ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Экстрагирование нуклеиновых кислот

ПРАДУКТЫ ХАРЧОВЫЯ

Метады анал1зу для выяулення генетычна мадыф1каваных аргашзмау i вытворных прадуктау. Экстрагаванне нукпешавых мслот

(ISO 21571:2005, IDT)

Издание официальное

<лБ

Предисловие

Евразийский совет по стандартизации, метрологии и сертификации (ЕАСС) представляет собой региональное объединение национальных органов по стандартизации государств, входящих в Содружество Независимых Государств. В дальнейшем возможно вступление в ЕАСС национальных органов по стандартизации других государств.

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-97 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Порядок разработки, принятия, применения, обновления и отмены».

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН республиканским унитарным предприятием «Белорусский государственный институт метрологии» (БелГИМ) на основе собственного аутентичного перевода стандарта, указанного в пункте 4

2    ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь

3    ПРИНЯТ Евразийским советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол № 36 от 11 ноября 2009 г.)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97 Сокращенное наименование национального органа по стандартизации Армения AM Минэкономики Республики Армения Беларусь BY Госстандарт Республики Беларусь Казахстан KZ Госстандарт Республики Казахстан Кыргызстан KG Кыргызстандарт Молдова MD Молдова-Стандарт Российская Федерация RU Федеральное агентство по техническому регулированию и метрологии Таджикистан TJ Т аджикстандарт

4    Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 21571:2005 Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Nucleic acid extraction (Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Экстрагирование нуклеиновых кислот).

Международный стандарт разработан CEN/TC 275 «Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы» Европейского комитета по стандартизации (CEN) совместно с ISO/TC 34 «Пищевые продукты» Международной организации по стандартизации (ISO) в соответствии с Соглашением о техническом сотрудничестве между ISO и CEN (Венским соглашением).

Перевод с английского языка (еп).

Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, и международных стандартов, на которые даны ссылки, имеются в Национальном фонде ТИПА.

В разделе «Нормативные ссылки» и тексте стандарта ссылки на международные стандарты актуализированы.

Степень соответствия - идентичная (ЮТ)

5    ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ постановлением Госстандарта Республики Беларусь от от 24 сентября 2010 г. № 58 непосредственно в качестве государственного стандарта Республики Беларусь с 1 января 2011 г.

6    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

6    Оценка результатов

Применяемый метод экстрагирования ДНК должен обеспечивать получение нуклеиновой кислоты, качество и количество которой соответствуют требованиям последующих анализов.

Качество выделенных нуклеиновых кислот должно быть удостоверено соответствующим аналитическим методом с регистрацией и оценкой параметров, аналогичных используемым при анализе (например, если методом анализа является ПЦР, то и качество выделенных нуклеиновых кислот удостоверяется ПЦР).

Дополнительные параметры для оценки совместимости метода указаны в ISO 21569, ISO 21570 и ISO 24276.

7    Протокол испытаний

В случае представления протокола испытаний в соответствии с ISO 24276 в него должна быть включена следующая дополнительная информация о деятельности лаборатории:

-    описание происхождения проб для анализа и предварительной обработки пробы перед экстрагированием нуклеиновой кислоты;

-    размер проб для анализа, используемых для экстрагирования нуклеиновой кислоты;

-    используемый метод экстрагирования нуклеиновой кислоты;

-    любые нетипичные ситуации, наблюдаемые во время проведения испытаний;

-    любая операция, не указанная в методе или рассматриваемая как необязательная, которая может оказать влияние на результаты;

-    оценка результатов;

-    персонал.

Обработка и хранение исходных данных изложены в ISO/IEC 17025.

6

ГОСТ ИСО 21571-2009

Приложение А

(обязательное)

Методы экстрагирования ДНК

А.1 Получение применимой для ПЦР ДНК методами экстрагирования ДНК на основе фенола/хлороформа

А.1.1 Основной метод на основе фенола/хлороформа

А.1.1.1 Общие положения

Данный метод (см. [5]) применяется для экстрагирования ДНК из большой группы матриц (см. А.1.1.8).

Фенол обычно подходит для деструкции нуклеазы и денатурации белка.

При исследовании лиственной или зеленой массы растений (например, листьев цикория, высушенной люцерны) вместе с ДНК также могут соосаждаться многие ингибиторы ПЦР. По этой причине могут возникнуть трудности, связанные с повторяемостью получения ДНК, амплифицируемой в ПЦР.

