Изменение №2 к ГОСТ Р 52174-2003
Биологическая безопасность. Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа

Изменоние No 2 ГОСТ Р 52174-2003 Биологическая безопасность. Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа

Утверждено и введено в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22.11.2013 N5 1896-ст

Дата введения — 2014—07—01

Раздел 1. Второй абзац. Заменить слова: «пяти» на «десяти». «10~¹² г(1 пг)» на «10‘⁹ г (1 нг. -10³ геном-эквивалентов тотальной растительной ДНК/1 мкл пробы)».

Раздел 2 дополнить ссылкой:

« Г ОСТ 20015—88 Хлороформ. Т ехничесхие условия ».

Пункты 4.1.4.2 изложить в новой редакции:

«4.1 Универсальный аппаратно-программный комплекс (УАПК) для анализа биологических микрочипов с компьютерной программой для анализа полученных результатов (1J.

4.2 Хлороформ по ГОСТ 20015. х.ч.».

Пункт 4.3. Заменить ссылку: (3] на [2].

Пункт 4.4. Заменить ссылку: (4) на (3).

Пункт 4.8. Заменить ссылку: (5) на [4].

Пункт 4.9. Заменить ссылку: [6] на [5].

Пункт 4.10. Заменить ссылку: [7] на [6].

Пункт 4.13. Заменить ссылку: (81 на (7].

Пункт 4.14. Заменить ссылку: (9) на [8].

Пункт 4.24. Заменить ссылку: [10] на [9].

Пункт 4.25. Заменить ссылку: [11] на [10].

Пункт 4.28 изложить в новой редакции:

«4.28 Цетилтриметиламмоний бромид [11]».

Пункт 4.31 изложить в новой редакции:

«4.31 Фермент термостабильный HotTaq-полимераза для ПЦР с «горячим стартом», оптимум активности при температуре 70 °С — 72 ^ЭС [12]».

Пункты 4.33—4.36 изложить в новой редакции:

«4.33 Буфер гибридизационный [13].

4.34    Баня водяная [18].

4.35    Раствор водный дезоксирибонуклеозидтрифосфатов: дАТФ. дГТФ. дУТФ. дЦТФ с молярной концентрацией по 2 мМ каждого [14].

4.36    Раствор флуоресцентного субстрата ФС [15]».

Пункт 4.37. Заменить ссылку: [17] на [16].

Пункт 4.38. Заменить ссылку: [18] на [17].

Пункты 4.39—4.41 изложить в новой редакции:

«4.39 Раствор водный праймеров «ПР-1» для амплификации соответствующих участков генома, включающий следующие пары праймеров [19]:

-    праймеры для амплификации фрагмента гена RBCL, кодирующего большую субъединицу рибуло-зы-1.5-бифосфат карбоксилазы/оксигеназы (Асе. № Z95552. поз. 160—720):

-праймеры для амплификации фрагмента гена лектина LEI (Асе. №К00821М30884, поз. 1080— 1720);

-    праймеры для амплификации фраплента гена IVR1, кодирующего бета-фруктозидазу (Асе. Np U16123, поз. 300—1090);

-    праймеры для амплификации фрагмента ЗбЭ-промотора вируса мозаики цветной капусты (Асе. N® FM 177585. поз. 3560—3870):

-    праймеры для амплификации фрагмента Збв-терминатора вируса мозаики цветной капусты (Асе. No FM177585. поз. 1260—1590);

-    праймеры для амплификации фрагмента 355-промотора каулимовируса мозаики норичника (FMV. Асе. № Х06166. поз. 6260—6630);

1

(Продолжение Изменения No 2 к ГОСТ Р 52174-2003)

-    праймеры для амплификации фрагмента терминатора гена белка теплового шока пшеницы (Асе. МвХ58279. поз. 10-210):

-    праймеры для амплификации фрагмента маркерного гена BAR, определяющего устойчивость к фосфинотрицину (Асе. No AY310901. поз. 380—920);

* праймеры для амплификации фрагмента терминатора nos из агробактерии Agrobacterium tumefadens: (Асе. No FM177585. поз. 10—370).

