ГОСТ Р 50929-96

ПРЕМИКСЫ

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНОВ

ГРУППЫ В

Издание официальное

ГОССТАНДАРТ РОССИИ Москва

ГОСТ Р 50929-96

Предисловие

1    РАЗРАБОТАН Акционерным обществом открытого типа «Все-российский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности» (АООТ «ВНИИКП»)

Нижегородским государственным техническим университетом

ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 4 «Комбикорма, БВД, премиксы»

2    ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 29 июля 1996 г. № 488

3    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

© ИПК Издательство стандартов, 1996

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Госстандарта России

II

Раствор хранят в прохладном, темном месте в склянке из темного стекла не более 2 мес.

5.2.2    Приготовление рабочего стандартного раствора рибофлавина

1 см³ основного стандартного раствора рибофлавина переносят в

мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят до метки дистиллированной водой, подкисленной раствором соляной кислоты с массовой долей 5 % до pH 5,5—6,0,

В 1 см³ раствора содержится 0,4 мкг рибофлавина.

Раствор готовят перед употреблением.

5.2.3    Контроль за содержанием витамина В₂ в стандартном растворе проводят по 6.2.4.

5.3    Проведение испытания

Навеску премикса массой 2—5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, приливают 75 см³ раствора соляной кислоты молярной концентрации с (HCI) = 0,1 моль/дм³, смывая частицы премикса со стенок колбы. Колбу помещают в кипящую водяную баню на 20 мин. Содержимое колбы периодически перемешивают.

После охлаждения колбы pH раствора доводят до значения 5,5—

6,0 раствором гидроокиси натрия. Затем объем в колбе доводят дистиллированной водой до метки, хорошо перемешивают и центрифугируют в течение 15 мин при 8000 об/мин.

Из полученного фильтрата готовят раствор с нужным разведением (например, 1 см³ фильтрата разводят в мерной колбе вместимостью 50 см³) и определяют интенсивность флуоресценции, помещая в одну флу-орометрическую пробирку 12—15 см³ испытуемого раствора, в другую — такое же количество рабочего стандартного раствора. Затем в эти же пробирки добавляют 2—3 раза по 0,1 г двууглекислого натрия и по 0,1 г гидросульфита натрия или 4—6 капель раствора гидроокиси натрия. Содержимое пробирок осторожно перемешивают, фильтруют, если раствор мутный, и снова измеряют интенсивность флуоресценции на приборе.

5.4    Обработка результатов испытания

Содержание витамина В, X в премиксе, г/т, вычисляют по формуле

(Л-4>- С'У - У₂ ~ (F-F_{)-m- У, ’

где А — показания флуорометра для испытуемого раствора до гашения флуоресценции;

А_х — показания флуорометра для испытуемого раствора после гашения флуоресценции;

ГОСТ Р 50929-96

С—содержание витамина В₂ в рабочем стандартном растворе, мкг/см³;

V— первоначальный объем раствора, см³;

V₂— окончательный объем разведения, см³;

F — показания флуорометра для стандартного раствора до гашения флуоресценции;

F_x — показания флуорометра для стандартного раствора после гашения флуоресценции;

т — масса навески, г;

V_x — о&ьем раствора, взятый для разведения, см³.

Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности Р = 0,95 не должны быть более 10 % относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях при доверительной вероятности Р = 0,95 расхождения не должны превышать 15 %.

6 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНОВ В, И В, ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ

Сущность метода заключается в экстракции витаминов В_х (тиамина) и В₂ (рибофлавина) из навески раствором соляной кислоты и определении их на жидкостном хроматографе со спектрофотометрическим детектором с использованием обращенно-фазного режима элюирования.

Метод применим в диапазоне содержания витамина В_х от 0,05 до 0,5 г/кг в премиксе, витамина В₂ —- от 0,1 до 2 г/кг в премиксе.

6.1 Аппаратура, материалы и реактивы

Хроматограф жидкостный с фотометрическим детектором и систематической погрешностью измерений не выше 10 %. Допускается использовать хроматографы «Цвет-306», «Цвет-3006 со спектрофотометрическим детектором» и «Милихром».

