СОГЛАСОВАНО

УТВЕРЖДАЮ

---

Методика выполнения измерений содержания антибиотиков группы пснициллинов в продукции животного происхождения методом ИФА с использованием тест-систем производства EuroProxima B.V., Нидерланды

МВИ.МН 5336 - 2.0(5

СОДЕРЖАНИЕ

1    Область применения.......................................................................................3

2    Точность измерений........................................................................................3

3    Средства измерений, испытательное и вспомогательное оборудование,

материалы, реактивы...............................................................................................5

3.1    Средства измерений, испытательное и вспомогательное оборудование,

материалы..................................................................................................................5

3.2    Реактивы...........................................................................................................6

4    Метод измерений.............................................................................................6

5    Требования безопасности н требования к квалификации    операторов........7

5.1    Требования безопасности..................................................................................7

5.2    Требования к квалификации операторов...........................................................7

6    Условия выполнения измерений....................................................................7

7    Условия инкубации микротитровальных планшетов о помещении............7

8    Условия хранения тест-систем.......................................................................8

9    Подготовка к выполнению измерений...........................................................8

9.1    Отбор образцов.................................................................................................8

9.2    Подготовка лабораторной посуды.....................................................................8

9.3    Приготовление растворов.................................................................................8

9.4    Подготовка проб...............................................................................................8

9.5    Подготовка тест-систем.................................................................................. 11

9.6    Приготовление раствора конъюгата................................................................13

9.7    1 (риготовление раствора антител....................................................................13

9.8    Приготовление градуировочных растворов.....................................................14

10    Выполнение измерений.................................................................................14

11    Обработка результатов измерений...............................................................16

12    Контроль бланка................. 17

13    Проверка приемлемости результатов измерений,    полученных    в    условиях

повторяемости...................... 18

14    Оформление результатов измерений...........................................................18

14.1    Форма представления результата измерения с использованием расширенной

неопределенности.....................................................................................................18

14.2    Форма представления результата измерения в виде одиосз'оронней оценки с

использованием предела измерения.........................................................................18

14.3    Форма представления результата измерения в виде односторонней оценки с

использованием значения верхней границы диапазона измерений...........................19

15    Контроль точности результатов измерений....,...........................................19

15.1    Оперативный контроль результатов, полученных в условиях повторяемости. 19

15.2    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях

промежуточной прецизионности..............................................................................19

1 5.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости..................................................................................................20

15.4    Контроль правильности................................................... 21

15.5    Контроль стабильности результатов измерений с применением контрольных

карг Ш у харта (КК)...................................................................................................22

16    Нормативные ссылки....................................................................................24

Библиография................................................... 25

2

9.4.5    Подготовка проб сгущенного молока

9.4.5.1    Получение восстановленного сгущенного молока

Доводят температуру образца, отобранного в соответствии с п. 9.1, от 20 °С до 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре и тщательно перемешивают.

В стаканы вместимостью 100 см³ или 150 см³ помещают 2 параллельные навески образца массой 25,0 г, взвешенные с точностью до 0,1 г.

Затем в стаканы с навесками порциями по 5-10 см³ приливают дистиллированную воду, нагретую до температуры 30 °С, перемешивая содержимое стеклянной палочкой до полного растворения образца. После растворения образца содержимое стаканов количественно переносят в мерные колбы вместимостью 100 см^-*, доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

9.4.5.2    Получение подготовленных проб восстановленного сгущенного молока

Получение подготовленных проб восстановленного сгущенного молока проводят согласно п. 9.4.1.2, используя для этого пробы восстановленного сгущенного молока, приготовленные по п. 9.4.5.1. Допускается хранение подготовленных проб при температуре от 20 °С до 25 °С в течение одного часа.

Перед отбором аликвот для проведения ИФА растворы проб перемешивают.

9.4.6    Подготовка проб мяса

Для подготовки проб используют образец, отобранный в соответствии с п. 9.1. Доводят температуру образца от 20 °С до 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре. От образца отбирают две параллельные навески массой 1,00 г, взвешенные с точностью до 0,01 г. Навески помещают в пробирки для центрифугирования вместимостью 15 сиг* и в каждую пробирку добавляют 4,0 см³ дистиллированной воды. Содержимое пробирок тщательно перемешивают па вортексс, а затем при переворачивании на ротаторе в течение 15 мин. после чего центрифугируют в следующем режиме: 2000 g, 10 мин.

После центрифугирования из каждой пробы отбирают дозатором над осадочную жидкость объемом 50 мм^-*, и переносят се в пробирки для центрифугирования вместимостью 2 см³. В пробирки добавляют отмеренные дозатором 350 мм³ буфера для разбавления, приготовленного по п. 9.3.1, и тщательно перемешивают на воргексе.

Полученные растворы проб используются для проведения ИФА. Допускается храпение подготовленных растворов проб при температуре от 20 °С до 25 °С в течение одного часа.

Перед отбором аликвот для проведения ИФА растворы перемешивают.

9.5 Подготовка тест-систем

9.5.1 Предварительная подготовка и правила обращения с тест-системами

Тест-систему извлекают из холодильника, не открывая упаковку микротитровального планшета, выдерживают при температуре от 20 °С до 25 °С от 0,5 до 1 ч, доводят температуру остальных реагентов от 20 °С до 25 °С.

Перед использованием реагенты необходимо аккуратно перемешать круговыми движениями флаконов.

Особенное внимание следует обратить па раствор субстрата, в котором при

н

температуре 4 °С выпадает осадок. Перед применением раствор субстрата, предварительно нагретый до температуры от 20 °С до 25 °С, необходимо аккуратно перемешать до растворения осадка.

Замена отдельных реагентов на реагенты из тест-систем других партий не допускается.

