ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
МЯСО И МЯСНЫЕ ПРОДУКТЫМетод определения глюконо-8-лактона
Ихъаиие официальное
Москва
С|амдартииформ
2010
Предисловие
1 РАЗРАБОТАН Московской государственной академией нишевых производств
ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность»
2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 28 августа 1998 г. № 335
3 Настоящий стандарт представляет собой аутентичный текст международного стандарта ИСО 4133—79 «Мясо и мясные продукты. Определение содержания глкжоно-б-лактона» с дополнительными требованиями, отражающими потребности экономики страны (6.6. 6.8. 6.12. 7.1 и 9.1)
4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
5 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Январь 2010 г.
© ИПК Издательство стандартов. 1998 © СТАНДАРТИНФОРМ. 2010
Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии
ПО
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
МЯСО И МЯСНЫЕ ПРОДУКТЫ
Метод определения глюконо-б-лактона
Meat and meat products.
Method for determination of glucono-6-lactonc content
Дата введения 2000—01—01
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на мясо и мясные продукты н устанавливает метод определения глюконо-б-лактона.
2 Нормативные ссылки
ГОСТ 9793-74 Продукты мясные. Методы определения влаги
ГОСТ Р 51447-99 (ИСО 3100-1—91) Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб
3 Определение
Массовая доля глюконо-б-лактона — массовая доля глюконо-б-лактона, определенная в соответствии с настоящим стандартом и выраженная в процентах.
4 Сущность метода
Глюконо-6-лактон экстрагируют из пробы продукта, взятой на испытание, ледяным раствором хлорной кислоты. Смесь центрифугируют, фильтруют, затем проводят гидролиз глюконо-б-лактона. содержащегося в фильтрате, гидроксида калия с образованием глюконата.
Преобразуют глюконат в 6-фосфоглюконат в ходе реакции с аденозин-5-трифосфатом (АТФ) в присутствии глюконаткиназы (ГК):
ГК
глюконат + АТФ.....> 6-фосфоглюконат + АДФ.
Восстанавливают 6-фос<|х>глюконатом эквивалентное количество никотинамидадениндинук-леотидфосфата (НАДФ) в присутствии 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (6-ФГ'ДГ):
6-ФГДГ
6-фосфоглюконат + НАДФ*......> НАДФН + С02 + Н* + рибулозо-5-фосфат.
Измеряют массовую долю образовавшейся восстановленной формы никотинамидаденинди-нуклеотидфосфата (НАДФН) на спектрофотометре при длине волны 365 нм.
Издание официа.1ы«>е
5 Реактивы
Вес реактивы должны быть аналитического качества (не ниже х.ч.). Все растворы, кроме растворов неорганических соединений (5.1 и 5.2). должны храниться в закрытой посуде из темного стекла, тщательно вымытой и пропаренной или стерилизованной.
Вода, используемая для приготовления растворов ферментов, должна быть деминерализованной или бидистиллированной. полученной в стеклянном диспъътяторе.
Вода, используемая для приготовления растворов химических реагентов и подготовки проб, должна быть дистиллированной или деминерализованной.
Примечание — Однократно дистиллированная вола может содержать ионы металлов, которые снижают активность ферментов, а деминерализованная вода может содержать микроорганизмы, увеличивающие нсснсиифичсскую фоновую ферментативную активность и искажающие результаты анализа.
Препарат НАДО должен содержать не менее 90 % основного вещества.
Допускается использовать имеющиеся в продаже готовые наборы реактивов при условии соответствия их качества требованиям настоящею стандарта.
5.1 Раствор хлорной кислоты с (НСЮ4) = 0,4 моль/дм3
17,3 см' раствора хлорной кислоты массовой доли 70 % и плотности 1.67 г/см' помещают в мерную колбу вместимостью 500 см' и доводят объем раствора до метки водой.
Примечание— При использовании хлорной кислоты менывей массовой доли проводят перерасчет объема кислоты, используемого для осаждения белков.
5.2 Раствор гидроксила калия с (КОН) = 2 моль/дм3
Растворяют 56.1 г гидроксида калия в воде, доводят объем раствора до 500 см'.
5.3 Куфсрный раствор активной кислотности 8.0 pH
Растворяют 2.64 г глииилглицина (C4HsN2Oj) и 0.284 г хлорида магния гексагидрата (MgCb • 6Н20) в 150 см' воды. Устанавливают активную кислотность раствора 8.0 pH при 20 'С раствором гидроксида калия (5.2). используя для измерений pH-метр. Доводят объем раствора до
200 см5.
Раствор устойчив не менее 1 мес при температуре 4 *С.