Колонка хроматографическая стальная или стеклянная высотой 150 мм и диаметром 4 мм с числом теоретических тарелок не менее 2000, заполненная сорбентом «Силасорб С-18» или «Сепарон С-18».

Спектрофотометр СФ-26 или СФ-46 (спектральный диапазон 186— 1100 нм).

3-1238

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Линейка измерительная металлическая по ГОСТ 427.

Секундомер механический по нормативному документу [15] Сорбент «Силасорб С-18» зернением 7 мкм. pH-метр по нормативному документу [8]

Мешалка магнитная ММ-5.

Центрифуга лабораторная ЦЭ-2 с числом оборотов 6000 в мин. Иономер ЭБ-74 со стеклянным электродом ЭСЛ-62-07. Микрошприц МШ-10 или микропипетка МП-2.

Колбы конические со шлифом вместимостью 100 см³ по ГОСТ 25336.

Колбы мерные 2-25(50, 100, 200)-1(2) по ГОСТ 1770.

Воронка ВФ-1-56(75)ХС или ВФ-2-75(110)ХС со стеклянным фильтром ПОР 100 по ГОСТ 25336.

Пипетки градуированные 6(7)-1(2)-10 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Ацетонитрил по нормативному документу [7]

Натрия октилсульфонат, хроматографически чистый (изготовление Германия, фирма Pylver)

Триэтиламин, перегнанный по нормативному документу [4] Кислота ортофосфорная по ГОСТ 6552.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, концентрированная и раствор молярной концентрации с(НС1) = 0,01 моль/дм³.

Витамин В₂ по нормативному документу [11]

Витамин В₁ по нормативным документам [16, 17]

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечания

1    Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.

2    Все реактивы должны быть квалификации х. ч. или ч. д. а.

6.2 Подготовка к испытанию

6.2.1    Приготовление элюента

Для приготовления 1 дм³ элюента смешивают 120 см³ ацетонитрила с 880 см³ дистиллированной воды, добавляют 2,5 см³ триэтиламина, 0,5 г октил сульфоната натрия и приливают ортофосфорную кислоту до pH 7,6 по pH-метру. Полученную смесь фильтруют через стеклянный фильтр для удаления механических примесей.

Срок хранения элюента — не более 1 мес.

6.2.2    Приготовление раствора-экстрагента

10

ГОСТ Р 50929-96

К1 дм³ дистиллированной воды прибавляют 0,8 см³ концентрированной (37 %-ной) соляной кислоты, pH раствора 2±0,2.

6.2.3    Приготовление основных стандартных растворов витаминов

^В\ и В_г

Для приготовления основных стандартных растворов витаминов В_: и В₂ берут навески 0,1 г тиаминхлорида и 0,01 г рибофлавина. Навеску тиаминхлорида растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 см³, а рибофлавина — в мерной колбе вместимостью 200 см³, при нагревании до температуры 70—80 °С и доводят дистиллированной водой до метки. Полученные растворы содержат в 1 см³ 1 мг витамина В_: и 0,05 мг витамина В₂ соответственно.

Срок хранения основных стандартных растворов витаминов Bj и В₂ — не более 2 недель в холодильнике.

6.2.4    Контроль за содержанием витаминов В₁и В₂в основных стандартных растворах

Контроль за содержанием витаминов в основных стандартных растворах осуществляют спектрофотометрически по значениям молярных коэффициентов светопоглощения.

Для этого основные стандартные растворы разбавляют дистиллированной водой в 50 раз и измеряют оптическую плотность растворов на спектрофотометре в кювете толщиной поглощающего свет слоя 1 см.

Массовую концентрацию витаминов В, и В₂ с рассчитывают по формуле

50 D

с =-,

Е-1

где D — оптическая плотность;

Е — молярный коэффициент;

/ — толщина слоя раствора, 1 см.

Массовую концентрацию витаминов В₁с₁я В₂ с₂, мг/см³, рассчитывают соответственно по формулам:

3*

50 D

где 205 — молярный коэффициент светопоглощения тиаминхлорида при рабочей длине волны 268 нм;

324 — молярный коэффициент светопоглощения рибофлавина при рабочей длине волны 445 нм.