4.40    Раствор водный праймеров «Г1Р-2» для амплификации соответствующих участков генома, включающий следующие пары праймеров [20]:

-    праймеры для амплификации фрагмента гена фосфорилазы УДФ-глюкозы (UDP-GP) (Асе. No D00667, поз. 50—310);

-    праймеры для амплификации фрагмента гена фосфат-синтазы риса (SPS) (Асе. No U33175. поз. 5910-6250);

-    праймеры для амплификации фрагмента маркерного гена nptll из транслозона Тп5 бактериального происхождения (Асе. No EU886197. поз. 9792—10145);

-    праймеры для амплификации фрагмента терминатора ocs из агробактерии Agrobacterium tumefadens (Асе. No AJ311872. поз. 5050—5240);

-    праймеры для амплификации фрагмента терминатора гена RBCS гороха (Асе. No FM177582.1, поз. 5782—5920);

-    праймеры для амплификации фрагмента промотора гена актина риса АСТ1 (Асе. No S44221. поз. 12—380);

-    праймеры для амплификации фрагмента маркерного гена gus из бактерии Escherichia coli (Асе. No EU503042, поз. 2770—3140).

4.41    Биологический микрочип с иммобилизованными олигонуклеотидами, назначение которых приведено в таблице 1 (название олигонуклеотида соответствует изображенному на рисунке 1) (21]:

Таблица 1 — Обозначение и назначение олигонуклеотидных зондов, иммобилизованных на биологическом микрочипе

Наименование олигонуклеотида Детектируемая мишень Назначение олигонуклеотида pIDNA (rbcL) ген RBCL Зонд для идентификации ДНК растительного происхождения в анализируемом материале GMZSTI(RBCL) ген RBCL Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК сои и/или картофеля ZMI(RBCL) ген RBCL Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК кукурузы OSI(RBCL) ген RBCL Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК риса ST1JRBCL) ген RBCL Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК картофеля GM2(RBCL) ген RBCL Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК сои ZM/OS2(RBCL) ген RBCL Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК кукурузы и/или риса ST2(RBCL) ген RBCL Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК картофеля Lel(Gm) ген лектина (LEI) Специфичный зонд для идентификации ДНК сои Zein(Zm) ген IVR1 Специфичный зонд для идентификации ДНК кукурузы

2

Результат анализа: В образцах 7/кс и 9/кс обнаружены следующие растительные компоненты: в образце 6/кс и 7/кс обнаружено присутствие ДНК сои, а в образцах 8/кс и 9/кс обнаружено присутствие ДНК картофеля.

Таблица 2 — Трансгенные видослецифичные последовательности

Лоследовагепьнос1и Номер образца б/кс 7/кс 8/кс 9/кс При наличии nptll - + - - 35S_р САШ - + - ♦ 35S_р FMV - - - - АсИ _р - - - - Gus - - - - nos _t - - - ♦ 35S_t САШ - - - - rbcSt - - - - OcsJ - - - - Bar - - - -

Результат анализа:    В    образцах    7/кс    и    9/кс    обнаружены    следующие трансгенные компоненты: в

образце 7/кс обнаружен гомолог гена nptll: промотор 35SCaMVu терминатор nos, а в образце 9/кс обнаружены промотор 35S СаМУ и терминатор nos. В образцах 6/кс и 8/кс трансгенные компоненты не обнаружены. Маркировка на упаковке, информирующая о наличии в продукте ГМИ. в образце 7/кс отсутствует, а в образце 9/кс присутствует.

Вывод: Все образцы содержат растительную ДНК. образец 6/кс содержит нетрансгенную ДНК сои; образец 7/кс содержит трансгенную ДНК сои; образец 8/кс содержит нетрансгенную ДНК картофеля; образец 9/кс содержит трансгенную ДНК картофеля.

Исполнители:

_ Иванов    И.И.

подпись    Фамилия,    инициалы

_ Петров    П.П.

подпись    Фамилия,    инициалы

Руководитель испытательной лаборатории___

подпись

МП    _

Фамилия.инициалы

Заключение распространяется на образец, представленный на испытания».