Не допускается использование реагентов, имеющих следующие признаки распада:

•    голубая окраска раствора хромогена до внесения его в лунки;

•    оптическая плотность нулевого градуировочного раствора (концентрация О нг/см³) меньше 0,8.

9.5.2 Подготовка микротитровального планшета

Количество лунок микротитровального планшета, необходимых для проведения анализа А_м-, рассчитывается по формуле

N_W=\6 ₊ 2N_SMP,    (1)

где    N_ш, - количество образцов;

16 - количество лунок для градуировочных растворов и бланка. Микротитровалыгый планшет со стрипами, предварительно подготовленными в соответствии с п. 9.5.1, вынимают из упаковки. В микротитровальный планшет помещают необходимое количество стрипов, рассчитанное исходя из требуемого для проведения измерений количества лунок N_w. Оставшиеся стрипы сразу же помещают в упаковку, закрывают и хранят в соответствии с разделом 8.

Размечают положения лунок, предназначенные для бланка, градуировочных растворов и растворов проб, согласно рисунку 1.

ШФ

-V3-P

*Г; V

-Ж,

■Жй*.

M'S

Ms

Б

Б

П-1

П-1

П-9

П-9

'■■Ж

С-0

С-0

П-2

П-2

П-10

П-10

■:CS

С-1

С-1

п-з

П-З

п-и

П-П

С-2

С-2

П-4

П-4

П-12

П-12

ж'

С-3

С-3

П-5

П-5

11-13

Г1-13

С-4

С-4

П-6

П-6

ГИ4

П-14

С-5

С-5

П-7

П-7

П-15

П-15

■•vH-lv

С-6

С-в

П-8

П-8

П-16

П-16

Рисунок 1 - Схема расположения лунок для бланка, градуировочных расгворов и

растворов проб

где Б - бланк,

С -0, С -1,... С -6 - градуировочные растворы, включая нулевой,

Я -1, Я -2,... Я -16 - исследуемые пробы,

1,2,3... Л 2 - номера стрипов в планшете,

А, В,... Н - обозначения лунок в стрипах.

Не рекомендуется одновременно использовать более 6-ти стрипов. При необходимости исследовать большее количество проб анализ выполняется в несколько этапов.

12

9.5.3 Приготовление моющего буфера

В коническую колбу вместимостью 500 см³ вносят дозатором аликвоту 20хконцентрата моющею буфера, подготовленного по п. 9.5.1, и добавляют цилиндром в 19 раз больший объем дистиллированной воды, после чего содержимое колбы перемешивают. Требуемый объем аликвоты 20хконцентрата моющего буфера У_к, см³, определяют, исходя из планируемого к использованию количества стрипов N.srn»¹¹⁰ формуле:

Ук= ²*ш    (2)

Полученный раствор используют свежеприготовленным.

9.6 Приготовление раствора конъюгата

Раствор готовится непосредственно перед проведением ИФД и хранению не подлежит.

ЮОхконцентрат конъюгата, подготовленный но и. 9.5.1, центрифугируют в следующем режиме: от 20 °С до 25 °С, 1000 g, 1 мин. Отбирают дозатором аликвоту' ЮОхконцентрата конъюгата и переносят в микроцентрифужную пробирку или пробирку вместимостью 5 см³. В пробирку добавляют отмеренный дозатором буфер для разбавления, приготовленный по п. 9.3.1, из расчета 990 мм³ на 10 мм³ ЮОхконцентрата конъюгата (100:1) и перемешивают на вортексе. ЮОхконцентрат конъюгата сразу же убирают в холодильник и храпят в соответствии с п. 8.

Требуемый объем аликвоты ЮОхконцентрата конъюгата V, мм³, определяют, исходя из планируемого к использованию количества лунок N_IV , по следующей формуле

, 25-(N_w-2) + V.

У=-^—к    (3)

100

где V, объем раствора конъюгата, приготавливаемого в запас, мм³ (не мспсс 25 мм³).

Приготовленный раствор коныогага следуег предохранять от действия света.

где К, - объем раствора антител, приготавливаемого в запас, мм⁵ (не менее 25 мм³).

9.8 Приготовление градуировочных растворов

9.8.1    Приготовление градуировочного раствора № 6

К содержимому флакона с лиофилюированным стандартом (с концентрацией 4 нг/см³ в восстановленном стандарте) добавляют отмеренные дозатором 2 см³ буфера для разбавления, приготовленного по п. 9.3.1. Содержимое закрытого флакона перемешивают на вортексе в течение 1 мин.

9.8.2    Приготовление градуировочных растворов № 1 - № 5

Градуировочные растворы № 1 - № 5 готовят путем последовательного разбавления градуировочного раствора № 6, приготовленного по п. 9.8.1, следующим образом. В пробирки для центрифугирования вместимостью 2 см³ или стеклянные пробирки вместимостью 5 см³ вносят аликвоту соответствующего градуировочного раствора и аликвоту буфера для разбавления, приготовленного по п. 9.3.1. Раствор, от которого отбирается аликвота, и объемы аликвот, используемые для приготовления градуировочных растворов, указаны в таблице 4. Содержимое пробирок перемешивают на вортексе в течение 1 мин.

Таблица 4 - Схема прнготовлепия градуировочных растворов

Номер град. раствора Концентрация градуировочного раствора, нг/см3 Источник аликвоты раствора бензилпенициллина для приготовления градуировочно го раствора Объем аликвоты раствора бензи л пеиицилл ина Объем буфера для разбавления 6 4,000 - - - 5 2,000 град, раствор № 6 250 мм3 250 мм3 4 1,000 град, раствор № 5 250 мм3 250 мм3 3 0,500 град, раствор № 4 250 мм3 250 мм3 2 0,250 град, раствор № 3 250 мм3 250 мм3 1 0,125 град- раствор № 2 250 мм3 250 мм3

9.8.3 Хранение градуировочных растворов

Приготовленные по пп. 9.8.1, 9.8.2 градуировочные растворы № 1-№6 делят на отдельные аликвоты, которые хранят при температуре минус 20 °С в течеиие срока хранения и размораживают в холодильнике при температуре от 2 °С до 8 °С. Размороженные растворы повторному замораживанию не подлежат.