6.2.5 Приготовление рабочего стандартного раствора витаминов В₁ и В₂

Йз основных стандартных растворов готовят рабочие стандартные растворы с содержанием витаминов В_г — 0,02 мг и В₂ — 0,025 мг в 1 см³.

Для этого в мерную колбу вместимостью 50 см³ помещают 1 см³ основного стандартного раствора тиаминхлорида (6.2.3) и 25 см³ основного стандартного раствора рибофлавина (6.2.3), доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

Рабочий стандартный раствор готовят в день испытаний.

6.3 Проведение испытания

6.3.1 Экстракция витаминов В_х и В₂

Навеску премикса массой 1 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 см³ и приливают 10 см³ раствора соляной кислоты молярной концентрации с (НС1) = 0,01 моль/дм³. Колбу ставят на магнитную мешалку с включением нагрева. Перемешивание и нагрев осуществляют в течение 10 мин. Полученную суспензию переливают в центрифужную пробирку и центрифугируют при 5000— 6000 об/мин в течение 3 мин. Центрифугат сливают в мерную колбу вместимостью 25 см³. Коническую колбу с остатком раствора смывают небольшим количеством (около 5 см³) раствора соляной кислоты молярной концентрации с (НС1) = 0,01 моль/дм³, сливают раствор в центрифужную пробирку и снова центрифугируют. Центрифугат соединяют с первым в той же мерной колбе. Промывание центрифугированием повторяют 3—4 раза, каждый раз сливая промывные воды в ту же колбу. После этого раствор в мерной колбе доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтруют или дополнительно центрифугируют для очищения от механических примесей и взвешенных частиц. Приготовленный раствор используют для хроматографического анализа.

12

ГОСТ Р 50929-96

6.3.2 Хроматографирование

Хроматографирование осуществляют в следующих условиях. Разделение проводят на колонке 4 х 150 мм, заполненной сорбентом (6.2.4).

Подвижная фаза — элюент (6.2.1).

Рабочая длина волны спектрофотометрического детектора хроматографа 254 нм. Скорость элюирования — 1,2 см³/мин. Время удерживания для витамина составляет 6 мин, а для витамина В₂ — 8 мин. Объем загрузки анализируемого раствора — 10 мкдм³. Для насыщения колонки в начале работы производится 3—5 загрузок, отмечая высоты пиков. При достижении постоянной высоты можно приступить к испытаниям. Анализируемые растворы хроматографируют каждый по три раза в одинаковых условиях. В этих же условиях хроматографируют рабочие стандартные растворы витаминов В_: и В,.

Измеряют высоты пиков, как расстояние от вершины пика до линии проведенной в основании пика (приложение А, рисунок А.1 и приложение Б, рисунок Б.1).

6.4 Обработка результатов испытания

Содержание витаминов В₁ и В, Х_х и Х₂ в премиксе, г/т, вычисляют по формуле

где h_x — высота пика витамина на хроматограммах экстракта из премикса, мм;

Сст ~ массовая концентрация витамина в рабочем стандартном растворе, мг/см³;

К — объем премикса с экстрактом, см³;

h_cm — высота пика витамина на хроматограммах рабочего стандартного раствора, мм;

т — масса навески премикса, г.

Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности Р = 0,95 не должны быть более 10 % относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лаборатори-

13

ях при доверительной вероятности Р = 0,95 расхождения не должны превышать 15 %.

7 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛИНХЛОРИДА

Сущность метода заключается в экстракции холинхлорида дистиллированной водой, образовании в присутствии трехзамещенного фосфата натрия комплекса рейнеката холинхлорида и измерении интенсивности окраски его ацетоновых растворов спекгрофотометрически.

7.1 Аппаратура, материалы и реактивы

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Фотоэлекгроколориметр — ФЭК-56М, КФКили спектрофотометр типа СФ-26.

Насос вакуумный по ГОСТ 25336.

Центрифуга ОПН-8.

Колбы конические вместимостью 50—100 см³ по ГОСТ 25336.

Эксикатор вакуумный по ГОСТ 25336.

Стаканы химические вместимостью 200—250 см³ по ГОСТ 25336.

Баня водяная.