С учетом агрессивных и опасных свойств фенола в качестве альтернативы целесообразно применять методы экстрагирования ДНК, основанные на ЦТАБ, и/или поливинилпирролидоне (ПВП), и/или на адсорбции диоксидом кремния.

А.1.1.2 Статус валидации

Этот метод широко применяется во всех областях биологии, агрономии и медицины на протяжении 40 лет, однако он никогда не подвергался оценке путем межлабораторных исследований для обнаружения ГМО в пищевых продуктах.

А.1.1.3 Принцип метода

Метод включает стадию лизиса (термический лизис в присутствии додецилсульфата натрия и этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) высокой концентрации) и последующее удаление загрязняющих примесей (например, липофильных молекул, полисахаридов и белков) и нукпеаз из водной фазы, содержащей ДНК, с помощью фенола и хлороформа. Заключительное осаждение этанолом концентрирует ДНК и удаляет соли и остаточный хлороформ. Критическим этапом метода является стадия лизиса [5].

А.1.1.4 Меры предосторожности

Работы с органическими реактивами необходимо выполнять в вытяжном шкафу.

А.1.1.5 Реактивы

А.1.1.5.1 Этанол, объем чистой фракции с (С₂Н₅ОН) = 96 %.

Хранить и использовать при температуре минус 20 °С.

А.1.1.5.2 Ледяная уксусная кислота (СН₃СООН).

А.1.1.5.3 Калия ацетат (С₂Н₃0₂К).

А.1.1.5.4 Соляная кислота, с (HCI) = 37 %.

А.1.1.5.5 Изоамиловый спирт [(СН₃)₂СНСН₂СН₂ОН].

А.1.1.5.6 Фенол (С₆Н₅ОН).

А.1.1.5.7 Хлороформ (СНС1₃).

А.1.1.5.8 Трис(гидроксиметил) аминометан (Трис) (С₄Нц1Ч0₃).

А.1.1.5.9 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двукалиевая соль (K₂EDTA)(CioH₁₄N₂08K₂).

А.1.1.5.10 Калия гидроксид (КОН).

А.1.1.5.11 Калия хлорид (KCI).

А.1.1.5.12 Натрия додеци л сульфат (SDS) (C₁₂H₂₅0₄SNa).

А.1.1.5.13 Протеиназа К, приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.

А.1.1.5.14 Рибонуклеаза-А, выделенная из бычьей поджелудочной железы, очищенная от ДНК, приблизительно 50 Kunitz ед./мг (50 000 ед./мг) лиофилизата.

А.1.1.5.15 Насыщенный фенол, pH > 7,8.

Используется фенол, насыщенный буфером для экстрагирования/лизиса (А.1.1.5.18), без SDS, или приготовленный в соответствии с [5] или рекомендациями изготовителя.

7

А.1.1.5.16 Смесь хлороформ - изоамиловый спирт

Смешать 24 объемные части хлороформа (А. 1.1.5.7) и 1 объемную часть изоамилового спирта (А. 1.1.5.5).

А.1.1.5.17 Смесь фенол - хлороформ - изоамиловый спирт

Смешать 1 объемную часть насыщенного фенола (А. 1.1.5.15) и 1 объемную часть смеси хлороформ - изоамиловый спирт (А.1.1.5.16).

А.1.1.5.18 Буфер для экстрагирования/лизиса концентрации компонентов с (Трис) = 0,050 моль/л, с (K₂EDTA) = 0,050 моль/л, массовая концентрация с (SDS) = 30 г/л. Довести pH до 8,0, используя HCI или КОН.

А.1.1.5.19 Буфер ТЕ, с (Трис) = 0,010 моль/л, с (K₂EDTA) = 0,001 моль/л.

Довести значение pH до 8,0, используя HCI или КОН.

А.1.1.5.20 Раствор протеиназы-К в стерильной воде, с = 20 мг/мл.

Не автоклавировать. Хранить при температуре минус 20 °С, избегать многократного замораживания и оттаивания.

А.1.1.5.21 Раствор рибонуклеазы-А, с = 10 мг/мл лиофилизата.

Хранить при температуре минус 20 °С, избегать многократного замораживания и оттаивания.

А.1.1.5.22 Раствор этанола, с (С₂Н₅ОН) = 70 %.