Приложение Д изложить в новой редакции:

11

(Продолжение Изменения No 2 к ГОСТ Р 52174—2003)

«ПРИЛОЖЕНИЕ Д (справочное)

Библиография

[1]    ТУ 9443-004-02699501—2006 ООО «Биочип-ИМБ» [2]    ТУ 9642-001 -4648062—98 [3]    ТУ 42-619—61 [4]    Корпорация «Эппендорф», кат. No 5425 000.014 [5]    Корпорация «Хеликон», кат. No MSH-300 [6]    Корпорация «Хеликон», кат. No CV-1500 [7]    Корпорация «Хеликон», кат. No RP-30 и RP-80 [8]    Корпорация «Хеликон». кат. No FA104. FA108; FA 111; FA 113N [9]    ТУ 6-09-11-1721—83 [10]    ТУ 6-09-4292—76 [11]    Корпорация «Хеликон». кат. No Ат-0833 [12]    Корпорация «Силекс». кат. No Е0320 [13]    ТУ 9398-003-02699501—2006 [14]    Корпорация «Силекс». кат. No N1101 [15]    Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской Академии иаук(ИМБ РАН) [16]    Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской Академии наук (ИФР РАН) [17]    Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской Академии наук (ИФР РАН) [18]    ТУ 46-22-603—75 [19]    Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В .А. Энгельгардта Российской Академии наук (ИМБРАН) [20]    Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской Академии наук (ИМБРАН) [21]    Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской Академии наук (ИМБ РАН) [22]    Государственный Комитет Санэпиднадзора Российской Федерации; No 06-19/52-17 от 15.06.95 [23] ЗАО «НПФ ДНК-Техиология»

Универсальный аппаратно-программный комплекс для анализа биологических микрочипов (УАПК) Амплификатор «Терцик МС-2» Термостат суховоздушный ТВР-25 Микроцентрифуга настольная 5415С. 13000 мин'' Мешалка магнитная с подогревом Аппарат для встряхивания (центрифуга — вортекс) Штативы под микроцентрифужные пробирки Наконечники с фильтром для микропипеток Этилендиаминтетрауксусиой кислоты натриевая соль дигидрат Т рис(оксиметил)аминометан [NH..C{CH.,OH)J) Цетилтриметиламмоний бромид (ЦТАБ) [C>lrH4 NBr] Фермент HotTaq-полимераза 5 Ед. акт. в мм* Буфер гибридизац ионный Раствор смеси дАТФ. дГТФ. дТТФ, дЦТФ. по 25 мМ каждого Флуоресцентный субстрат «ФС» Раствор заведомо трансгенной ДНК около 100 нг/мм1 или 10“ копий/мм! Раствор заведомо нетрансгенной ДНК около 100 нг/мм1 или 10* копий/мм1 Баня водяная с электрическим или огневым подогревом Раствор водный праймеров «ПР-1» Раствор водный праймеров «ПР-2» Биологические микрочипы (биочипы) гелевые с иммобилизованными олигонуклеотидами Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения Компьютерная программа «Gene» для учета и интерпретации результатов, полученных при помощи ПЦР-детектора «Джин»

---

Окончание таблицы 1

Наименование олигонуклеотида Детектируемая пишем» Назначение олигонуклеотида UDP-GP (St) ген фосфорилазы УДФчлюкозы Специфичный зонд для идентификации ДНК картофеля SPS (Os) ген фосфат-синтазы риса Специфичный зонд для идентификации ДНК риса nptll ген npt Специфичный зонд для идентификации маркерного гена nptll из транспозона Тп5 35S_р CAMV промотор 35S Специфичный зонд для идентификации 35S промотора вируса мозаики цветной капусты 35S_р FMV промотор FMV Специфичный зонд для идентификации 35S FMV промотора каулимоеируса мозаики норичника Actl _p ген актина АСТ1 Специфичный зонд для идентификации промотора гена актина риса Gus ген gus Специфичный зонд для идентификации маркерного гена gus nosl терминатор nos Специфичный зонд для идентификации терминатора nos из агробактерии Agrobactenum tumefaciens 35S t CAMV терминатор 35S Специфичный зонд для идентификации 35S терминатора вируса мозаики цветной капусты rbcSt Терминатор гена RBCS Специфичный зонд для идентификации терминатора гена RBCS гороха OcsJ Терминатор Ocs Специфичный зонд для идентификации терминатора ocs из агробакгерии Agrobactenum tumefaciens Bar ген BAR Специфичный зонд для идентификации маркерного гена BAR

Рисунок 1 — Схема биологического микрочипа для идентификации генетически модифицированных источников

растительного происхождения Обозначение ячеек приведено в соответствии с назначением иммобилизованного в ней зонда, указанного в таблице 1. ¹

(Продолжение Изменения №2 к ГОСТ Р 52174—2003)