Колбы конические с притертой пробкой вместимостью 100 и 250 см³ по ГОСТ 25336.

Воронка ВФО-40-ПОР-16 (Шотга№ 2) по ГОСТ25336.

Аппарат для встряхивания жидкости типа АВУ-1.

Колбы мерные 2-25(100)-1(2) по ГОСТ 1770.

Пипетки градуированные 4(5)-1(2)-2, 6(7)-1(2)-5(10, 25) по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.

Цилиндр мерный 1(2,3, 4)-100 по ГОСТ 1770.

Фильтры обеззоленные (синяя лента) по нормативному документу [3].

Холинхлорид кристаллический по нормативному документу [18].

Спирт этиловый по ГОСТ 18300.

Натрий фосфорнокислый 12-водный по ГОСТ 9337, раствор с массовой долей 0,1 %.

Ацетон по ГОСТ 2603.

Спирт изопропиловый по нормативному документу [1].

Рейнекат аммония по нормативному документу [5].

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

14

ГОСТ Р 50929-96

Примечания

1    Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.

2    Все реактивы должны быть квалификации х. п. или ч. д. а.

7.2 Подготовка к испытанию

7.2.1    Приготовление осаждающего реактива

2 г рейнеката аммония растворяют в 100 см³ этилового спирта в конической колбе при нагревании на водяной бане при температуре (40±2) °С в течение 20 мин. После охлаждения раствор фильтруют через обеззоленный складчатый фильтр. Раствор готовят в день определения.

7.2.2    Приготовление стандартного раствора холинхлорида

ОД г кристаллического холинхлорида высушивают до постоянной массы в вакуум-эксикаторе и растворяют его в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 см³. Доводят до метки дистиллированной водой. Стандартный раствор содержит 1 мг холинхлорида в 1 см³.

Допускается приготовление стандартного раствора из 70 %-ного раствора холинхлорида с пересчетом на 100 %-ную активность.

7.2.3    Построение градуировочного графика

В 5 конических колб вместимостью 50 см³ помещают 1,2, 5, 7, 10 см³ стандартного раствора холинхлорида соответственно добавляют 10 см³ раствора фосфата натрия и 5 см³ раствора рейнеката аммония и далее проводят все испытания по 7.2.4. Интенсивность окрашенных растворов измеряют на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром или спектрофотометре при длине волны 526 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм относительно ацетона и на основании его показаний строят градуировочный график.

7.2.4    Проведение испытания

Навеску премикса массой 1—5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, вносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, приливают 50 см³ дистиллированной воды, нагревают до 80 °С и встряхивают на аппарате 15 мин. Охлаждают колбу, объем доводят до метки дистиллированной водой и фильтруют через обеззоленный складчатый фильтр в стакан. Отбирают 5—20 см³ фильтрата в колбу с притертой пробкой, приливают 10 см³ раствора фосфорнокислого натрия и 5 см³ раствора рейнеката аммония. Колбу с содержимым встряхивают и оставляют на 2 ч при температуре 4 °С. После выпадения кристаллов холинхлорида раствор фильтруют на воронке Шотта № 2 с асбестовым слоем, используя вакуумный насос. Кристаллы, оставшиеся на фильт-

15

ре, промывают 4—5 порциями (по 5 см³) охлажденною изопропилового спирта (спирт хранится в холодильнике до полного использования). Меняют колбу и растворяют кристаллы ацетоном, приливая его в три приема по 7 см³, каждый раз осторожно размешивая верхний асбестовый слой с осадком.

Содержимое колбы фильтруют в мерную колбу вместимостью 25 см³. Объем доводят в колбе ацетоном до метки. Интенсивность окрашенных растворов измеряют на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром или спектрофотометре при длине волны 526 нм в кюветах толщиной поглощающего свет слоя 10 мм относительно ацетона.

7.3 Обработка результатов испытания

Содержание 70 %-ного холинхлорида Xв премиксе, г/т, рассчитывают по формуле

_v_ К 1,43 V л —-,

m-V|

где К — масса холинхлорида, найденная по градуировочному графику, мм;

1,43 — коэффициент пересчета на 70 %-ный раствор холинхлорида;

V    — общий объем экстракта, см³; т — масса навески, г;

V_I    — объем раствора, взятый на проведение анализа, см³.

Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и

округляют до целого числа.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности Р = 0,95 не должны быть более 10 % относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях при доверительной вероятности Р= 0,95 расхождения не должны превышать 15 %.

16

ГОСТ Р 50929-96

8 ОПРВДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА В.

Сущность метода заключается в кислотном гидролизе связанных форм витамина В₅ (никотиновой кислоты), очистке гидролизата, получении окрашенного раствора и колориметрическом определении в сравнении со стандартным раствором.

8.1 Аппаратура, материалы и реактивы

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Фотоэлекгроколориметр типа ФЭК-56, КФК или спектрофотометр типа СФ-26 или аналогичные с диапазоном длин волн 400—440 нм.

Баня водяная.

Баня ледяная.

Воронка Бюхнера № 3 или № 4 по ГОСТ 9147.

Палочки стеклянные.

Стакан химический вместимостью 1 и 2 дм³ по ГОСТ 25336.

Склянки из темного стекла.

Колбы конические вместимостью 250 дм³ по ГОСТ 25336.

Бюретка 1-2-25 по ГОСТ 29251 и ГОСТ 29252.

Фильтры обеззоленные (красная и синяя ленты) по нормативному документу [3].

Колбы мерные 2-100(500, 1000)-1(2) по ГОСТ 1770.

Воронки стеклянные по ГОСТ 25336.

Пипетки 1(2, 4, 5)-1(2)-1(2), 6(7)-1(2)-5(10, 25) по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.

Пробирки с притертой пробкой вместимостью 15 см³ по ГОСТ 1770.

Цилиндры мерные 1(2, 3, 4)-50(100, 500) по ГОСТ 1770.

Бром по ГОСТ 4109.

Калий роданистый по ГОСТ 4139 или аммоний роданистый по ГОСТ 27067, растворы с массовыми долями 1 и 10 %.

Кальций углекислый по ГОСТ 4530.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор молярной концентрации с(НС1) = 0,5 моль/дм³ (0,5 н.).

Кислота серная по ГОСТ 4204, растворы с молярными концентрациями с(V₂ H₂S0₄)~2 моль/дм³ и с (У₂ H₂SO₄)-10 моль/дм³.

Витамин В₅ по нормативному документу [12].

Метол по ГОСТ 25664, раствор с массовой долей 6 %.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, растворы молярных концентра-

17

ГОСТ Р 50929-96

Содержание

1    Область применения............... 1

2    Нормативные ссылки............... 1

3    Отбор проб.................. 3

4    Определение витамина В₁.............3

5    Определение витамина В₂.............7

6    Определение витаминов и В₂ высокоэффективной жидкостной хроматографией..............9

7    Определение холинхлорида.............14

8    Определение витамина В₅.............17

9    Определение витамина В₅ высокоэффективной    жидкостной

хроматографией.................21

10    Требования техники безопасности..........30

Приложение А Хроматограмма экстракта из премикса    ...    31

Приложение Б Хроматограмма смеси витаминов В, и В-    .    .    .    32

1

Приложение В Хроматограмма экстракта витамина В₅ из премикса ................33

Приложение Г Хроматограммы растворов витамина В₅    .    .    .    .    34

Приложение Д Библиография............35

Ш

ций с (NaOH) = 4 моль/дм³ и с (NaOH) = 10 моль/дм³.

Спирт этиловый по ГОСТ 18300.

Уголь активный по ГОСТ 6217.

Фенолфталеин по нормативному документу [6]

Цинк сернокислый по ГОСТ 4174, раствор с массовой долей 80 %.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечания

1    Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.

2    Все реактивы должны быть квалификации х. ч. и ч. д. а.

8.2 Подготовка к испытанию

8.2.1    Перекристаллизация метола

500 см³ раствора серной кислоты молярной концентрации с (У, H,S0₄) = 0,1 моль/дм³ нагревают до кипения, добавляют 100 г метола и снова доводят до кипения. Если раствор сильно окрашен, к нему добавляют 10 г активного угля. Кипящий раствор быстро фильтруют через предварительно нагретую (кипящей водой) воронку Бюхнера, фильтрат переносят в большой химический стакан, приливают 0,7 дм³ этилового спирта (96°), размешивают, помещают в ледяную баню и оставляют на несколько часов в темном месте.

