ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОКАДАИКОВОЙ КИСЛОТЫ В МОЛЛЮСКАХ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ «DSP-Check», производства фирмы Panipharm Laboratories Со., Ltd, Япония

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ №01.016-07

2

Экспресс-определение окаланконой кислоты в моллюсках с помощью тест-системы «DSP-Check», производства фирмы Parapharm Laboratories Со., Ltd, Япония. Методические рекомендации -    М.:    ФГУЗ    Федеральный    центр    гигиены    и    эпидемиологии

Роспотребнадзора, 2007. -14 с.

1.    Методические рекомеплацин разработаны:

ГУ НИИ питания РАМН (академик РАМН, профессор В.А Тутелыш, д.м.н., профессор С.А. Хотимченко, Ю.А. Коханова), Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора ( И.В. Брагина , Е.С.Шальнова , Л.С. Осипова ) , ООО «Стайляб» (А.В. Г алкил).

2.    Рекомендованы к утверждению Лабораторпътм советом Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ( протокол от 28 мая 2007 г.)

3.    Утверждены и введелм в действие Председателем Лабораторпого совета Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека , Главным врачом ФГУЗ « Фсдералытый центр гигиены и эпидемиологии » Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека А.И. Верещагиным 15 июня 2007 г.

4.    Введены впервые.

3

9.3.    Приготовление раствора конъюгата. В пустом флаконе [2] + [6J смешайте 50 мкл конъюгированных антител к о калаи ко вой кислоте [2] и 5 см⁵ моющего буфера [6] (разведение конъюгата 1:100).

9.4.    Приготовление раствора хромогена. В пустом флаконе [3J + [4] сметайте 50 мкл хромог ена [4] и 5 см³ субстрата [3] (смесь 1:100). Г отовый раствор хромогена следует поместить в темный бокс.

ПРИМЕЧАНИЕ: Готовые растворы необходимо израсходовать в одно и тоже

время.

9.5.    Проведение измерений

9.5.1.    Извлекают из фольгированного пакета необходимое количество лунок - по одной лунке на каждую пробу. Помещают лунки в рамку.

9.5.2.    Оставшиеся лунки немедленно упаковывают в фолынроваииый макет и помещают на хранение при 4 °С.

9.5.3.    Наносят координаты лупок, предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов па разграфленную бумагу.

9.5.4.    Помечают лунки, чтобы идентифицировать их после промывки.

9.5.5.    Осторожно, не допуская вспенивания, перемешивают реагенты во флаконах.

9.5.6.    Перед шшетнрованием смачивают каждый свежий наконечник пипетки дозируемым раствором (набирают и выпускают раствор).

9.5.7.    Используя разовые микрогшпетки, вносят по 50 мкл стандартных растворов окадаиковой кислоты (10 мкг/ дм³ и 100 мкг/ дм³) и исследуемых растворов, приготовленных по п. 9.2, в лунки стрипа. Каждый раствор вносится новой микропяпеткой.

9.5.8.    Немедленно вносит по одной калле (50 мкл) готового раствора коньюгата ((2] + [6J) в каждую лунку.

9.5.9.    Инкубируют стрипы в течение 10 минут при комнатной температуре (20-25°С). Во время икубации рекомендуется перемешивать растворы в лунках стрипов, перемещая стрипы быстрыми возвратно-поступательными движениями по поверхности стола. После использования трижды промывают флакон (2] + [б] дистиллированной водой.

9.5.10.    Пылнвают жидкость из лунок в раковину, выбивают капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем энергичного постукивания стрипами по столу, накрытому чистой фильтровальной бумагой.

12

9.5.11.    Наполняют лунки моющим буферным раствором [6]. Выливают жидкость из лунок, выбивают стрипы, как описано выше. Повторяют процедуру промывки лунок еще три раза.

9.5.12.    Добавляют по одной капле (50 мкл) смешанного раствора хромогена ([3] + [4]) в каждую лунку.

9.5.13.    Инкубируют при комнатной температуре в течение 6 минут в темноте. После использования трижды промывают флакон [3] + [4J дистиллированной водой.

9.5.14.    Добавляют но одной калле (50 мкл) стоп-раствора ([5]) в каждую лунку.

9.5.15.    Осторожно перемешивают вручную, быстро перемещая стрипы возвратяо-поступательыыми движениями по поверхности стола.

9.5.16.    Через три минуты после остановки реакции сравнивают окраску в лупках со стандартными и исследуемыми растворами (чем выше концентрация окадаиковой кислоты, тем бледнее окраска в лунках).

9.5.17.    С помощью планшетного фотометра измеряют оптические плотности растворов в лунках стрипов при 450 нм.

