МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ГЛАВНОЕ САНЭПИДУПРАВЛЕНИЕ
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЛЕРГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ К ИСПОЛЬЗОВАНИЮ В СТРОИТЕЛЬСТВЕ ЖИЛЫХ И ОБЩЕСТВЕННЫХ ЗДАНИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
МОСКВА 1978 г.
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ГЛАВНОЕ САНЭПИДУПРАВЛЕНИЕ
УТВЕРЖДАЮ
Заместитель Главного государственного санитарного врача СССР
В. Е. Ковшило « 8 » декабря 1977 года J* 1806-77
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЛЕРГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ К ИСПОЛЬЗОВАНИЮ В СТРОИТЕЛЬСТВЕ ЖИЛЫХ И ОБЩЕСТВЕННЫХ ЗДАНИЙ
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
МОСКВА 1978 г.
Методические рекомендации
составлены кандидатом медицинских наук Г. П. Трубицкой под редакцией профессора А. Н. Бокова и профессора А. И. Поляка
В методических рекомендациях описан разработанный на кафедре коммунальной гигиены РГМИ совместно с отделом иммунитета и аллергии ЦНИЛ способ определения аллергенной активности полимерных материалов, используемых в строительстве жилых и общественных зданий. Подробно изложены специфические методы аллергодиагностики in vitro и in vivo, рекомендуемые для выявления сенсибилизации организма.
Данные методические рекомендации направлены не столько на диагностику развившейся аллергической реакции, сколько на выявление наличия и степени сенсибилизации организма, как основного фактора, определяющего опасность развития явных аллергических реакций в ответ на воздействие комплексов химических веществ, мигрирующих из полимерных строительных материалов.
Методические рекомендации предназначаются для специалистов токсиколого-гигиенических лабораторий и практических врачей.
Бурное развитие промышленности, в том числе химической, широкая химизация народного хозяйства и быта неизбежно приводит к проникновению в среду обитания человека огромного числа различных химических веществ, многие из которых обладают аллергенными свойствами, с чем все чаще связывают рост числа случаев аллергических реакций и заболеваний (А. Д. Адо, О. Г. Алексеева, 1969; Е. С. Брусиловский, 1972; С. Я Чикин и соавт., 1973).
В связи с растущими масштабами развития химической промышленности стала очевидной необходимость получения сведений о роли полимерных материалов, используемых в строительстве и быту, как фактора аллергизации организма. Отсутствие в литературе сведений о факторе сенсибилизации, связанном с ингаляционным воздействием сложных комплексов химических веществ, поступающих в организм в концентрациях и режиме, характерных для эксплуатации жилых и общественных зданий сделало необходимым разработку методических подходов по изучению аллергенного эффекта полимерных материалов, чему и посвящены настоящие методические разработки.
Изучение аллергенной активности полимерных материалов в принципе возможно как в натурных, так и в моделированных условиях.
Данные, полученные в натурных наблюдениях, отображают то положение, которое имеет место в практических условиях. Особено ценно то, что подобные наблюдения осуществляются непосредственно на людях.
Однако наблюдения в натурных условиях, чаще при одновременном контакте сразу с несколькими полимерными материалами, а возможно влиянии и других неучтенных источников, не позволяют оценить сенсибилизирующее действие каждого из полимерных материалов в отдельности. Особен-
2. Зек. 2
но трудно приспособить натурные условия для проведения исследований, связанных с разработкой новых полимерных строительных материалов в связи с необходимостью апробации многих опытных образцов.
Отличительной особенностью изучения аллергенного эффекта полимерных материалов в моделированных условиях является возможность изучения как отдельных образцов, так и всевозможных сочетаний материалов на экспериментальных животных с последующей экстраполяцией полученных результатов на человека.
I. ИЗУЧЕНИЕ АЛЛЕРГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ В НАТУРНЫХ УСЛОВИЯХ
1.1. Подбор объектов исследования
Обитаемый объект «опыт» (жилой дом, квартира, лечебное или детское учреждение, общественное здание, учреждение торговой сети и лр.) подбирается из числа зданий, выстроенных с использованием тех или иных полимерных материалов; при этом принимается во внимание наличие и полимерной мебели.
Объект «контроль», также обитаемый, подбирается аналогичным но назначению, внутренней планировке, месту расположения в черте населенного пункта и прочим условиям. В объекте «контроль» не должно иметь места использование полимерных строительных материалов, в том числе и полимерной мебели.
1.2. Аллергологический анамнез
Выявляется анамнез как собственный (наличие аллергических проявлений в прошлом), так и семейный (наличии аллергических реакций и заболеваний у родственников по нисходящей, восходящей и боковым линиям). Особое внимание должно быть уделено выяснению контакта с химическими веществами и полимерными материалами.