Биологический микрочип представляет собой пластиковую подложку, выполненную в формате предметного стекла по ГОСТ 9284, на поверхности которой в определенном порядке расположена 31 ячейка полиакриламидного геля в форме полусферы диаметром 100 мкм (обозначены кружками на рисунке 1). 22 из них содержат индивидуальный ковалентно иммобилизованный олигонуклеотид (перечень и назначение олигонуклеотидов приведены в таблице 1). Пять ячеек с индексом «О» не содержат перечисленных индивидуальных ковалентно иммобилизованных олигонуклеотидов и выполняют роль отрицательного контроля гибридизации. Четыре ячейки с индексом «М», содержат ковалентно связанный флуоресцентный краситель и предназначены для автоматического вычисления интенсивности флуоресценции ячеек биологического микрочипа после гибридизации. Поверхность биологического микрочипа должна быть закрыта специальной составной крышкой с отверстиями, которая вместе с подложкой образует гибридизационную камеру, предназначенную для проведения реакции гибридизации анализируемых ПЦР-продуктов с иммобилизованными на биологическом микрочипе олигонуклеотидами, и исключающую возможность испарения реакционной смеси в процессе гибридизации. Диагностическая специфичность при идентификации растительной ДНК сои. картофеля, кукурузы, риса составляет не менее 95 %.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования и реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных выше».

Пункт 6.1.2. Заменить слова: «186.12 г/дм³» на «74.4 г/дм³». «18.61 г» на «7.44 г», «гидроокиси натрия» на «№ОН».

Пункты 6.1.4—6.1.9 изложить в новой редакции:

«6.1.4 Приготовление раствора Трис-HCI массовой концентрации 242.2 г/дм³

В колбу вместимостью 100 см³ помещают 24.22 г трис(оксиметил)аминометана по 4.25 [10] и растворяют приблизительно в 80 см³ особо чистой стерильной воды. Концентрированной соляной кислотой по ГОСТ 3118 доводят pH раствора до 7.5 ед. pH. а объем — до 100 см³ особо чистой стерильной водой.

Срок хранения при комнатной температурю — не более 6 мес.

6.1.5    Приготовление раствора NaCI массовой концентрации 146,2 г/дм³

В плоскодонную колбу вместимостью 100 см³ помещают 14.62 г хлористого натрия по ГОСТ 4233. растворяют в 70—80 см³ особо чистой стерильной воды, затем полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и особо чистой стерильной водой доводят объем раствора до метки.

Срок хранения при комнатной температуре — не более одного года.

6.1.6    Приготовление ЦТАБ-буфера

В стеклянную колбу вместимостью 100 см³ помещают 2.0 г сухого цетилтриметиламмония бромида по 4.28 [11], далее добавляют 5 см³ раствора Трис-HCI. приготовленного по 6.1.4.56 см³ раствора NaCI. приготовленного по 6.1.5. и 10 см³ раствора ЭДТА. приготовленного по 6.1.2. Объем раствора доводят до 100 см³ особо чистой стерильной водой. Перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения соли.

Срок хранения при комнатной температуре — не более одного года.

6.1.7    Приготовление ЦТАБ-раствора

В стеклянную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0.5 г сухого цетилтриметиламмония бромида по 4.28 [11], и добавляют 1.6 см³ раствора NaCI. приготовленного по 6.1.5. Объем раствора доводят до 100 см³ особо чистой стерильной водой.

Срок хранения при температуре 4 °С — 5 °С — не более месяца, в морозильной камере по ГОСТ 26678 при температуре минус 20 °С — до одного года.

6.1.8    Приготовление разведенного раствора NaCI

В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 48 см³ раствора NaCI. приготовленного по 6.1.5. и особо чистой стерильной водой доводят объем раствора до метки.

Срок хранения при комнатной температуре — не более 6 мес.

6.1.9    Раствор Taq-полимеразы по 4.31 хранят при температуре минус20 °С не более шести месяцев. Не допускается хранение раствора Taq-полимеразы ниже температуры минус 23 °С».

Пункты 6.2.1—6.2.6 изложить в новой редакции:

«6.2.1 Две параллельные пробы анализируемого продукта массой около 100 мг каждая помещают в две чистые стерильные микроцентрифужные пробирки по 4.15 вместимостью 1.5 см³, добавляют по 500мм³ ЦТАБ-буфера. приготовленного по 6.1.6, перемешивают на аппарате для встряхивания по4.10[6] в течение 2 мин и выдерживают 15—20 мин при температуре 65 °С в термостате для микропробирок.