10. Обработка результатов измерения

Постройте калибровку в полулогарифмической системе координат, по абсциссе откладывая концентрацию окадаиковой кислоты в стандартных растворах, а по ординате оптическую плотность растворов, измеренную при 450 нм. С помощью калибровочной кривой найдите концентрацию окадаиковой кислоты в исследуемых растворах по их оптической плотности.

Предел обнаружения и диапазон измерения окадаиковой кислоты в экстрактах с помощью набора DSP-Check составляет соответственно 10 мкг/ дм³ я 10-100 мхг/ дм³ по калибровочной кривой.

Внимание: при выполнении исследования по настоящей методике концентрация окадаиковой кислоты в растворе 10 мкг/ дм³ соответствует 100 мкг/кг окадаиковой кислоты в пробе моллюска (разбавление при экстракции 1:5, далее супернатанты разбавляются еще вдвое). Также, найденная концентрация 100 мкг/ дм³ окадаиковой кислоты в растворе соответствует 1 мг/кг окадаиковой кислоты в пробе моллюска.

Пример исследования шести образцов (Ст. - стандарты, Пр. - пробы).

j Стрип 1 А В С D Е F 0 Н Ст. 1 __— Сх.2 Пр. 1 Пр. 2 Пр.З Пр.4 — Пр.5 — Пр.6 _1_

в пробе:    100    мкг/кг    !    мг/кг 13

Для вычисления концентрации окадаиковой кислоты (ОК) в пробах mojuhockob необходимо использовать следующую формулу:

(концентрация ОК в пробе, мхг/кг) = (концентрация ОК по калибровке, мкг/ дм³) X (объем экстрагента, см³) X 2 / (вес пробы, г)

Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется использовать специализированное программное обеспечение, например, RIDA® SOFT. При компьютерной обработке результатов следует руководствоваться инструкцией по использованию программного обеспечения и рекомендациями разработчика.

14

СОДЕРЖАНИЕ

1.    Назначение и область примепсиня

2.    Общие положения

3.    Принцип метода

4.    Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

5.    Требования безопасности

6.    Требования к квалификации персонала

7.    Условия измерений

8.    Подготовка к проведению анализа

9.    Выполнение измерении

10.    Обработка результатов измерения

УТВЕРЖДАЮ

Главный врач ФГУЗ «Федеральный центр гшнены d эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Председатель Лабораторного совета Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей н

Верещагин « 15 » нюня 2007 г

ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОКАДАИКОВОЙ КИСЛОТЫ В МОЛЛЮСКАХ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ «DSP-Check», производства фирмы РягярЬагш Laboratories Со., Ltd, Япония

МР№ 01.016-07

1. Назначение н область применения

Настоящие методические рекомендации устанавливают методику экспресс-опредслсния содержания окалаиковой кислоты в моллюсках метолом иммуноферментиого анализа.

Диапазон определяемых концентраций составляет 100 - 1000 мкг/кг.

2. Общие положения

Фикотоксины представляют собой группу веществ, продуцируемых некоторыми видами водорослей, микроводорослей и цианобактерий. Эти вещества способны аккумулироваться в организме морских и пресноводных животных и, при попадании в организм человека, вызывать отравления различной степени тяжести.

Фикотоксины, входящие в группу DSP (diarrhoeic shellfish poison - днарейный яд моллюсков), получили свое название по синдрому вызываемого ими отравления. К дапной группе относятся окадаиковая кислота и се производные-динофизистоксины.

Синдром отравления DSP-токсинами широко распространен. Особо часто сезонные вспышки происходят в Европе и Японии, однако случаи отравления DSP отмечаются и в Америке, Южной Африке, Новой Зеландии, Австралии и Таиланде. В ряде стран DSP токсины нередко обнаруживаются в моллюсках при исследованиях, проводимых в рамках программ мониторинга

Основной механизм действия окадаиковой кислоты заключается в ингибировании ссрин/треонин фосфатазы 1 и 2А я опосредованном потенцировании действия серин-треонин киназ. Это приводит к избыточному накоплению фосфорилированных белков и нарушению многих процессов, протекающих в клетке. Кроме того, охадаиковая кислота является мощным стимулятором развития опухолевых процессов.

Основными симптомами при отравлении окадаиковой кислотой являются диарея, тошнота, рвота, боли в животе. Они развиваются через 30 мни - несколько часов после употребления контамшгпрованиых моллюсков. Продолжительность этого периода обычно педолгая - в тяжелых случаях до нескольких дней. Однако при хронической интоксикации возможно развитие опухолевых процессов.

Безопасный уровень содержания DSP токсинов в тканях двустворчатых моллюсков был установлен Европейским Союзом в 2002 году для окадаиковой кислоты, дииофизистоксинов и netcrcuoTOKCifflOB в сумме не более 160 мкг/кг эквивалента окадаиковой кислоты.