1.3. Санитарно-химический контроль за состоянием воздушной среды
Приступая к санитарно-химическому исследованию в объекте «опыт», необходимо хорошо ознакомиться с рецептурой и
4
технологией изготовления использованных полимерных материалов, что позволяет выяснить перечень веществ, могущих мигрировать из него в воздушную среду. Целесообразно определять вещества наиболее летучие и обладающие аллергенным действием. Количество анализов на каждое вещество следует принимать таким, чтобы в зависимости от разброса данных можно было бы получить достоверные результаты; обычно требуется выполнение 6—12 анализов. При отрицательных результатах достаточно 3—4 анализов.
Одновременно санитарно-химическое исследование состояния воздушной среды осуществляется и в объекте «контроль» с определением тех же веществ, что и в объекте «опыт».
1.4. Выявление аллергизации организма
Для выявления наличия и степени аллергизации организма, обусловленной контактом с химическими веществами, поступающими ингаляционным путем, следует использовать специфические методы аллергодиагностнки с аллергенами in vitro. Для определения антител гуморальных — реакцию пассивной гем агглютинации (РПГА по О. Г. Алексеевой с соавт., 1971), клеточных — реакцию специфической агломерации лейкоцитов (РСАЛ ло И. Е. Сосонкину, 1968), реакцию усиления пиронинофилии лейкоцитов (РУПЛ по А. М. Фиалковскому, 1974) или другие наиболее чувствительные и воспроизводимые реакции. Все указанные реакции (РПГА, РУПЛ и РСАЛ) в клинических условиях могут быть поставлены в любой период заболевания как при явных клинических проявлениях, так и для выявления латентной стадии химических аллергозов.
Для суждения о сенсибилизирующем воздействии газовоздушной смеси, обусловленной использованием полимерных строительных материалов, при постановке указанных или других специфических реакций in vitro целесообразнее использовать весь комплекс водорастворимых веществ, могущих мигрировать из материалов (см. раздел 6 — Приготовление аллергенов, стр. 15).
2. ИЗУЧЕНИЕ АЛЛЕРГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ В МОДЕЛИРОВАННЫХ УСЛОВИЯХ
Для определения аллергенного эффекта полимерных строительных материалов в моделированных условиях раз-
5
работай способ (А. Н. Боков, Г. П. Трубицкая, 1975), кото, рый характеризуется следующими положениями:
— получение в экспериментальных условиях воздуха, с качественными и количественными характеристиками химического загрязнения, которые в достаточной стз 1епя коррелируют с натурными условиями эксплуатации материала:
— изучение сенсибилизирующего действия химических веществ, мигрирующих в воздушную среду из полимерных строительных материалов, в эксперименте на морских свинках;
— режим затравки — ингаляционный круглосуточный непрерывный;
— продолжительность затравки — 30 суток;
— сроки тестирования — на 14 и 30 сутки;
— методы аллергодиагностики — специфические с гапте-нами in vitro и in vivo.
Широкие возможности в реализации основных положений этого способа открывает использование методики исследования полимерных строительных материалов в моделированных условиях (А. М. Боков, 1968) и предназначенной первоначально для изучения общетоксического действия их, которая позволяет:
— моделировать любые условия эксплуатации полимерных материалов;
— создавать любые режимы затравки и при необходимости варьировать их;
— изучать сенсибилизирующее действие как отдельных образцов, так и всевозможных сочетаний материалов, а также многослойных конструкций и т. д.
Сущность указанной методики заключается в моделировании ожидаемых условий эксплуатации материала в специальных камерах — генераторах. К числу моделируемых факторов относятся температура воздуха, кратность воздухообмена, насыщенность помещений полимерным материалом, при необходимости — влажностный режим и другие условия.
Наружный воздух после очистки при помощи специальной воздуходувной системы с необходимой объемной скоростью подается круглосуточно во все опытные и контрольные камеры-генераторы, температурный режим создается и поддерживается при помощи вложенных в обшивке камер-генераторов нагревательных элементов, терморегуляторов и магнитных пускателей; размер образца устанавливается в каждом случае в зависимости от ожидаемой насыщенности в
6
условиях эксплуатации материала и объема камеры-генератора. Последний регламентируется спецификой этапов исследования и должен быть не менее 100—200 л при осуществлении санитарно-химических исследований, 1000—1200 л — при проведении биологических исследований, в том числе при изучении сенсбилизирующего действия на организм полимерных строительных материалов. В процессе аллергологчческих исследований воздух из камер-генераторов подается в затравочные камеры объемом 100 л.
2.1. Условия эксперимента
Насыщенность, кратность воздухообмена, температура и пр. создаются в камерах-генераторах в зависимости от предполагаемого назначения и области применения материалов. Подопытным животным воздух подается из камер-генера торов объемом 1000 л, содержащих полимерные материалы, контрольным — из таких же камер-генераторов, но не содержащих материалов.