4

(Продвижение Изменения Nv 2 к ГОСТ Р 52174-2003)

6.2.2    Микроцентрифужные пробирки со смесью, приготовленной по 6.2.1, центрифугируют при комнатной температуре в настольной центрифуге по 4.8 [4] при частоте вращения 13000 минв течение 10 мин.

6.2.3    Надосадочную жидкость, полученную по 6.2.2, отбирают микродозатором (обычно по 500 мм³) и переносят в чистые микроцентрифужные пробирки, добавляют равный объем хлороформа по Г ОСТ 20015. Содержимое перемешивают на аппарате для встряхивания в течение 2 мин и центрифугируют 10 мин при частоте вращения 13000 мин^-1.

6.2.4    Верхнюю жидкую фазу из смеси, полученной по 6.2.3, аккуратно отбирают микродозатором в чистые микроцентрифужные пробирки, не захватывая промежуточную или нижнюю фазу. В пробирки добавляют два объема ЦТАБ-раствора. приготовленного по 6.1.7. аккуратно перемешивают, переворачивая пробирки вручную, и выдерживают 60 мин при комнатной температуре.

6.2.5    Смесь, полученную по 6.2.4, центрифугируют 5 мин при частоте вращения 13000 мин'¹. Надосадочную жидкость тщательно удаляют микродозатором, а осадок растворяют в 350—600 мм³ (в зависимости от объема осадка) разведенного раствора NaCI. приготовленного по 6.1.8, добавляют равный объем хлороформа по ГОСТ 20015, перемешивают на аппарате для встряхивания в течение 30 сек и центрифугируют 10 мин при частоте вращения 13000 мин'¹.

6.2.6    Надосадочную жидкость, полученную по 6.2.5, отбирают микродозатором и переносят в чистые микроцентрифужные пробирки, добавляют равный объем изопропилового спирта по 4.27, аккуратно перемешивают содержимое пробирок вручную и выдерживают в течение 1 часа при комнатной температуре».

Подраздел 6.2 дополнить пунктами 6.2.7—6.2.9:

«6.2.7 Смесь, полученную по 6.2.6, центрифугируют 10 мин при частоте вращения 13000 мин надосадочную жидкость аккуратно сливают, а к осадку ДНК добавляют 1 см³ 70%-ного этилового спирта, приготовпенного по 6.1.3 и охлажденного до температуры 0 °С — 4 °С, перемешивают и центрифугируют 5 мин при частоте вращения 13000 мин ‘.

6.2.8    Полученную надосадочную жидкость вновь тщательно удаляют, а осадок ДНК подсушивают при комнатной температуре до полного удаления этилового спирта, но не более 30 мин.

6.2.9    Осадок ДНК, полученный по 6.2.8. перерастворяют в 40—50 мм³ особо чистой стерильной воды. Полученный раствор ДНК используют для проведения амПЦР.

Срок хранения раствора ДНК при температуре минус 20 ’С — до одного года».

Пункт 6.3.1.1 изложить в новой редакции

«6.3.1.1 Готовят две микроцентрифужные пробирки вместимостью по 1.5 см³ и маркируют их «М1» и «М2».

В пробирку «М1» микродозатором вносят (из расчета на каждую анализируемую пробу): 2.5 мм³ 10х буфера реакционного для ПЦР по 4.32:2.5 мм³ смеси дезоксирибонуклеоэидтрифосфатов по 4.35 (14). 2 мм³ фермента Тад-лолимеразы по 4.31 (12) (концентрацией 5 Ед.акт/мм³)*, 1 мм³ флуоресцентного субстрата ФС по 4.36 [15]. а также 1 мм³ водного раствора праймеров «ПР-1» по 4.40 [19].

В пробирку «М2» микродозатором вносят (из расчета на каждую анализируемую пробу): 2,5 мм³10х буфера реакционного для ПЦР по 4.32; 2.5 мм³ смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов по 4.35 (14). 2 мм³ фермента Тад-лолимеразы по 4.31 [12] (концентрацией 5 Ед. акт/мм³)*, 1 мм³ флуоресцентного субстрата ФС по 4.36 (15). а также 1 мм³ водного раствора праймеров «ПР-2» по 4.41 (20).