Хранить и использовать при температуре минус 20 °С.

А.1.1.5.23 Раствор ацетата калия, с (С₂Н₃0₂К) = 3 моль/л.

Довести значение pH до 5,2 ледяной уксусной кислотой. Не автоклавировать. При необходимости пропустить через фильтр с размером пор 0,22 мкм.

А.1.1.6 Оборудование

Используется обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.

А.1.1.6.1 Центрифуга, поддерживающая ускорение не менее 10 000 д. На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.

А.1.1.6.2 Водяная баня или инкубатор с рабочим диапазоном температур от 60 °С до 70 °С.

А.1.1.6.3 Вакуумная сушилка (при необходимости).

А.1.1.6.4 Сублимационная сушилка (при необходимости).

А.1.1.6.5 Встряхиватель, например Vortex ¹.

А.1.1.6.6 Реакционные сосуды, способные выдержать заморозку в жидком азоте.

А.1.1.7 Методика

А.1.1.7.1 Общие положения

Сразу после приготовления навески пробы из исследуемого продукта (матрицы) необходимо выполнить описанную ниже процедуру экстрагирования и очистки ДНК.

При изменении размера навески пробы требуется соответственно масштабировать массы реактивов и объемы реактивов.

А.1.1.7.2 Методика экстрагирования

Взвесить 0,25 г анализируемой пробы в микропробирке.

Добавить 1,6 мл буфера для экстрагирования/лизиса (А.1.1.5.18) и в случае необходимости (например, для проб с высоким содержанием белка) 50 мкл раствора протеиназы-К (А.1.1.5.20). Инкубировать при температуре от 60 °С до 70 °С, обычно в течение от 30 мин до 2 ч (также возможно инкубирование в течение ночи). Добавить рибонуклеазу-А (А. 1.1.5.21) до конечной концентрации 0,1 мкг/мл. Центрифугировать при ускорении 5 000 д в течение 30 мин. Извлечь образовавшийся верхний слой (супернатант) и перенести в чистую пробирку. Добавить к нему 1 объем насыщенного фенола (А. 1.1.5.15), затем осторожно и тщательно перемешать. Центрифугировать при ускорении 5 000 д в течение 15 мин, перенести верхнюю водную фазу в чистую пробирку. Добавить к верхнему слою 1 объем смеси фенол - хлороформ - изоамиловый спирт (А.1.1.5.17), затем осторожно и тщательно перемешать. Центрифугировать при ускорении 5 000 д в течение 15 мин, перенести верхнюю водную фазу в чистую пробирку. В зависимости от состава матрицы пробы данную процедуру повторяют один или несколько раз до тех пор, пока граница раздела фаз не станет четкой.

ГОСТ ИСО 21571-2009

Добавить к верхнему слою 1 объем смеси хлороформ - изоамиловый спирт (А. 1.1.5.16), затем осторожно и тщательно перемешать. Центрифугировать при ускорении 5 ООО д в течение 10 мин и перенести верхнюю водную фазу в чистую пробирку. Повторять до тех пор, пока граница раздела фаз не станет четкой. Смешать образовавшийся верхний слой с 0,1 объема раствора ацетата калия (А. 1.1.5.23) и 2,5 объема 96%-ного этанола (А. 1.1.5.1), затем тщательно перемешать, перевернув пробирки. Инкубировать в течение по меньшей мере 5 мин в жидком азоте или 1 ч при температуре минус 80 °С или всю ночь при температуре минус 20 °С. Центрифугировать при ускорении 10 000 д до 13 000 д при температуре 4 °С в течение по меньшей мере 15 мин, затем осторожно слить образовавшийся верхний слой.

Тщательно промыть осадок ДНК в пробирке после центрифугирования 2 объемами 70%-ного раствора этанола (А. 1.1.5.22). Центрифугировать при ускорении от 10 000 д до 13 000 д при температуре 4 °С в течение 15 мин, затем осторожно слить образовавшийся верхний слой. Эта стадия является особенно важной для удаления осаждающихся солей, которые могут оказать влияние на последующий анализ (например, ПЦР).

Высушить осадок в пробирке после центрифугирования и повторно растворить его в 100 мкл воды или соответствующего буфера, например буфера ТЕ (А.1.1.5.19). Полученный раствор представляет собой основной раствор ДНК. Добавить рибонуклеазу-А (А. 1.1.5.21) до конечной концентрации 0,1 мкг/мл.