Выпавшие в осадок кристаллы отфильтровывают на воронке Бюхнера, промывают на фильтре 2—3 раза этиловым спиртом, порциями по 30—40 см³ и высушивают на воздухе в темном месте.

Подготовленный метол хранят в склянке из темного стекла в холодильнике до полного использования.

8.2.2    Приготовление раствора метола

Навеску перекристаллизированного метола массой (8±0,002) г вносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят объем до метки раствором соляной кислоты молярной концентрации с (НС1) = = 0,5 моль/дм³. Раствор готовят перед употреблением.

8.2.3    Приготовление бромной воды

В темную склянку с притертой пробкой 100 см³ дистиллированной воды, добавляют в вытяжном шкафу 4—5 см³ брома, хорошо встряхивают и оставляют на 1—3 сут для лучшего насыщения воды бромом. Бромную воду охлаждают в емкости со льдом в течение 30 мин.

8.2.4    Приготовлениероданбромидногораствора

К 30 см³ охлажденной бромной воды по каплям прибавляют раствор роданистого калия или роданистого аммония с массовой долей 10 % до светло-желтого окрашивания. Затем по каплям прибавляют

18

ГОСТ Р 50929-96

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРЕМИКСЫ Методы определения витаминов группы В

Premixes. Methods for determination of vitamin В complex

Дата введения 1997—01—01

1    ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Настоящий стандарт распространяется на премиксы и устанавливает методы определения витаминов В_р B_v холинхлорида, В₅ химическими методами и высокоэффективной жидкостной хроматографией.

2    НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 61-75 Кислота уксусная. Технические условия ГОСТ 246-76 Гидросульфит натрия технический. Технические условия

ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия ГОСТ 2603-79 Ацетон. Технические условия ГОСТ 3118-77 Кислота соляная. Технические условия ГОСТ 4109-79 Бром. Технические условия ГОСТ 4139-75 Калий роданистый. Технические условия ГОСТ 4166-76 Натрий серно-кислый. Технические условия ГОСТ 4174-77 Цинк сернокислый 7-водный. Технические условия

Издание официальное

2-1238

ГОСТ 4201-79 Натрий углекислый кислый. Технические условия ГОСТ 4204-77 Кислота серная. Технические условия ГОСТ 4206-75 Калий железосинеродистый. Технические условия

ГОСТ 4234-77 Калий хлористый. Технические условия ГОСТ 4328-77 Натрия гидроокись. Технические условия ГОСТ 4530-76 Кальций углекислый. Технические условия ГОСТ 6016-77 Спирт изобутиловый. Технические условия ГОСТ 6217-74 Уголь активный древесный дробленый. Технические условия

ГОСТ 6552-80 Кислота ортофосфорная. Технические условия ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 9337-79 Натрий фосфорнокислый 12-водный. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13496.0-80. Комбикорма, сырье. Методы отбора проб ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия

ГОСТ 19908-90 Тигли, чаши, стаканы, колбы, воронки, пробирки и наконечники из прозрачного кварцевого стекла. Общие технические условия

ГОСТ 24104-88 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 25664-83 Метол (4-метиламинофенол сульфат). Технические условия

ГОСТ 26573.0-85. Премиксы. Технические условия ГОСТ 27067-86 Аммоний роданистый. Технические условия ГОСТ 29227-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 29228-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 2. Пипетки градуированные без установленного времени ожидания

2

ГОСТ Р 50929-96

ГОСТ 29251-91 Посуда лабораторная стеклянная. Бюретки. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 29252-91 Посуда лабораторная стеклянная. Бюретки. Часть 2. Бюретки без времени ожидания

3    ОТБОР ПРОБ

Отбор проб по ГОСТ 13496.0

4    ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА В,

Сущность метода заключается в извлечении витамина B_t (тиамина) из навески анализируемого продукта раствором серной кислоты, окислении его раствором железосинеродистого калия в тиохром, экстракции окисленной формы из водной фазы изобутиловым спиртом и измерении интенсивности флуоресценции.