Смесь разбавляют особо чистой стерильной водой до объема 20 мм³ (из расчета на одну анализируемую пробу) и осторожно перемешивают в течение 3—5 с на аппарате для встряхивания, не допуская образования пены. Общий объем реакционных смесей в микропробирках «М1» и «М2» для амПЦР готовят с учетом числа анализируемых проб и двух контрольных проб: положительный контроль (заведомо трансгенная ДНК по 4.37) и отрицательный контроль (заведомо нетрансгенная ДНК по4.38)».

Пункты 7.1.1—7.1.4 изложить в новой редакции; дополнить пунктами — 7.1.5. 7.1.6:

«7.1.1 Для каждой анализируемой пробы готовят 2 чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью 0.2 или 0.5 см³, маркируя их «N,» и «Ы₂», где N — номер анализируемой пробы.

* Срок хранения Taq-попимеразы после разведения при температуре от 2 ’С до 8 *С — не более 2 ч.

5

(Продолжение Изменения ЛЛ» 2 к ГОСТ Р 52174—2003)

7.1.2    Реакционные смеси для амПЦР «М1» и «М2», полученные no 6.3.1.1—6.3.1.2. микродозатором вносят в микроцентрифужные пробирки по 20 мм³ в каждую таким образом, чтобы смесь «М1» была распределена по пробиркам с индексом «N,». а смесь «М2» — по пробиркам с индексом «N₂».

7.1.3    Анализируемую ДНК пробы N. выделенную по 6.2, вносят микродозатором по 5 мм³ в микроцентрифужные пробирки с реакционной смесью для амПЦР по 7.1.2. маркированные, соответственно. «N,» и «N₂». При использовании амплификатора ДНК [2] без подогрева крышки в каждую микроцентрифужную пробирку с реакционной смесью вносят по 30 мм³ вазелинового масла по ГОСТ 3164 для предохранения реакционной смеси от испарения водной фазы при амПЦР. В этом случае анализируемую ДНК вносят под слой масла, в результате чего образуются водная и масляная фазы.

7.1.4    В две другие микроцентрифужные пробирки микродозатором вносят по 5 мм¹ раствора заведомо трансгенной ДНК (положительный контроль).

7.1.5    Затем еще в две другие микроцентрифужные пробирки микродозатором вносят по 5 мм³ раствора заведомо нетрансгенной ДНК (отрицательный контроль).

7.1.6    Все микроцентрифужные пробирки со смесями, подготовленными по 7.1.3—7.1.5. помещают в амплификатор ДНК и проводят амПЦР по программе, указанной в таблице 2.

Таблицэ2 — Программа проведения амПЦР

Шаг программы Температура ’С Время инкубации Число циклов 1 95 12 мин 1 2 95 30 с 55 51 30 с 72 30 с 3 72 10 мин 1

Подраздел 7.2 изложить в новой редакции:

«7.2 Гибридизация на биологическом микрочипе

7.2.1    Для проведения этапа гибридизации готовят N+2 микроцентрифужные пробирки вместимостью 0.5 или 1.5 см³ (N — количество анализируемых проб, две другие пробирки нужны для анализа положительного и отрицательного контроля).

7.2.2    В необходимое количество микроцентрифужных пробирок микродозатором вносят по 18 мм³ гибридизационного буфера 4.33 (13]. К гибридизационному буферу в пробирку «N» добавляют по 9 мм³ водной фазы ПЦР-смесей из пробирок «N,» и «N₂», полученных в результате проведения амПЦР по 7.1.6 и перемешивают в течение 20—30 с на аппарате для встряхивания по 4.10 с частотой вращения не менее 1500 мин'¹ для получения гибридизационной смеси.

7.2.3    Из каждой микроцентрифужной пробирки микродозатором отбирают по 34 мм³ гибридизационной смеси (для каждого биологического микрочипа), полученной по 7.2.2. Смесь вносят через любое из двух отверстий гибридизационной камеры, после чего оба отверстия закрывают крышкой. Гибридизацию проводят в термостате по 4.4 [3] при температуре 37 °С. Минимальное время гибридизации составляет 3 ч. Допускается гибридизация в течение ночи, но не более 16—18 ч.