2.2. Санитарно-химический контроль за состоянием воздушной среды
На протяжении всего периода эксперимента осуществляется санитарно-химический контроль состава воздушной среды как в опытных, так и контрольных камерах-генераторах. Выбор определяемых веществ и установление количества анализов см. п. 1.3.
2.3. Выявление аллергизации организма
Наш опыт изучения более 20 различных наиболее распространенных полимерных строительных материалов в натурных и моделированных условиях позволяет рекомендовать для выявления сенсибилизации организма, обусловленной использованием полимерных материалов, методы специфической аллергодиагностики с гаптенами in vitro ((например, РПГА, РУПЛ, РСАЛ) и in vivo (лишь в условиях эксперимента) — конъюнктивальный тест (Г. П. Трубицкая, 1977). Упитывая, что сенсибилизация организма под воздействием химических соединений, мигрирующих из полимерных строительных материалов, индуцируется преимущественно по замедленному типу, для экспресс диагностики можно использо-
7
вать лишь клеточные реакции с гаптенами in vitro и, в частности, как наиболее чувствительную из числа использованных нами — РУПЛ по А. М. Фиалковскому (1974).
При этом следует учитывать, что кожные пробы не при любых количественных и качественных характеристиках химических загрязнителей, мигрирующих из полимерных строительных материалов, дают информативные результаты, в связи с чем кожно-аллергические реакции могут использоваться лишь в комплексе с рекомендуемыми нами методами аллергодиагностики.
Ниже приводится подробное описание методов, рекомендуемых для выявления сенсибилизации организма, индуцированной химическими веществами при ингаляционном поступлении их в организм.
В приложении указан перечень и других методов аллергодиагностики, довольно часто используемых гигиенистами в процессе иммунологических исследований.
3. РЕАКЦИЯ УСИЛЕНИЯ ПИРОНИНОФИЛИИ ЛЕЙКОЦИТОВ ПО А. М. ФИАЛКОВСКОМУ
Принцип предложенного А. М. Фиалковоким (1974) метода — РУПЛ состоит в определении разницы содержания РЫК по (Brachet, 1940) в мазках крови, предварительно обработанной и необработанной предполагаемым аллергеном.
ТЕХНИКА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ
3.1. Препарат «опыт»
В парафинированную пробирку вносят 0,1 мл крови испытуемого, 0,1 мл аллергена и помещают в термостат при 37°С на 2 часа, периодически (через каждые 30 мин) слегка встряхивая. Затем готовят тонкий мазок, фиксируют его безводным этиловым спиртом (1—2 капли на мазок), а затем в жидкости Карнуа (10 мин), проводят через спирт (1—Змнн), промывают в дистиллированной воде (2—3 смены ), окрашивают краской метилгрюнпнронин (10—20 мин), которую смывают дистиллированной водой (15 сек), хорошо сушат фильтровальной бумагой.
3.2. Препарат «контрол ь лейкоцитов»
В парафинированную пробирку вносят 0,1 мл крови испы-
8
туемого и 0,1 мл 3,8% раствора цитрата натрия. Остальное см. «препарат опыт».
3.3. Препарат «контроль аллергена»
В парафинированную пробирку вносят 0,1 мл крови интактного животного и 0,1 мл аллергена. Остальное как и в препарате «опыт».
3.4. Препарат «контроль окрашивания»
В парафинированную пробирку вносят 0,1 мл крови испытуемого и 0,1 мл аллергена. Помещают ее в термостат при 37°С на 2 часа. Готовят мазок, помещают его в раствор ри-бонуклеазы на 30 мин (в термостат при 37°С), тщательно промывают дистиллированной водой, окрашивают мегилгрюн-1гиронином (10—20 мин) и быстро споласкивают дистиллированной водой. В данном препарате РНК отсутствовала.
3.5. Оценка результатов
В препаратах «опыт», «контроль лейкоцитов» и «контроль аллергена» содержание РНК оценивалось (в условных единицах на одну клетку) под микроскопом (увеличение 10x40) визуальным полуколичествснным методом по формуле 1:
где N—содержание РНК (в условных единицах
на одну клетку); а = 3, в=2, с = 1—условные баллы интенсивности окраски, соответственно малиновое, красное и розовое окрашивание цитоплазмы и ядрышек (ядро окрашено в зеленый цвет); х, у и z — количество клеток с соответствующей интенсивностью окраски;
100 —общее число подсчитанных клеток.
Ошибка измерения содержания РНК в клетках описанным способом составляет ±10%.
Тест считается положительным, если содержание РНК в опыте (в условных единицах на 1 клетку) превышало таковое в контроле лейкоцитов и аллергена более, чем на 10%. От 11 до 20%—реакция слабо положительная (+), от 21 до 30%—реакция положительная (++), свыше 30%—реакция резко положительная (+++).
9