5.4 Раствор НАДФ
Растворяют 50 мг динатриевой соли ни коти на м и ладен и иди нукл еотидфосфорной кислоты (НАДФ-№2) в 5.0 см’ воды.
Раствор устойчив не менее I мес при температуре 4 *С.
5.5 Раствор аденозин-5-трифосфата (АТФ)
Растворяют 250 мг динатриевой соли адснозин-5-трифосфорной кислоты (АТФ-Nai) и 250 мг гидрокарбоната натрия (NaHCOj) в 5.0 см3 воды.
Раствор устойчив не менее 1 мес при температуре 4 *С.
5.6 Суспензия 6-ФГДГ
Используют поставляемую в ютовом виде суспен зию 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из дрожжей, содержащую 6-ФГДГ концентрации 2.0 мг/см' и удельной активности не менее 220 Е/см', а также глюконаткиназу и НАДФН-оксидазу массовых долей не более 0.05 % каждого.
Суспензия устойчива не менее 6 мес при температуре 4 *С.
5.7 Суспензия ГК
Используют поставляемую в готовом виде суспензию глюконаткиназы из E.coli. содержащую ГК концентрации 1.0 мг/см' и удельной активности не менее 26 Е/см' и НАДФН массовой доли нс более 0.05 %.
Суспензия устойчива нс менее 6 мес при температуре 4 "С.
6 Средства контроля и вспомогательные устройства
Обычная лабораторная аппаратура, а также указанная в 6.1—6.11.
6.1 Мясорубка механическая лабораторная, снабженная перфорированной пластинкой с отверстиями диаметром не более 4 мм.
6.2 Миксер лабораторный.
6.3 Центрифуга лабораторная с пробирками номинальной вместимостью 50 или 100 см3.
112
ГОСТ Р 51197-98
6.4 Мономер или pH-метр диапазоном измерений 1 — 14 pH и допускаемой погрешностью ± 0.05 pH.
6.5 Фильтры бумажные гофрированные диаметром 15 см.
6.6 Колбы мерные вместимостью 100. 200 и 250 см' и допускаемой относительной погрешностью ± 0,2 %.
6.7 Дозаторы пинеточные объемами доз 25 и 100 см' и относительной погрешностью дозирования ± 1 %.
6.8 Пипетки градуированные вместимостью 0.01; 0.05; 0.1; 0.5 и 2.5 см3 и допускаемой относительной погрешностью ± 1 %.
6.9 Шпатели пластиковые или палочки стеклянные для перемешивания содержимого кюветы при проведении фотометрических измерений.
6.10 Спектрофотометр (фотометр) со следующими техническими характеристиками: спектральный интервал — не более 10 нм; интервал измерений оптической плотности — от 0.000 до 2.000; погрешность установки длины волны — ± 3 нм; среднее квадратическое отклонение случайной составляющей погрешности измерений — не более 0.15 %.
6.11 Кюветы фотометрические толщиной поглощающего слоя 10 мм.
6.12 Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г и допускаемой погрешностью ± 0,001 г.
7 Порядок подготовки к проведению измерения
7.1 Отбор проб — по ГОСТ Р 51447.
7.2 Пробу массой не менее 200 г. полученную из репрезентативной выборки, хранят в условиях, предотвращающих порчу и изменение состава.
8 Порядок проведения измерений
8.1 Подготовка пробы к проведению измерений
Образец пробы гомогенизируют, дважды пропуская через мясорубку (6.1) и тщательно перемешивая.
Образец хранят не более 24 ч в заполненном доверху, герметически закрытом контейнере таким образом, чтобы предотвратить порчу или изменение состава.
8.2 Навеска для проведения анализа
Взвешивают приблизительно 50 г исследуемого образца с точностью до 10 мг и помещают навеску образца в лабораторный миксер (6.2).
8.3 Приготовление зкетракта
8.3.1 К навеске образца в лабораторном миксере добавляют 100 см' охлажденного льдом раствора хлорной кислоты (5.1) и гомогенизируют.
8.3.2 Часть гомогенизата помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют 10 мин при угловой скорости 3000 мин-1, затем, осторожно отодвинув слой жира, отфильтровывают супернатант через гофрированный бумажный фильтр (6.5) в коническую колбу вместимостью 200 см3. Первые 10 см '' фильтрата выбрасывают.
8.3.3 50 см1 подготовленного раствора, который может быть слегка мутным, переносят в стаканчик вместимостью 100 см3 и доводят активную кислотность раствора до 10 pH раствором гидроксида калия (5.2).