7.2.4    После окончания жбридизации крышку реакционной камеры открывают и микродозатором отбирают гибридизационную смесь из камеры микрочила. В любое из двух отверстий камеры вносят 34 мм³ дистиллированной воды по ГОСТ 6709. предварительно прогретой до температуры 37 °С. Воду выдерживают в реакционной камере биологического микрочипа в течение 1 минуты, затем отбирают. Процедуру повторяют, после чего составную крышку отсоединяют от подложки. Подложку последовательно промывают дистиллированной водой по ГОСТ 6709. этиловым спиртом по 4.26. дистиллированной водой по ГОСТ 6709 и высушивают при комнатной температуре.

Схема метода идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения приведена в приложении Б».

Раздел 8 изложить в новой редакции:

6

(Продолжение Изменения Nv 2 к ГОСТ Р 52174—2003)

«8 Обработка и интерпретация результатов анализа

8.1    Результаты гибридизации регистрируют с помощью универсального аппаратно-программного комплекса для анализа биочипов (УАПК) [1]. Инсталляция и эксплуатация комплекса осуществляется в соответствии с руководством по эксплуатации УАПК.

8.2    Производят запуск программного обеспечения, поставляемого вместе с комплексом (файл imageware.exe). При запуске на мониторе появляется схема биочипа с указанием отдельных ячеек и обозначением находящихся в них зондов. Названия зондов соответствуют указанным в таблице 1 и на рисунке 1.

8.3    Биологический микрочип после проведения гибридизации, промывки, удаления гибридизацион-ной камеры, ополаскивания и высушивания помещают в держатель УАПК «лицевой» стороной (содержащей гелевые ячейки) вверх.

8.4    Нажимают пиктограмму с надписью «Пуск» в верхней части диалогового окна «Снимок». При этом происходит возбуждение флуоресценции ячеек биочипа лазерами с длиной волны 640 нм. захват флуоресцентного изображения, его обработка и выдача отчета о присутствии в исследуемом образце ДНК растительного происхождения, идентификации видоспецифичной ДНК (соя. кукуруза, картофель, рис) и наличии/отсутствии генетических элементов, используемых как детерминанты трансгеиности. Применение универсального аппаратно-программного комплекса (УАПК) для анализа биологических микрочипов [1] позволяет автоматизировать все этапы регистрации и интерпретации результатов и получать заключение о наличии/отсутствии ДНК растительного происхождения в исследуемом образце, а также о наличии/отсутствии генетических детерминант трансгенности.

8.5    Анализ биологических микрочипов с прогибридизованными ПЦР-лродуктами. полученными при амплификации ДНК. выделенной из различных образцов, начинают с регистрации и интерпретации гибри-дизационных картин положительного (заведомо трансгенной ДНК) и отрицательного контроля (заведомо нетрансгенной ДНК).

8.6    Результат анализа ДНК сои. содержащей трансгенные элементы, с использованием гибридизации на биочипе, представлен в приложении В.

8.7    В случае, если при использовании заведомо нетрансгенной ДНК регистрируют сигнал в ячейках, содержащих олигонуклеотиды, комплементарные последовательностям фрагментов векторных конструкций и маркерных генов, это свидетельствует о получении ложноположительного результата. При этом результаты анализа остальных исследуемых образцов не учитываются. Причиной может быть загрязнение (контаминация) ГМИ реактивов и/или оборудования. В этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов и оборудования раствором соляной кислоты по ГОСТ 3118 (0.1 моль/дм³). заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ. В случае отсутствия сигналов в ячейках, содержащих зонды, специфичные к различным генетическим детерминантам трансгенности. при использовании заведомо нетрансгенной ДНК. делают заключение об отсутствии контаминации и проводят анализ образцов ДНК согласно протоколу.

8.8    Отсутствие флуоресцентных сигналов в ячейках, содержащих олигонуклеотиды, специфичные к гену RBCL. при использовании нетрансгенной растительной ДНК свидетельствует о получении ложноотрицательного результата. При этом результаты анализа остальных исследуемых образцов не учитываются. Причиной могут быть потеря активности одного из компонентов реакционной смеси для амПЦР или несоблюдение условий проведения амПЦР и/или гибридизации на биологическом микрочипе. В этом случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ. Наличие сигнала в ячейках, содержащих олигонуклеотиды, специфичные к ДНК растительного происхождения, при использовании заведомо нетрансгенной ДНК. свидетельствует об эффективно проведенной амПЦР и гибридизации на биочипе. При этом анализ образцов ДНК проводят далее согласно протоколу».