10 Выполнение измерений

Для проведения измерений используют пробы, подготовленные в соответствии с п. 9.4. Компоненты тест-систем подготавливают в соответствии с п. 9.5.

10.1 В лунки микротитровального планшета, размеченного согласно п. 9.5.2, вносят отобранные дозатором:

• в лунки Al, А2 - две аликвоты объемом 100 мм³ буфера для разбавления,

14

приготовленного по п. 9.3.1 (бланк);

•    в лунки В1, В2 - две аликвоты объемом 50 мм³ буфера для разбавления, приготовленного по п. 9.3.1 (нулевой градуировочный раствор);

•    в лунки С1 -Н2 - по две аликвоты объемом 50 мм³ каждого градуировочного раствора (№1 - №6);

•    в луики АЗ - Н6 - аликвоты объемом 50 мм³ двух параллельных проб каждою образца.

Каждую аликвоту вносят в отдельную лунку, внесение 1радуировочных растворов производится в порядке возрастания их концентраций.

Примечание:    при    выполнении измерений согласно п. 10.10 с

использованием автоматического микропланшетного фотометра с референсным фильтром на 630 нм (620 им), бланк в лунки микротитр овально го планшета не вносят. Освободившиеся лунки используют для градуировочных растворов или растворов проб.

10.2    В каждую лунку микротитровального планшета, за исключением лунок А1, А2, вносят отобранный дозатором раствор конъюгата, приготовленный по п. 9.6, объемом 25 мм³, затем вносят отобранный дозатором раствор антител, приготовленный по п. 9.7, объемом 25 мм³.

10.3    Закрывают планшет пленкой «парафильм» или заклеивают скотчем. Перемешивают содержимое лунок планшета на вортексе в течение 10 с.

10.4    Помешают планшет в холодильник при температуре от 2 °С до 8 °С и инкубируют в темноте в течение 60 мин.

10.5    По окончании инкубации жидкость из лунок выливают путем резкого переворачивания планшета.

10.6    Промывают планшет три раза, добавляя при этом каждый раз многоканальным дозатором в лунки планшета по 300 мм³ моющего буфера, приготовленного по п. 9.5.3, и затем выливая его резким переворачиванием планшета. После последнего промывания планшет переворачивают и удаляют остатки жидкости путем энергичного троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому листом сухой фильтровальной бумаги.

Примечание: В процессе работы следует избегать высыхания лунок в перерывах между отдельными этапами работы и увеличения длительности перерывов. Точность результатов измерений зависит от равномерного промывания лунок, поэтому следует тщательно соблюдать процесс промывки. Рекомендуется проводить процедуру промывки планшета с помощью устройства для промывки планшетов, задавая следующие параметры программы: количество циклов промывки - 3, объем используемого промывочного раствора - 300 мм³.

10.7    В каждую лупку вносят дозатором по 100 мм³ раствора субстрата и аккуратными круговыми движениями планшета перемешивают его содержимое.

10.8    Помещают планшет в инкубатор при температуре от 20 °С до 25 °С и

инкубируют в течение 30 мин. Отсчет времени инкубации начинают немедленно после окончания внесения раствора субстрата.    При    отсутствии    инкубатора

микротитровалъный планшет инкубируют в течение 30 мин в защищенном от света месте, при условиях, указанных в разделе 7.

10.9    Сразу же после окончания инкубации в каждую лунку планшета дозатором вносят по 100 мм³ раствора стоп-реагента и аккуратными круговыми движениями перемешивают его содержимое.

10.10    Немедленно после добавления стоп-реагента измеряют оптическую плотность в

15

каждой лунке планшета на автоматическом микропланшетном фотометре при длине волны 450 нм. Измерения проводят в соответствии с инструкцией но эксплуатации прибора.

При наличии автоматического микропланшетного фотометра, позволяющего выполнять измерения с рефсренсным фильтром на 630 нм (620 нм) измерения производят с использованием референсного фильтра. Использование данного режима измерений возможно при положительном результате контроля бланка согласно и. 12.

11 Обработка результатов измерений

Обработка результатов измерений производится с помощью программного обеспечения «Simplerfits» версии не ниже 2.3, разработанного EuroProxima B.V., Нидерланды, далее «программное обеспечение».

Программным обеспечением строится градуировочная зависимость lg[/i'/(i?₀ - £)] от десятичного логарифма концентрации вида

\g[B'l{B₀-B)] = a+bAgC^r,    (5)

где В₀ - оптическая плотнюсть нулевого градуировочного раствора (концентрация 0 иг/см³);

С - концентрация бензилпенициллина в растворе, нг/см³;

В' - скорректированная оптическая плотность раствора, рассчитывается по формуле

ff=B-B_BL,    (6)

где B_BL - оптическая плотность бланка, рассчитываемая по формуле

_(?)

где В_Ш,В_Ш - оптические плотности, измеренные в лунках А1 и А2 (бланк); При измерении оптической плотности с референсным фильтром измерения бланка не производят и при расчетах принимают, что В = В при условии получения положительного результата контроля бланка в соответствии си. 12.

Расчет коэффициентов линейной регрессии а,Ь производится программным

обеспечением с помощью MTIK на основании пар значений lg[iS₍'/(S₍₎ -5,)], IgC, полученных для шести градуировочных растворов, где (t = 1..6), С, - концентрация t - го градуировочного раствора, B_i - среднее значение оптической плотности, рассчитанное по двум значениям двух измерений оптической плотности, В -скорректированное по формуле (6) среднее значение двух измерений оптической плотности.