8.3.4 Количественно переносят содержимое стаканчика в мерную колбу вместимостью 100 см' и доводят объем раствора до метки водой.
8.3.5 Раствор охлаждают в ледяной бане 20 мин и фильтруют через гофрированный бумажный фильтр (6.5). отбросив первые 10 см3 фильтрата.
8.3.6 25 см1 фильтрата переносят в мерную колбу вместимостью 250 см3 и доводят объем фильтрата до метки водой.
113
Примечание — Объем фильтрат может быть иным. Его выбирают так, чтобы концентрации D— (+)-глюконата была приблизительно 0.40 г/дм1.
8.4 Определение
8.4.1 Для проведения ферментативной реакции берут две фотометрические кюветы (6.11). в каждую из которых нинеточным дозатором (6.5) добавляют:
- 2.50 см3 буферного раствора (5.3);
- 0.10 см3 раствора НАДФ (5.4);
- 0,10 см3 раствора АТФ (5.5).
Затем в одну кювету вносят 0.20 ем3 экстракта (8.3.6). получая исследуемый раствор, а во вторую — 0,20 см1 воды, получая контрольный раствор.
В каждую кювету вносят по 0.05 см3 суспензии 6-ФГДГ (5.6) и тщательно перемешивают содержимое пластиковыми шпателями или стеклянными палочками (6.9).
Содержимое кювет выдерживают 5 мин при комнатной температуре, после чего измеряют оптические плотности относительно воздуха при длине волны 365 нм: /1, — оптическая плотность исследуемого раствора, А1к — оптическая плотность контрольною раствора.
8.4.2 В обе кюветы вносят но 0.01 см3 суспензии ГК (5.7). содержимое кювет перемешивают пластиковыми шпателями или стеклянными палочками (6.9).
Растворы выдерживают от 10 до 15 мин при комнатной температуре. Затем измеряют оптические плотности, повторяя измерения каждые 2 мин до достижения постоянных значений.
Строят фафики зависимости оптических плотностей растворов от времени и экстраполируют их на момент внесения фермента ГК (приложение Л).
Получают экстраполированные значения оптических плотностей исследуемого (4?) и контрольною (Л^) растворов.
8.5 Выполняют два параллельных определения в двух пробах из одного и того же образца (8.1).
9 Правила обработки результатов измерений
9.1 Метод расчета
Массовую долю глюконо-б-лактона в пробе X. %. вычисляют по формуле
2.96x1%.!
* х 0.2 х 1000 *
М100^).
где Д А — (Ai — А\) — (^2к — Лц)»
196.1 — молярная масса D — (+)-глюконовой кислоты;
М — массовая доля влаги в пробе, определенная в соответствии с ГОСТ 9793; т — масса навески (8.2). г;
к — микромолярный коэффициент оптической плотности НАДФН (к = 3.5 см2/мкмоль при длине волны 365 нм и к = 6.23 см2/мкмать при длине волны 340 нм);
V — объем фильтрата, взятый на определение (8.3.6). см3.
За результат измерений принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений при условии выполнения 9.2.
Результат определяют с точностью 0.01 %.
9.2 Сходимость
Относительное расхождение результатов двух параллельных определений, выпаженных в одной лаборатории, нс должно превышать 10 % среднеарифметического значения.
10 Примечания по методике
10.1 Измерение может быть проведено также при длине вашы 340 нм.
10.2 Неорганические соли (ионы фосфата, натрия, калия и аммония) могут замедлять фер-
ментативную реакцию. В таких случаях увеличивают количество фермента. Практика показывает, что мри анализе мясных продуктов, содержащих фосфаты, нет необходимости увеличивать количество добавляемого фермента.
10.3 Стабильность ютовых суспензий ферментов, как правило, гарантируется производителем в течение гарантийного срока хранения, указанного на этикетке.
Препараты ферментов и буферный раствор должны храниться в холодильнике. Кроме того, растворы ферментов необходимо держать на лабораторном столе в охлажденном состоянии, для чего их помешают в перфорированную металлическую емкость, охлаждаемую льдом.
11 Оформление результатов измерений
В отчете об испытании должны быть указаны:
- используемый метод;
- полученные результаты;
- любые условия проведения испытаний, не установленные данным стандартом и касающиеся подробностей, которые могут повлиять на конечный результат.
В отчете должны быть все данные, необходимые для полной идентификации пробы.
ПРИЛОЖЕНИЕ А (справочное)
УДК 637.5.001.4:006.354 ОКС 67.120.10 Н19 ОКСТУ 9209
Ключевые слова: мясо, мясные продукты, химический анализ, определение массовой доли, органические кислоты, глюконо-5-лактон
116