В последнее время в целях скрининга за рубежом в рутинной лабораторной практике ишроко применяется метод иммуноферментного анализа (ИФА).

Наборы «DSP-Check» представляют собой тест-системы для иммуноферментного анализа в комплекте с необходимыми реагентами, выпускаются серийно и предназначены для экспресс-определения окадаиковой кислоты в моллюсках.

3. Принцип метода

Принцип работы тест-системы «DSP-Check» основан на методе конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА). В основе процедуры анализа дожит взаимодействие антигенов с антителами. Поставляемый в комплекте набора планшет сенсибилизирован окадаиковой кислотой.

Анализ выполняется следующим образом. Исследуемые (стандартные) образцы, препарат, содержащий антитела к окадаиковой кислоте, конъюгированные с ферментом, дозируются в лунки планшега. При инкубации плалшета в течение определенного времени молекулы окадаиковой кислоты в объеме раствора и на поверхности планшета,

конкурируя между собой, взаимодействуют с конъюгированными антителами к окадаиковой кислоте. В процессе конкуренции происходит иммуносорбция антител к окадаиковой    кислоте на    поверхности планшета, степень которой обратно

пропорциональна концентрации токсипп в объеме раствора.

Далее, путем промывки планшета, из лунок удаляются несвязанные конъюгированные антитела к окадаиковой кислоте.

I (осле промывки планшета в его лунки дозируется смесь субстрата с хромогеном. В процессе инкубации, при химическом взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы конъюгата, связанной на поверхности лунки, выступает в качестве катализатора, образуются окрашенные продукты реакции. После определенного времени развития данной цветной реакции, в результате которой хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент, при этом голубой цвет раствора меняется на желтый.

Оптическая плотность в лунках, измеренная на планшетном фотометре при 450 нм, обратно пропорциональна концентрации окадаиковой кислоты в исследуемых образцах.

4. Средства измерений, нспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений концентрации окадаиковой кислоты применяются следующие средства измерения, реактивы, вспомогательные устройства и материалы.

4.1 Средства измерений

Спектрофотометр для ИФЛ (ридер) с фильтром 450 нм;

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса

точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г    ГОСТ    24104

Одноканальные автоматические пинетки, объем дозирования 50 мкл

8-канальные автоматические пипетки на 250 мкл;

Цилиндры градуированные 2-го класса точности

вместимостью 50 см⁵ и 100 см³

Колбы мерные 2-го класса точности вместимостью 50 и 100 см³ Пипетка градуированная 2-го класса точности вместимостью 5 см³

4.2 Реактивы

Тест-система «DSP-Chcck» для иммуноферментного анализа в стандартной

комплектации, включая:

7

Миктюттровальиди планшет (3 стрюгов по 8 лунок), докрытый окадаиковой кислотой - 2 птг;

Конгыопп антител к окадэдковой кислоте с пероксидазой» конц.

Пустой флакон для разведения конъюгата [2] + £6]

Суё£грат,15мл

Храмогеа

Пустой флакон для смешивания субстрата с хромогеном 13] + [4]

Стон-раЕрюр

Стандарт окадаиковой каслоты Ха 1 . на 10 мкг/ дм³ Ошшшрт окадаиковой кислоты № 2. на 100 шег/ дм³ Разовые микропипетки

Инструкцию по использованию тест-снстсмы на русском и английском языках.

Метанол ч.д.а.

Днстиллироваипая или деионазнровапная вода

4.3    Вспомогательные устройства и материалы Гомогенизатор для измельчения моллюсков Центрифуга напольная Воронка стеклянная Впалы темного стекла объемом 2 см³ Пробирки центрифужные объемом 10 см³

Наконечники для автоматических пипеток Листовая фильтровальная бумага Разовые резиповые перчатки Тара для лабораторных отходов

4.4    Замечания по использованию и хранению тест-систем Нс используйте тест-систему с истекшим сроком годности. Срок годности тест-

системы указан на этикетке.

Нс заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами из другого набора с другим номером партии. Не используйте реагенты других производителей. Разбавление или замена реагентов может привести к потере чувствительности определения.

Храните набор при температуре 2-8 °С. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ НАБОР.

Для хранения неиспользованных стргаюв (лупок) упакуйте их в фольгированный пакет и плотно закройте его.

Поскольку раствор хромогена светочувствителен, избегайте попадания прямых солнечных лучей на флакон с раствором.

В случае голубоватого окрашивания раствора хромогена не рекомендуется использовать раствор, так как это является признаком порчи.

5. Требования безопасности

5.1.    При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ12.1.004 и элсктробезонасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, указанные в технической документации па весы, спектрофотометр и вспомо|ательныс устройства.

5.2.    Помещение, в котором производится выполнение измерений, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией.