4.1 Аппаратура, материалы и реактивы

Весы лабораторные 2-го класса точности с Наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Флуорометр Квант-7, ФАНК-1

Аппарат для встряхивания жидкости типа АВУ-1

Колбы мерные 2-50(100)-1(2) по ГОСТ 1770.

Воронки стеклянные типа В по ГОСТ 25336.

Пробирки П-1(2)-25-0,2 по ГОСТ 1770.

Шкаф сушильный с терморегулятором, обеспечивающий постоянство температуры (105±2) °С.

Воронки делительные типа ВД вместимостью 100 см³ по ГОСТ 25336.

Стаканы В-1-100ТХС по ГОСТ 25336.

Пипетки градуированные 4(5)-1(2)-1(2), 6(7)-1(2)-5(10) по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.

Цилиндры 1(2, 3, 4)-25(50, 100) по ГОСТ 1770.

Фильтры обеззоленные (красная лента) по нормативному документу [3].

Кислота серная по ГОСТ 4204, раствор молярной концентрации с (У, H₂S0₄) = 0,1 моль/дм³.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор в соотношении 1:1 (по объему) и раствор молярной концентрации с (НС1) = 0,01 моль/дм³.

J

ГОСТ Р 50929-96

Калий хлористый по ГОСТ 4234.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор с массовой долей 10 %.

Спирт изобутиловый по ГОСТ 6016.

Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166.

Калий железосинеродистый (красная кровяная соль) по ГОСТ 4206, раствор с массовой долей 1 %.

Хининсульфат или хининхлорид по нормативным документам

[9, Ю].

Тиминбромид или тиаминхлорид по нормативным документам [16, 17].

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечания

1    Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.

2    Все реактивы должны быть квалификации х. ч. или ч. д. а.

4.2 Подготовка к испытанию

4.2.1    Приготовление окислительной смеси

1 см³ свежеприготовленного раствора железосинеродистого калия смешивают с 49 см³ раствора гидроокиси натрия.

Смесь готовят в день проведения анализа.

4.2.2    Приготовление основного стандартного раствора из хининсуль-фата

10 мг хининсульфата растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см³ в растворе серной кислоты и доводят этой кислотой объем до метки. Раствор хранится не более 1 года в склянке из темного стекла.

4.2.3    Приготовление рабочего стандартного раствора хининсульфата

Рабочий стандартный раствор готовят непосредственно перед анализом. Для этого 1 см³ основного стандартного раствора (4.2.2) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят до метки раствором серной кислоты.

Концентрация хининсульфата — 1 мкг/см³.

4.2.4    Приготовление основного стандартного раствора из тиамин-бромида

Взвешивают 10 мг кристаллического тиаминбромида, предварительно высушенного в сушильном шкафу в течение 2—3 ч при температуре 100—105 °С, растворяют его в мерной колбе вместимостью 100 см³ в растворе соляной кислоты молярной концентрации

4

ГОСТ Р 50929-96

с(НС1) = 0,01 моль/дм³ и доводят этой кислотой объем до метки. Раствор содержит 100 мгтиамина в 1 см³.

Раствор хранят не более 1 мес в склянке из темного стекла в прохладном месте.

4.2.5    Приготовление рабочего стандартного раствора тиаминбро-мида

Рабочий стандартный раствор готовят непосредственно перед анализом.

1 см³ основного стандартного раствора тиаминбромида (4.2.4) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят до метки дистиллированной водой.

Концентрация рабочего стандартного раствора тиаминбромида — 1 мкг/см³.

4.2.6    Контроль за содержанием витамина В_: в стандартном растворе проводят по 6.2.4.

4.3 Проведение испытания

Навеску премикса массой 5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 5 г хлористого калия и приливают 70 см³ серной кислоты. Затем колбу с реактивами встряхивают на аппарате в течение 10 мин, доводят объем в колбе до метки раствором серной кислоты, перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр, отбросив первую порцию фильтрата. Переносят 2 см³ фильтрата в мерную колбу вместимостью 50 см³ и доводят до метки раствором серной кислоты. Отбирают 20 см³ разбавленного фильтрата и переносят в делительную воронку, куда приливают 20 см³ изобутилового спирта, тщательно перемешивают в течение 2 мин. После расслоения верхний слой сливают, а нижний — переносят в градуированную пробирку и доводят до объема 20 см³ раствором серной кислоты, перемешивают.