Массовая концентрация антибиотиков группы пенициллинов в пробе рассчитывается на основании результатов измерений оптической плотности раствора подготовленной пробы, коэффициентов линейной регрессии и фактора разбавления по формуле

X = F 10    ⁶    ,    (8)

где X - концентрация антибиотиков [руппы пенициллинов в пробе мкг/кг; В_х - оптическая плотность, полученная при измерений раствора пробы;

16

где Х_{,Х₂ - результаты измерений массовой концентрации антибиотиков группы пенициллипов- в двух параллельных пробах, мкг/кг.

Окончательный результат измерений округляют до второго знака после десятичной запятой для молока сырого, пастеризованного, стерилизованного, молока сухого восстановленного, молока сгущенного и до первого знака после десятичной занятой для остальных видов продукции.

Если окончательный результат измерений X оказывается меньше, чем предел измерений, приведенный в разделе 1, то дается односторонняя оценка массовой концентрации антибиотиков группы пенициллипов в образце согласно п. 14.2.

Если окончательный результат измерений X оказывается больше, чем значение верхней границы диапазона измерений, приведенного в разделе 1, то дается односторонняя оценка массовой концентрации антибиотиков группы пспициллинон в образце согласно п. 14.3.

12 Контроль бланка

Данная процедура проводится, если при выполнении измерений в соответствии с разделом 10 бланк в лунки микротитровальнот о планшета согласно п. 10.1 нс вносят, и оптическая плотность по п. 10.10 измеряется с использованием референсного фильтра.

При выполнении процедуры контроля бланка производится измерение оптической плотности бланка согласно разделу 10 с использованием референсного фильтра. Исли рассчитанное по формуле (7) значение В_ш удовлетворяет следующему условию

B_aL <0,010,    (10)

то результат контроля бланка признается положительным, в противном случае -отрицательным.

Процедура выполняется однократно для каждой новой партии тест-систем в ходе выполнения серии измерений проб.

17

13    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, проводят в соответствии с требованиями СТБ ИСО 5725-6-2002 следующим образом.

Рассчитывают расхождение между результатами измерений параллельных проб одного образца \Х,~Х₂\, значение которого сравнивают с абсолютным значением предела повторяемости г_оЛ,. Если выполняется условие

|-^Ч ^— -^2!-    00

то оба результата считают приемлемыми и в качестве результата измерений указывают среднее арифметическое значение X, рассчитанное по формуле (9).

Абсолютное значение предела повторяемости г_оН , мкг/кг, рассчитывают по формуле

г,*, = 0,01-г-(12)

где X - среднее арифметическое значение результатов измерений параллельных проб одного образца, мкг/кг,

г - относительное значение предела повторяемости, приведенное в таблице 6, %. При невыполнении условия (11) проводят повторные измерения согласно разделу 10.

14    Оформление результатов измерений

14.1    Форма представления результата измерения с использованием расширенной неопределенности

Результат измерений, выдаваемый лабораторией, может быть представлен в

виде

(X±U(Xj), мкг/кг при доверительной вероятности Р = 0,95, К=2

где X результат измерений, мкг/кг, полученный в соответствии с настоящей методикой и рассчитанный согласно разделу 11;

U(X)~ расширенная неопределенность результатов измерений, мкг/кг. Расширенную неопределенность результата измерений U(X) , мкг/кг, рассчитывают по формуле

U(X) = 0_y0hUX,    (13)

где U - относительная расширенная неопределенность результата измерений, выполняемых в соответствии с МВИ, %, приведенная в таблице 2.

При необходимости может быть проведена оценка расширенной неопределенности измерений, выполняемых в соответствии с данной МВИ при ее реализации в конкретной лаборатории.

14.2    Форма представления результата измерения в виде односторонней опенки с использованием предела измерения

Если конечный результат измерений X оказывается меньше, чем

18

соответствующее данному виду продукции значение предела измерения X_ш , приведенное в разделе 1, то дается односторонняя оценка массовой концентрации антибиотиков группы пенициллинов в образце с использованием предела измерения, в мкг/кг

менее X_IQ,

где X_tQ - значение предела измерений, приведенное в разделе 1.

14.3 Форма представления результата измерения в виде односторонней оценки

с использованием значения верхней границы диапазона измерений

Если конечный результат измерений X оказывается больше, чем соответствующее данному виду продукции значение верхней границы диапазона измерений X_llL3 приведенное в разделе 1, то дается односторонняя оценка массовой концентрации антибиотиков группы пенициллинов в образце с использованием значения верхней границы диапазона измерений, в мкг/кг

более X_tlL,

где X,_lL -значение верхней границы диапазона измерений, приведенное в разделе 1.

15 Контроль точности результатов измерений

Контроль точности проведения измерений выполняется с периодичностью, установленной системой менеджмента качества в лаборатории, но обязательно:

•    при внедрении методики;

• при появлении факторов, влияющих на стабильность процесса по результатам анализа контрольных карт;

•    при значимых изменениях в условиях измерений (другая партия реагентов, новые средства измерений, ремонт оборудования и т.д.);

• при любых выявлешгых несоответствиях в работе лаборатории, применительно к методике выполнения измерений.

15.1    Оперативный контроль результатов, полученных в условиях

повторяемости

Оперативный контроль повторяемости выполняется для каждой пробы после измерения массовой концентрации антибиотиков группы пенициллинов при расчете конечного результата измерений но результатам двух параллельных определений в соответствии с разделом 13.

15.2    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в

условиях промежуточной прецизионности

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях промежуточной прецизионности с изменяющимися факторами оператор-время, проводят в соответствии с требованиями СТБ ИСО 5725-6-2002 следующим образом.

Лаборатория получает два результата измерений X, _у Х₂ согласно разделу 10, варьируя факторы промежуточной прецизионности оператор, время и обеспечивая контроль повторяемости согласно разделу 13. За результат измерений принимают

19

среднее арифметическое значение двух результатов X_t,X₂

2 ’

при их соответствии критерию приемлемости.