Приложение Б изложить в новой редакции:

7

(Продолжение Изменения №2 к ГОСТ Р 52174-2003)

А — мультиплексная асимметричная амплификация ДНК образца «N» в двух независимых пробирках «N,» и «1Ч₂» с уникальным набором праймеров для получения преимущественно одноцепочечных флуоресцентно меченных фрагментов;

Б — гибридизация ПЦР-продуктов, полученных в независимых пробирках «N,» и «N₂» со специфическими олигонуклеотидами, иммобилизованными на биологическом микрочипе;

В — регистрация и интерпретация флуоресцентной картины гибридизации на биологическом микрочипе».

Приложение В изложить в новой редакции:

«ПРИЛОЖЕНИЕ В (обязательное)

Результат анализа ДНК сои, содержащей трансгенные элементы, с использованием гибридизации на биологическом микрочипе

(флуоресцентная картина гибридизации, полученная в результате анализа ДНК генетически модифицированной сои и распределение нормированных сигналов ячеек биолотческого микрочипа)

А Б В ® ® ® © © © © © ©@©@® ®@©@© ©@® ©© ©@ ® ©@ ® © ® • • •V ® У У Ф Ф • У ф У ф • • м 0 038 M рЮНА frteg Ml Cmlfl (Vbcd 10.11 Zmt IrtKL) 1.0T Ob) (rbcL) 0.35 SM met) 0.3? РИМА frtKAJ 1.90 Gm2 <ЛоL) 9.П ЛпТВД «оу 043 S/2 (ЛСЦ 036 0 0.» 0 0.24 Lei (Cm, 0.П Zev> (2m) 36’ JDP-OP (SC 0.49 SPS 0.45 щМ 0.54 WSp c*uv 7.И 3SS p 08’ Mil p 0.43 Ом 0.63 mJ 1.60 35$ t Ca»A' 0.61 0 042 ««St 0.46 Oaj 0.5» м £*v 039 M

Рисунок В.1

А—схема биологического микрочипа для идентификации генетически модифицированного источника растительного происхождения;

Б — гибридизационная картина на биологическом микрочипе флуоресцентных продуктов амПЦР анализируемой ДНК сои. содержащей 355-промотор. терминатор nos. Стрелками обозначены ячейки, в которых образовались совершенные гибридизационные дуплексы.

В — распределение нормированных сигналов ячеек биологического микрочипа. Жирным шрифтом выделены ячейки, в которых образовались совершенные гибридизационные дуплексы».

Приложение Г изложить в новой редакции:

9

(Продолжение Изменения No 2 к ГОСТ Р 52174-2003)

«ПРИЛОЖЕНИЕ Г (рекомендуемое)

Пример оформления протокола испытания

Наименование организации (испытательная лаборатория)

ПРОТОКОЛ ИСПЫТАНИЙ

No_от    «_»_201_г.

Даты: поступления на испытание « »_201_    г.

конца испытаний « »_201_    г.

Продукция: _Котлеты «Московские»_

Производитель сырья или продукции:    ООО    «Вымпелн_

Предьявитель сырья или продукции:_Орган    сертификации    «Биотест-М»_

Отбор проб произведен _поГОСТ 11856-89_

в соответствии с нормативным документом на соответствующую однородную группу сырья или продукции Акт отбора проб и техническое задание на испытания No 118 от 08.02.2013 Испытания проведены на основании требований ГОСТ Р 52174-2003 Номер образца: _6/кс. 7/кс. 8/кс и 9/кс_

Характеристика испытуемого образца (маркировка, вид и состояние упаковки, этикетки, штриховка): Маркировка на упаковке, информирующая о наличии в продукте ГМИ в образцах № 6/кс. 7/кс и 8/кс отсут-ствует. а в образце N9 9/кс присутствует.

Маркировка:_—_

Годен до:    —    Штриховой    код:_--_ Результаты испытаний Таблица 1— Нетрансгенные видоспецифичные последовательности

Последовательности Номер образца в/кс 7/кс 8/кс 9/кс При наличии ген RBCL + + + ♦ GM/ST1(RBCL) + + + + ZMI(RBCL) - - - - OS 1 (RBCL) - - - - ST1JRBCL) + + - - GM2(RBCL) - - + ZM/OS2(RBCL) - - - - ST2(RBCL) + + - - Lel(Gm) - - + Zein(Zm) - - - - UDP-GP (St) + + - - SPS(Os) - - - -

1