Из пробирки берут 8 см³ раствора в делительную воронку, приливают 6 см³ окислительной смеси (4.2.1), перемешивают, добавляют 20 см³ изобутилового спирта и встряхивают 2 мин. После расслоения нижний водный слой отбрасывают, а верхний (спиртовый) — фильтруют через обеззоленный фильтр (красная лента), пропуская через слой безводного сернокислого натрия (4—5 г) в флуорометрическую пробирку и флуорометрируют.

Для окисления стандартного раствора берут 8 см³ рабочего стандартного раствора тиамина и проводят дальнейшую его обработку, как с испытуемой пробой.

Для гашения флуоресценции в испытуемом и стандартном растворах к ним добавляют по 1—2 капли раствора соляной кислоты в соотношении 1:1 (по объему), перемешивают и измеряют остаточную флуоресценцию.

Если в качестве стандартного раствора используют раствор хи-нинсульфата (или хининхлорида), то его не окисляют и не гасят, так как он имеет одно и то же значение по флуорометру, равное 72.

По стандартному раствору хининхлорида (хининсулъфата) настраивают (по инструкции) прибор наделение прибора 80.

4.4. Обработка результатов испытания

Содержание витамина Ъ_хХв премиксе, г/т, вычисляют по формуле

_Х_{А-А,)-У-У₁-С (F-F^m* У, - У,’

где А — показание флуорометра для испытуемого раствора до гашения;

А_х — показание флуорометра для испытуемого раствора после гашения;

V — первоначальный объем раствора, см³;

V_v V₂ — разведения, см³;

С — масса витамина в стандартном растворе, мкг;

F — показания флуорометра для стандартного раствора до гашения;

F_x — показания флуорометра для стандартного раствора после гашения;

т — масса навески, г;

У_г — объем испытуемого раствора, взятый на испытание, см³.

Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности Р= 0,95 не должны быть более 10 % относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях при доверительной вероятности Р = 0,95 расхождения не должны превышать 15 %.

6

ГОСТ Р 50929-96

Примечание — При использовании в качестве стандартного раствора хининсульфата (хининхлорида) в расчетную формулу вместо выражения (F— F_r) подставляют цифру 72.

5 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА В_:

Сущность метода заключается в извлечении витамина В, (рибофлавина) из навески путем кислотного гидролиза и измерении интенсивности флуоресценции.

5.1    Аппаратура, материалы и реактивы

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом

взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Флуорометр Квант-7, ФАНК-1

pH-метр по нормативному документу [8]

Баня водяная.

Центрифуга ОПН-8

Фильтры обеззоленные (синяя лента) по нормативному документу [3].

Колбы мерные 2-50(100, 1000)-1(2) по ГОСТ 1770.

Пипетки градуированные 4(5)-1(2)-1, 6(7)-1(2)-25 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.

Цилиндры 1(2, 3, 4)-100 по ГОСТ 1770.

Кислота уксусная по ГОСТ 61.

Витамин В₂ по нормативному документу [11].

Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор с массовой долей 5 % и раствор молярной концентрации с (НС1) = 0,1 моль/дм³.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор с массовой долей 15 %.

Натрий двууглекислый по ГОСТ 4201.

Натрия гидросульфит по ГОСТ 246.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечания

1    Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с тех-ническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.

2    Все реактивы должны быть квалификации х. ч. или ч. д. а.

5.2    Подготовка к испытанию

5.2.1 Приготовление основного стандартного раствора витамина В₂

40 мг витамина В₂ растворяют в дистиллированной воде, подкисленной 10 см³ ледяной уксусной кислоты, при нагревании до 50 °С в мерной колбе вместимостью 1000 см³. Доводят объем до метки дистиллированной водой. В 1 см³ раствора содержится 40 мкг рибофлавина.

7