Критерием приемлемости является условие

|^-^| < CD_i6e,    (15)

где CD_afic - абсолютное значение критической разности, мг/кг, рассчитываемое по формуле

CD'b^OtOXCDX,    (16)

где CD - относительное значение критической разности, приведенное в таблице 6, %.

15.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости, проводят в соответствии с требованиями СТБ ИСО 5725-6-2002 следующим образом.

Каждая из двух лабораторий проводит измерения согласно разделу 10 и получает результат измерений, обеспечивая контроль повторяемости согласно разделу 13.    _

Рассчитывают    среднее    арифметическое значение X    , мкг/кг, результатов

измерений двух лабораторий Х_х и Х₂ соответственно

Х=*¹⁺*²    (17)

2

Рассчитывают    абсолютное    расхождение между    результатами измерений

-Х₇\, полученными в двух лабораториях, значение, которого сравнивают с абсолютным значением критической разности CD_R. Если выполняется условие

\х_{-х_г\ <СД„    (18)

то оба конечных результата, полученные двумя лабораториями считаются

приемлемыми и общее среднее значение X, рассчитанное по формуле (17), может быть использовано в качестве заявляемого результата.

Абсолютное значение критической разности CD_K , мкг/кг, рассчитывают по формуле

CD_K =0,01- k-CDX,    (19)

где X - среднее арифметическое значение результатов измерений двух лабораторий, мкг/кг;

к -коэффициент,равный 1,6;

CD - относительное значение критической разности, %, приведенное в таблице 6.

При превышении значения критической разности для разрешения различий

20

Область применения

Настоящая методика распространяется на сырое, пастеризованное, стерилизованное, сухое восстановленное и сгущенное молоко, молочную сыворотку, восстановленную сухую молочную сыворотку, творог, коктейли молочные, кисломолочные продукты (йогурт, сметана, кефир, пахта и т.п.), сыр (мягкий, полутвердый, твердый, сверхтвердый), масло сливочное, мороженое на молочной основе, мясо (мышцы) и устанавливает метод конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА) для определения содержания антибиотиков группы пенициллинов (бензилиенициллииа, ампициллина, амоксициллина, оксациллина, ннперациллипа).

Методика предназначена для проведения измерений массовой концентрации антибиотиков группы пенициллинов^{1 2 3} с использованием тест-систем PENICILLIN ELISA производства EuroProxima B.V., Нидерланды.

Диапазон измерений методики составляет:

•    для мяса, молочной сыворотки, восстановленной сухой молочной сыворотки, творога, сыра, коктейлей молочных, кисломолочных продуктов, мороженого на молочной основе - от 2,5 мкг/кг до 160,0 мкг/кг;

• для молока сырого, пастеризованного, стерилизованного, молока сухого восстановленного- от 0,16 мкг/кг до 8,00 мкг/кг.

•    для сгущенного молока - от 1,00 мкг/кг до 32,00 мкг/кг.

Предел измерений для данной методики составляет:

•    для мяса, молочной сыворотки, восстановленной сухой молочной сыворотки, творога, сыра, коктейлей молочных, кисломолочных продуктов, мороженого на молочной основе - 2,5 мкг/кг;

• для молока сырого, пастеризованного, стерилизованного, молока сухого восстановленного- 0,16 мкг/кг.

•    для сгущенного молока -1,00 мкг/кг.

2 Точность измерений

Настоящая методика обеспечивает измерение массовой концентрации антибиотиков группы пенициллинов в указанном выше диапазоне с показателями точности, указанными в таблице 1.

между результатами, полученными двумя лабораториями, используют процедуры, указанные в разделе 5 СТБ ИСО 5725-6-2002.

Таблица 6 - Относительные значения предела повторяемости, критической разности и норматива контроля правильности

Виды продукции Предел повторяемости г,% Критическая разность CD, % Норматив контроля правильности Мясо 16 13 15 Молоко (сырое, пастеризованное, стерилизованное), молоко сухое восстановленное, молоко пущенное 12 17 18 Остальные матрицы 16 17 19

15.4 Контроль правильности

Контроль правильности определения массовой концентрации антибиотиков группы ненициллииов производится путем анализа образцов для контроля (ОК) с заранее известным значением концентрации вещества (рабочая проба с добавкой).

Контроль правильности проводится с использованием добавок бензилпсиициллина. Неопределенность аттестованного значения массовой концентрации бензилпенициллина в ОК не должна превышать одной трети от значения неопределенности результата измерений.

15.4.1 ОК, представляющим собой рабочие пробы с добавкой

Данные образцы для контроля представляют собой навеску пробы, массовая концентрация антибиотиков группы ненициллииов в которой менее предела измерения данной МВИ, в которую внесена добавка раствора бензилпенициллина. Добавка вносится непосредственно в пробирки с навесками (аликвотами) проб. Значение массовой концентрации бензилпенициллина Х_ш„ в пробе с добавкой рассчитывается по формуле

С V

X_am=bLJjL₃    (20)

т

где C_ST -концентрация бензилпенициллина в растворе, нг/см³;

- объем добавляемого раствора бензилпенициллина, см³;

т - масса навески пробы, г.

Величина массовой концентрации антибиотиков группы ненициллииов в пробе с добавкой должна находиться в диапазоне измерений.

Для внесения добавки используется раствор бензилпенициллина, приготовленный из бензилпенициллина калиевой соли в соответствии с прилагаемой к нему инструкцией. Допускается использовать для внесения добавок готовые spike-растворы, при условии, что относительная стандартная неопределенность добавленной массовой концентрации нс превышает 3 %.

15.4.2 Проведение контрольной процедуры

Получают результаты измерений ОК в соответствии с требованиями раздела 10.

