельной среды (дистиллированной воды), а также продолжительность экстракции приведены в таблице 1 Навески ПК продукции взвешивают в сухой чистой колбе, куда затем добавляют требуемый объем модельной среды. В другую колбу наливают модельную среду и обе колбы помещают в термостат на 24 часа при температуре +37°С После окончания экстракции растворы охлаждают до комнатной температуры
Таблица 1
Условия приготовления экстрактов |
Вид ПК продукции |
Масса
образца,
г |
Объем модельной среды, мл |
Степень разведения образца |
Продолжительность экстракции, час |
Шампуни для волос и тела |
0.1 |
250 |
1:2500 |
24 |
Жидкое туалетное мыло |
0.1 |
250 |
1:2500 |
24 |
Пена для ванн, гель _аля_душа__ |
0,1 |
250 |
1:2500 |
24 |
Дезодоранты и дели-ляггории в аэрозольной упаковке |
1.0 |
300 |
1:300 |
1 |
Туалетная и парфю-мированная вода, духи. одеколон, спиртосодержащие лосьоны |
1.0 |
700 |
1:700 |
1 |
|
4.1.2. После завершения экстракции экстракт подвергают фильтрации через бумажный фильтр с целью удаления взвешенных частиц Фильтрованию подвергают также и модельную сро-ДУ
7
4.1.3. В качестве фильтра используют бумажный филыр АФЛ-ВП-10 диаметром 9 см. Бу мажные фильтры должны быть заранее промыты и просушены Для этого предварительно до экс перимента 10 бумажных фильтров опускают в большой стакан, заполненный 1,5 дистиллированной воды. Стакан накрывают стеклянной пластинкой и ставят в термостат на 24 ча са при температуре +37 С. Затем дистиллированную воду выливают, а стакан с мокрыми фильтр* ми ставят обратно в термостат с целью высушивания фильтров до постоянной массы Достижсн» постоянной массы контролируют взвешиванием каждого фильтра на аналитических весах.
4 1 4.После фильтрования из модельной среды и экстрактов готовит изотонические раствор» добавляя в них сухие реактивы глюкозы и цитрата натрия (глюкоза - 4г, цитрат натрия - 1 фильтрат- 100мл).
4 2. Проведение измерений Для определения индекса токсичности изотонического фильтрата экстракта, далее опытн< го раствора, необходимо сравнить его с изотоническим фильтратом модельной среды,.
4 2 1 Контрольный и опытный изотонические экстракты не менее, чем за час до начала эк> перимента по 0,4 мл помещают в пробирки с притертыми пробками и ставят в водяную баню щ температуре (40±1,5)*С.
4.2.2 Приготовление раствора спермы. Оттаивают замороженную сперму в разбавителе С став разбавителя глюкоза - 4 г, цитрат натрия - 1 г, дистиллированная вода - 100 мл. В чисту сухую пробирку наливают 0,4 мл разбавителя и ставят в водный термостат при температур (40±1,5)*С. Охлажденным до температуры жидкого азота анатомическим пинцетом извлекают i сосуда Дьюара гранулу спермы и быстро опускают в нагретый раствор
4.2.3 Приготовление тест-системы. В каждую пробирку с модельной средой и опытным эк фактом из ПК изделия приливают по 0,1 мл раствора спермы. Полученную смесь экстрактов спермы из каждой пробирки переносят в капилляры (минимум по 5 на один образец) и усганавл вают в каретку прибора. Проводят измерения согласно инструкции к прибору
4.3.Математическая обработка результатов измерений.
Обработку экспериментальных данных осуществляют вручную или с помощью компьюте-i по прилагаемой к анализатору токсичности программе
Для каждого образца вычисляют суммарную двигательную активность S
S = Zm<>
I
где mi - значение показателя подвижности
Для контрольной и опытной выборок образцов вычисляют среднее арифметическое значение среднеквадратичное отклонение, по которым в свою очередь вычисляют для каждой выборки оэффициент варивши С:
С
С = -100%, х
где 5 - среднеквадратичное отклонение, х - среднее арифметическое значение В случае получения значения коэффициента вариации более 15% хотя бы для одной из выборок, эксперимент повторяют, начиная с 4.1 Если значения коэффициентов вариации для каждой из выборок меньше или равно 15%, то результаты считают пригодными для статистической обработки Затем вычисляют величину индекса токсичности /,':
А#9М>
i;=—,—ioo%
I от щ>
где и S^omm' - величины суммарной двигательной активности сперматозоидов, ус
редненные по нескольким соответственно опытным и контрольным образцам.
З.Опенка результатов испытаний
Оценка результатов испытаний осуществляется путем сравнения полученных значений индексов токсичности для исследованных образцов и допустимого интервала индекса токсичности Индекс токсичности от 70% до 120% указывает на то, что испытуемый образец относится к 4
классу малоопасных соединений согласно классификации ГОСТ 12.1.007-76, и нс обладает кожнораздражающим действием при соблюдении условий применения согласно этикетке Образец направляется на проведение клинических испытаний на людях-добровольцах.
Во всех остальных случаях результаты свидетельствуют о несоответствии требованиям безопасности, предъявляемым к ПК-продукции В этой ситуации испытанный образец может быть подвергнут расширенным санитар но-химическим и токсикологическим исследованиям.