А.1.1.8 Перечень примеров

Описанный метод был успешно применен для экстрагирования ДНК ² из следующих матриц: подкисленная соя, квашеные соевые бобы ², обезвоженная люцерна, детское сухое печенье ², детское молоко ², бактерии и их споры, семена ячменя, говяжий/свиной паштет ², пиво ², голубой сыр, шоколадное пирожное с орехами ², консервированная кукуруза, семена моркови, брикетированный зерновой концентрат ², сыр, нугат с курицей, листья цикория, корни цикория, печенье, глазированное шоколадом ², шоколадная паста ², печенье с корицей ², компоты, кукурузные хлопья ², дробленый рис, десертный крем ², высушенные семена гороха, кукурузное печенье, кормовой кукурузный жмых, кукурузная мука, кукурузный глютеновый корм, семена кукурузы, гранулированный корм из маниоки, мясо в муке из маниоки, мясо свежее и подвергнутое тепловой обработке ² (говядина, свинина, курица и индейка), мякоть дыни, семена дыни, рубленое мясо, ингредиенты мюсли, мюсли ², побеги золотистой фасоли ², семена овса, клубни картофеля, кормовой рапсовый жмых, глупаколца, семена рапса, колбаса (реализуемая в ломтиках ² и коктейльные сосиски ² (см. А. 1.2 для усовершенствованного метода экстрагирования), шницель, суй хой син ², суповые шарики, соевый белок в мясных продуктах ², соевый лецитин (необработанный коричневый и желтый рафинированный ²), побеги сои ², соевые напитки, соя, соевый крем, кормовой соевый жмых, соевый творог, соус для спагетти ², семена спельты, сахарная свекла (сушеный жом), сахарная свекла (свежие корнеплоды), семена сахарной свеклы, семена подсолнечника, тофу, мясистые свежие томаты, томатная паста ², семена томатов, вегетарианский рубленый шницель, вафли (с ² шоколадом и без ²), пшеничные отруби, пшеничная мука, глютеновый корм из пшеницы, семена пшеницы, крупка из твердой пшеницы, йогурт² (см. А.1.3 для усовершенствованного метода экстрагирования).

А.1.2 Метод на основе фенола/хлороформа. Процедура для заквасочных культур колбас, подвергнутых ферментации

А.1.2.1 Общие положения

Этот метод предназначен для выделения общей ДНК, включая бактериальную геномную ДНК, из колбас. Применимость метода для получения ДНК высокого качества, пригодной для специфического обнаружения рекомбинантной ДНК с использованием ПЦР, была продемонстрирована на колбасах, подвергнутых ферментации [6], а также на колбасах, подвергнутых ферментации и термической обработке, так называемых летних колбасах [7]. Кроме того, было показано, что данный метод экстрагирования пригоден для выделения общей ДНК из сливок специально для обнаружения Staphylococcus aureus в этой пищевой матрице [8]. (Перечень матриц, для которых применим этот метод, приведен в А. 1.2.8).

А.1.2.2 Статус валидации

Этот метод был проверен при межлабораторном исследовании навески пробы массой 0,4 г (см. А.1.2.9).

А. 1.2.3 Принцип метода

Метод заключается в выделении бактериальных клеток из пищевой матрицы путем гомогенизации проб колбас с последующей стадией центрифугирования. Полученный осадок содержит не только бактериальные клетки, но также и частицы мяса. Для проведения специфического лизиса бактериальных клеток их оболочки расщепляют, добавляя лизоцим. Для улучшения расщепления клеточных оболочек молочнокислых бактерий мяса может быть добавлен мутанолизин. Полный лизис клеток происходит при добавлении детергента SDS (додецилсульфата натрия) и протеиназы-К, а затем несколько раз проводится экстрагирование водной фазы фенолом и/или хлороформом. Стадия экстрагирования фенолом/хпороформом является важной для устранения любой нукпеазной активности и ингибиторов ПЦР, включая те, которые возникли из пищевой матрицы (например, гематин). Последним этапом является осаждение ДНК этанолом.

А.1.2.4 Меры безопасности

Работы с органическими реактивами должны выполняться в вытяжном шкафу.