21

Таблица 1 — Относительные значения показателей повторяемости и п ро межу то чной п рецизионности

Виды продукции Диапазон измерений, мкг/кг Относительное стандартное отклонение повторяемости сгг, % Относительное стандартное отклонение промежуточной прецизионности CT/(7U>> % Мясо от 2,5 до 160,0 вкшоч. 5,7 6.0 Молоко сырое, пастеризованное, стерилизованное, молоко сухое восстановлен нос от 0,16 до 8,00 включ. 4,3 6,6 Молоко сгущенное от 1,00 до 32,00 включ. 4,3 6,6 Творог, сыр (мягкий, полутвердый, твердый, сверхтвердый), масло сливочное, коктейли молочные, кисломолочные продукты (йогурт, сметана, кефир, пахта и т.п.), мороженое на молочной основе от 2,5 до 160,0 включ. 7,2

В результате оценки показателя правильности для данной методики была

установлена незначимостъ смещения во всем диапазоне измерений.

Значения оценок относительной суммарной стандартной неопределенности и относительной расширенной неопределенности приведены в таблице 2.

Указанные в таблицах 1, 2 метрологические характеристики получены на основании данных эксперимента, проведенного в соответствии с:

•    показатели прецизионности - СТБ ИСО 5725-2;

•    показатели правильности - [ 1 ];

•    оценки неопределенности [ 2 ], [ 1 ].

Таблица 2 - Оценки неопределенности результатов измерений, выполняемых в соответствии с МВИ

Виды продукции Диапазон измерений, мкг/кг Относительная суммарная стандартная неопределенность ис, % Относительная расширенная неопределенность и, %, К = 2,Р = 95 % Мясо от 2,5 до 160,0 включ. 7 14 Молоко сырое, пастеризованное, стерилизованное, молоко сухое восстановленное от 0,16 до 8,00 включ. 8 16 Молоко сгущенное от 1,00 до 32;00 включ. 8 16 Творог, сыр (мягкий, полутвердый, твердый, сверхтвердый), масло сливочное, коктейли молочные, кисломолочные продукты (йогурт, сметана, кефир, пахта и т.п.), мороженое на молочной основе от 2,5 до 160,0 вкшоч. 9

3 Средства измерений, испытательное и вспомогательное оборудование, материалы, реактивы

3.1 Средства измерений, испытательное и вспомогательное оборудование, материалы

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 высокого класса точности с наибольшим пределом взвешивания не менее 200 г, погрешностью ± 0,01 г.

Автоматический м икропланшетный фотометр с фильтром на 450 нм (допускаемая погрешность измерения оптической плотности не более ± 5 %).

Термометр лабораторный частичного погружения класса точности I с ценой деления I °С но ГОСТ 28498.

Центрифуга лабораторная, обеспечивающая относительное центробежное ускорение не менее 2000 g при использовании ротора для пробирок вместимостью 15 см³.

Холодильник бытовой, позволяющий поддерживать температуру от 2 °С до 8 °С в холодильной камере и нс выше - 20 °С в морозильной камере.

Лабораторный вортекс, обеспечивающий скорость вращения ис менее 1800 об/мин, имеющий в комплекте вставку для микротитровальных планшетов.

Лабораторный ротатор, обеспечивающий скорость вращения до 60 об/мин.

Гомогенизатор лабораторный или бытовой блендер.

Дозаторы пипеточные с комплектом одноразовых наконечников:

•    с диапазоном объемов дозирования от 20 мм³ до 200 мм³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального ±2,0 %;

•    с диапазоном объемов дозирования от 100 мм³ до 1000 мм³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального ± 1,5 %;

•    с диапазоном объемов дозирования от 1 см³ до 5 см³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального ±1,0 %;

•    с диапазоном объемов дозирования от 2 см³ до 10 см³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального ± 1,0 %;

•    многоканальный с диапазоном объемов дозирования от 50 мм³ до 350 мм³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального не более ± 4,6 % (при отсутствии автоматического устройства для отмывки иммунологических планшетов).

Пленка «парафильм» или скотч.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Штатив для пробирок.

Пробирки полипропиленовые для центрифугирования вместимостью 15 см³.

Пробирки стеклянные вместимостью 5 см³ или 10 см³ по ГОСТ 1770.

Пробирки микроценгрифужные с крышкой (чипа Эппсндорф) из полипропилена вместимостью 2 см³.

Колбы мерные вместимостью 100 см³ типа 2-100-2 по ГОСТ 1770.

Колбы конические вместимостью 100 см³, 500 см³ по ГОСТ 25336.

Воронки типа В-56-80 ХС, В-75-110 ХС по ГОСТ 25336.

Стаканы Н-1-100 или Н-1-150, Н-1-500 по ГОСТ 25336.

Пипетки 1-2-5 по ГОСТ 29169.

Палочки стеклянные оплавленные.

Цилиндры мерные вместимостью 25 см³, 50 см³, 250 см³, 500 см³ типа 3-25-2, 3-50-2,3-250-2,3-500-2 по ГОСТ 1770.

5

Использование следующего оборудования не является обязательным, но рекомендуется для увеличения производительности и повышения точности анализа:

•    инкубатор для микротитровальиых планшетов, обеспечивающий поддержание температур от 20 °С до 25 °С с точностью ± 1 °С;

•    устройство отмывки иммунологических планшетов автоматическое с диапазоном объемов моющего раствора, заливаемого в каждую микрокювету от 100 мм³ до 350 мм³.

3.2 Реактивы

Дихлормстап х.ч. по по [ 3 ].

Лабораторный детергент, например Triton Х-100.

Пенициллина G (бензилпеиициллина) калиевая соль с массовой дожи основного вещества нс мспсс 98 %.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или деионизированная.

Тсст-система PENICILLIN ELISA производства EuroProxima B.V., Нидерланды, каталожный номер 5091 PEN, в составе (таблица 3).