5.3.    Внимание! Стандарты содержат окадаиковую кислоту. При работе используйте разовые резиловые перчатки, избегайте контакта реагентов с кожей.

5.4.    После каждого анализа следует тщательно промывать оборудование и лабораторную посуду для предотвращения перекрестного загрязнения от пробы к пробе. Все использованные материалы, жидкие отходы, расходные материалы и лабораторная посуда должны быть дсконтамииированы путем замачивания в течение не менее 60 минут в 5% растворе гипохлорита натрия. Затем лабораторную посуду следует отмыть обычными лабораторными моющими средствами и промыть дистиллированной водой.

5.5.    Стоп-pc агент содержит в своем составе кислоту. Избегайте контакта стоп-реагента с кожей.

5.6.    Метанол относится к легковоспламеняющимся растворителям. Емкость с метанолом должна быть всегда плотно закрыта. Храните емкость с метанолом вдали от источников тепла, искр и открытого пламени. Не курите во время работы. Метанол токсичен при попадании внутрь! Пары метанола токсичны! Не вдыхайте пары метанола! Избегайте контакта метанола с кожей.

6. Требования к квалификации персонала

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или среднее специальное образование, прошедшие соответствующий инсгруктаж, освоившие метод в процессе стажировки.

7. Условия измерений

При выполнении измерения в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

20 - 25 °С

84.0 - 106.7 кПа (630 - 800 мм. рт. ст.);

не более 80% при температуре 25°С;

220 ± 10 В;

Частота переменного тока 50 ± 1 Гц

8. Подготовка к проведению анализа

8.1. Отбор проб

Отбор проб осуществляют в соответствии с действующей нормативной документацией по отбору проб. Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора. Пробы, лредказпанекные для анализа, должны храниться в холодном темном месте.

8.2 Подготовка реактивов и материалов

Перед использованием доведите температуру всех реагентов (включая дистиллированную воду) до комнатной (20-25 °С). Это займет около 1 часа.

Приготовление 45%-ного раствора метанола. В мерную колбу на 50 см³ помещают 22,5 см3 мстапола и доводят объем раствора до метки дистиллированпой водой. Раствор тщательно перемешивают. Срок храпения растпора при комнатной температуре - 4 недели.

Приготовление 90%-ного раствора метанола. В мерную колбу на 100 см³ помещают 90 см³ метанола и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают. Срок хранения раствори при комнатной температуре -4 педели.

Микротитровапьный планшет. Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов (лунок) вместе с рамкой. Остальные страны (лупки) следует тщательно упакован» в фольгированный пакет, закрыть и поместить па хранение при температуре 2-8 °С.

ю

8.3. Пробоподготовка

8.3.1.    Раскрывают раковину, промываю!' мясо моллюска водой, обсушивают образец.

8.3.2.    Берут навеску от 1 до 10 г моллюска, помешают навеску в стакан гомогенизатора, фиксируют вес образца.

8.33. Добавляют 5-кратный объем 90% раствора метанола, фиксируют добавленный объем.

83.4. Гомогенизируют образец с раствором метанола в течение 1-2 минут.

8.3.5.    Центрифугируют гомогенат.

8.3.6.    Отбирают 1 см³ супернатанта, переносят в чистую пробирку (шш виалку), с помощью дистиллированной вода доводят объем раствора до 2 см³ (разбавление в 2 раза).

83.7. Для анализа используют 50 мют раствора на лупку планшета.

9. Выполнение измерении

9.1.    Предварительные замечания к проведению измерений с помощью тест-системы «DSP-Chcck»:

-    немедленно после использования охлаждают все оставшиеся реагенты до температуры 2 - 8°С, избегайте длительного хранения реагентов при комнатной температуре;

-    иммуноферментная реакция начинается после добавления в лунки планшета препарата антител. При дозировании рекомендуется использовать, многоканальную пипетку;

-    в процессе выполнения анализа не допускайте полного высыхания лунок планшета. Избегайте перерывов между отдельными рабочими стадиями;

-    воспроизводимость результатов иммуноферментного анализа существенно зависит от тщательности отмывки планшета в процессе анализа. Внимательно следуйте описанной далее процедуре отмывки планшета;

-    на стадии инкубации с хромогеном избегайте воздействия прямого солнечного света. При инкубации рекомендуется поместить планшет в темный бокс.

9.2.    Приготовление стандартных растворов. Добавьте по 5 см³ 45 %-го раствора метанола во флаконы [7] и [8], содержащие рассчитанные навески окадаиковой кислоты (отметка на флаконе соответствует объему 5 см³), закройте крышки флаконов и энергично встряхните. Полученные растворы содержат 10 мкг/ дм³ окадаиковой кислоты [7] и 100 мкг/ дм³ окадаиковой кислоты [81-

П