Таблица 3 - Состав тест-системы PENICILLIN ELISA

Компонент тсст-еистсм Количество в комплекте Микротитровальпый планшет (12 стрипов по 8 лунок, покрытых первичными антителами) 1 шт 100 х концентрат конъюгата 100 мм-’ ЮОхконцентрат раствора антител 100 мм3 Раствор субстрата (готовый к применению) 1 шт. * 12 с\Г Стон-реагент (гот овый к применению) 1 шт. х 15 см" 4хконцснтрат буфера для разбавления 1 шт. х 20 с.мл 20хкоицентрат моющего буфера 1 шт. х 30 см3 Лиофилизированкый стандарт с концентрацией 4 nr/cMJ в восстановленном стапдарте 3 шт.

Допускается использовать другие средства измерений, испытательное и вспомогательное оборудование по метрологическим и техническим характеристикам, а материалы и реактивы (кроме тест-систем) по качеству не хуже указанных.

4 Метод измерений

В лунки микротитровального планшета добавляются градуировочные растворы или растворы проб вместе с антителами и конъюгатом, представляющим собой ампициллин, маркированный нероксидазой хрена. Присутствующие в пробе антибиотики группы иснициллинов и коныогированиый ампициллин конкурируют за центры связывания антител (конкурентный ИФА). После 60-минутной инкубации несвязанные реагенты удаляются на стадии промывки.

После добавления раствора субстрата/хромогена (перекись водорода /тетраметилбензидии) связанный конъюгат превращает бесцветный хромоген в окрашенный продукт.

Реакция окрашивания останавливается внесением серной кислоты. Интенсивность окрашивания измеряется фотометрически при длине волны 450 им.

о

Измеренная оптическая плотность находится в обратной зависимости от концентрации ампициллина в градуировочном растворе и антибиотиков группы гюнициллинов в растворе пробы. Массовая концентрация антибиотиков группы пенициллииов в образце определяется по градуировочной зависимости, построенной с использованием 7 градуировочных растворов.

5    Требования безопасности и требования к квалификации операторов

5.!    Требовании безопасности

При выполнении работ в соответствии с данной методикой персонал должен знать и строго соблюдать на рабочем месте требования:

•    электробезопасности по ГОСТ 12.2.003;

•    пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004;

•    техники безопасности при работе в химической лаборатории в соответствии с инструкциями, утвержденными в установлешюм порядке;

•    техники безопасности, изложенные в инструкции по эксплуатации средств измерений и оборудования, применяемых при проведении измерений.

5.2 Требования к квалификации операторов

К проведению работ по данной методике допускаются лица, имеющие высшее специальное или среднее специальное образование по ирофилю выполняемых работ, прошедшие обучение приемам работы на оборудовании, освоившие выполнение всех операций, предусмотренных методикой, владеющие техникой постановки иммуноферментного анализа.

6    Условия выполнения измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

•    температура окружающего воздуха от 20 °С до 25 °С;

•    относительная влажность воздуха не более 80 % при температуре 25 °С.

7 Условия инкубации микротитровальных планшетов в помещении

При отсутствии инкубатора микротитровальные планшеты могут инкубироваться в помещении при выполнении следующих условий:

•    температура окружающего воздуха должна быть от 20 °С до 25 °С;

•    не должно происходить попадание прямых солнечных лучей на планшет;

•    планшет не должен подвергаться воздействию сильных естественных или искусственных потоков воздуха, вызванных, например, принудительной вентиляцией;

•    с целью устранения воздействия холодной поверхности стола, на котором находится планшет, рекомендуется помещать под него теплоизоляционный материал, например, сложенное в несколько слоев бумажное полотенце.

•    в особых случаях, которые оговорены но тексту методики, требуется помещать планшет в защищенное от света место, например в ящик стола.

7

8    Условия хранения тест-систем

Хранение тест-систем осуществляется в холодильнике при температуре от 2 °С до 8 °С в оригинальных флаконах и упаковке. Не допускается замораживание тест-систем с целью увеличения их срока храневия.

Хранение неиспользованных стрипов (лунок) осуществляется в холодильнике при температуре от 2 °С до 8 °С в плотно закрытом оригинальном пакете.

Необходимо исключить прямое попадание света на раствор субстрата.

9    Подготовка к выполнению измерений

9.1    Отбор образцов

Отбор образцов для анализа проводят по СТБ 1036. Отобранные образцы могут храниться в защищенном от света месте при температуре от 2 °С до 8 °С в течение суток или в замороженном виде при температуре не выше минус 20 °С в течение 14 дней. Перед проведением подготовки проб по п. 9.4 замороженные образцы должны быть разморожены при температуре от 2 °С до 8 °С.

9.2    Подготовка лабораторной посуды

Сильнозагрязненную лабораторную посуду предварительно обрабатывают хромовой смесью. Лабораторпуго посуду после мойки в растворе специализированного моющего средства промывают водопроводной, ополаскивают дистиллированной водой 2 раза и высушивают.

Запрещается:

•    многократное использование одноразовой лабораторной посуды;

•    использование бытовых моющих средств для мойки лабораторной посуды.

9.3    Приготовление растворов

9.3Л Приготовление буфера для разбавления

4хконцеитрат буфера для разбавления подготавливают по н. 9.5.1. В коническую колбу вместимостью 100 см³ вносят дозатором аликвоту 4хкоицситрата буфера для разбавления проб и добавляют цилиндром в 3 раз больший объем дистиллированной воды, после чего содержимое колбы перемешивают.

Полученный раствор хранят при температуре от 2 °С до 8 °С в течение месяца.

9.4    Подготовка проб

9.4.1    Подготовка проб сырого, стерилизованного и пастеризованного молока

9.4.1.1    Предварительная подготовка проб

Для подготовки проб используют образец, отобранный в соответствии с п. 9.1. Доводят температуру образца от 20 °С до 25 °С, выдерживая молоко при комнатной температуре. Перед взятием аликвоты испытуемый образец перемешивают путем встряхивания и переворачивания представленной упаковки.

9.4.1.2 Получение подготовленных ироб молока

Отбирают дозатором две параллельные аликвоты проб молока, объемом 250 мм³ и переносят в пробирки для центрифугирования вместимостью 2 см³. К пробам в пробирках добавляют отобранные дозатором 250 мм³ буфера для разбавления, приготовленного по п. 9.3.1, и тщательно перемешивают на вертексе. После тщательного перемешивания полученного раствора в пробирках на вортексе, его используют для проведения ИФА. Допускается хранение подготовленных проб при температуре от 20 °С до 25 °С в течение одного часа.

Перед отбором аликвот для проведения ИФА растворы проб перемешивают.

9.4.2 Подготовка проб сухого молока

9.4.2.1    Восстановление сухого молока

Для подготовки проб используют образец, отобранный в соответствии с п. 9.1. Доводят температуру образца от 20 °С до 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре.

В стаканы вместимостью 100 см³ или 150 см³ помещают 2 параллельные навески образца сухого молока, взвешенные с точностью до 0,1 г. Массы навесок в зависимости от содержания жира составляют:

•    9,0    г    сухого    обезжиренного    молока;

•    12,0    г сухого молока с содержанием жира 20 %;

•    12,5    г сухого молока с содержанием жира 25 %;

•    10,0    г сухого молока с содержанием жира, отличным от перечисленного

выше.

Затем в стаканы с навесками порциями по 5-10 см³ приливают дистиллированную воду, перемешивая содержимое стеклянной палочкой до полного растворения образца. После растворения сухого молока растворы из стаканов количественно переносят в мерные колбы вместимостью 100 см³, доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

9.4.2.2    Получение подготовленных проб восстановленного сухого молока Получение подготовленных проб восстановленного сухого молока проводят

согласно а. 9.4.1.2, используя для этого пробы восстановленного сухого молока, приготовленные по п. 9.4.2.1. Допускается хранение подготовленных проб при температуре от 20 °С до 25 °С в течение одного часа.

Перед отбором аликвот для проведения ИФА растворы проб перемешивают.

9.4.3 Подготовка ироб творога, коктейлей молочных, кисломолочных

продуктов, сыра, масла сливочного, мороженого на молочной основе

9.4.3.1 Предварительная подготовка проб

Для подготовки проб используют образцы, отобранные в соответствии с п. 9.1. Образцы масла сливочного, охлажденные до температуры не выше минус 10 °С, измельчают с помощью терки, перемешивают и доводят температуру от 20 °С до 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре. Для остальных образцов доводят температуру от 20 °С до 25 °С, выдерживая при комнатной температуре, после чего

9

гомогенизирую т с помощью гомогенизатора или блендера (жидкие образцы тщательно перемешивают).

9.4.3.2 Получение подготовленных проб творога, коктейлей молочных,

кисломолочных продуктов, сыра, масла сливочного, мороженого на молочной основе

От гомогенизированного образца отбирают две параллельные навески массой 0,50 г, взвешенные с точностью до 0,01 г. Навески помещают в пробирки для центрифугирования вместимостью 15 см³ и в каждую пробирку добавляют отмеренные дозатором 3,5 см³ дистиллированной воды и отмеренные пипеткой 4,0 см³ дихлорметаиа. Содержимое пробирок тщательно перемешивают на вортексе, а затем при переворачивании на ротаторе в течение 15 мин, после чего центрифугируют в следующем режиме: 2000 g, 10 мин.

После центрифугирования из каждой пробы отбирают дозатором налосадочную жидкость объемом 50 мм³, и переносят ее в пробирки для центрифугирования вместимостью 2 см³. В пробирки добавляют отмеренные дозатором 200 мм"¹ буфера для разбавления, приготовленного по п. 9.3.1, и тщательно перемешивают на вортексе.

Полученные растворы проб используются для проведения ИФА. Допускается хранение подготовленных растворов проб при температуре от 20 °С до 25 °С в течение одного часа.

Перед отбором аликвот для проведения ИФА растворы перемешивают.

9.4.4 Подготовка проб молочной сыворотки, восстановленной сухой молочной

сыворотки

9.4.4.1    Восстановление сухой молочной сыворотки

Для подготовки проб используют образец, отобранный в соответствии с п. 9.1. Доводят температуру образца от 20 °С до 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре.

В стаканы вместимостью 100 см³ или 150 см³ помещают 2 параллельные навески образца массой 12,5 г, взвешенные с точностью до 0,1 г.

Затем приливают небольшими порциями по 10 - 20 см³ дистиллированную воду, нагретую до температуры (40 ± 5) °С, перемешивая содержимое стеклянной палочкой до полного растворения образца. После растворения навески растворы из стаканов количественно переносят в мерные колбы вместимостью 100 см³, доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

9.4.4.2    Получение подготовленных проб восстановленной сухой молочной сыворотки

Получение подготовленных проб восстановленной сухой молочной сыворотки проводят согласно п.9.4.3.2, используя для этого пробы восстановленной сухой молочной сыворотки, приготовленные по п. 9.4.4.1. Допускается хранение подготовленных проб при температуре от 20 °С до 25 °С в течение одного часа.

Перед отбором аликвот для проведения ИФА растворы проб перемешивают.

ю

1

Массовая концентрация антибиотиков группы пенициллинов в соответствии с данной методикой определяется как сумма массовых концентраций бензил пенициллина, ампициллина, амоксициллина, оксациллина, пипераниллина

2

в пересчете на бензшшеиициллин с учетом перекрестной чувствительности, специфицируемой производителем для вышеуказанной тест-системы

3