А.1.2.5 Реактивы

А.1.2.5.1 Изопропанол [СН₃СН(ОН)СН₃].

А.1.2.5.2 Этанол, с (С₂Н₅ОН) = 96 %.

Хранить и использовать при температуре минус 20 °С.

А.1.2.5.3 Ледяная уксусная кислота (СН₃СООН).

А.1.2.5.4 Соляная кислота, с (HCI) = 37 %.

А.1.2.5.5 Натрия гидроксид (NaOH).

А.1.2.5.6 Изоамиловый спирт [(СН₃)₂СНСН₂СН₂ОН)].

А.1.2.5.7 Фенол (С₆Н₅ОН).

А.1.2.5.8 Хлороформ (СНС1₃).

А. 1.2.5.9 Трис(гидроксиметил) аминометан (Трис) (C₄HnN0₃).

А. 1.2.5.10 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (Na₂EDTA) (CioH₁₄N₂0₃Na₂).

А.1.2.5.11 Натрия додеци л сульфат (SDS) (C₁₂H₂₅0₄SNa).

А.1.2.5.12 Лизоцим

50 000 ед./мг белка (1 ед. будет давать ДА₄₅₀ 0,001 в минуту при pH 6,24 и температуре 25 °С, используя суспензию Micrococcus lysodeikticus в качестве субстрата, в 2,6 мл реакционной смеси при оптической длине пути 1 см).

А.1.2.5.13 Сахароза (Ci₂H₁₂0n).

А.1.2.5.14 Протеиназа-К, приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.

А. 1.2.5.15 Натрия ацетат (C₂H₃0₂Na).

А. 1.2.5.16 Насыщенный фенол

Используется фенол, насыщенный буферным раствором Трис/НС1 (pH > 7,8) или приготовленный в соответствии с [5] или рекомендациями изготовителя.

А.1.2.5.17 Смесь хлороформ - изоамиловый спирт

Смешать 24 объемные части хлороформа (А. 1.2.5.8) и 1 объемную часть изоамилового спирта (А. 1.2.5.6).

А.1.2.5.18 Смесь фенол - хлороформ - изоамиловый спирт

Смешать 1 объемную часть насыщенного фенола (А.1.2.5.16) с 24 объемными частями хлороформа (А.1.2.5.8) и 1 объемной частью изоамилового спирта (А.1.2.5.6).

А. 1.2.5.19 Раствор мутанолизина в стерильной воде, содержащий 500 или 5 000 ед./мл мутано-лизина.

Не автоклавировать. Хранить при температуре минус 20 °С, избегая многократного замораживания и оттаивания.

А.1.2.5.20 Раствор лизоцима в стерильной воде концентрацией 10 мг/мл.

Не автоклавировать. Хранить при температуре минус 20 °С, избегая многократного замораживания и оттаивания.

А.1.2.5.21 Раствор сахарозы, с (Ci₂H₂₂0n) = 400 г/л.

ГОСТ ИСО 21571-2009

А.1.2.5.22 Буферный раствор А, с (Трис) = 0,020 моль/л, с (Na₂EDTA) = 0,020 моль/л, с (NaCI) = = 0,1 моль/л.

Довести значение pH до 8,0, используя HCI или NaOH.

А.1.2.5.23 Буфер для экстрагирования/лизиса, содержащий 1 объемную часть буфера А (А. 1.2.5.22) и 1 объемную часть раствора сахарозы (А.1.2.5.21).

А.1.2.5.24 Раствор SDS, с (SDS) = 250 г/л.

А.1.2.5.25 Раствор протеиназы-К концентрацией 20 мг/мл.

Не автоклавировать. Хранить при температуре минус 20 °С, избегая многократного замораживания и оттаивания.

А.1.2.5.26 Раствор этанола, с (С₂Н₅ОН) = 70 %.

Хранить и использовать при температуре минус 20 °С.

А.1.2.5.27 Раствор натрия ацетата, с (C₂H₃0₂Na) = 3 моль/л.

Довести значение pH до 5,2 ледяной уксусной кислотой.

А.1.2.5.28 Буфер ТЕ, с (Трис) = 0,010 моль/л, с (Na₂EDTA) = 0,001 моль/л.

Довести значение pH до 8,0, используя HCI или NaOH.

А.1.2.6 Оборудование

А.1.2.6.1 Инструменты для измельчения пробы (например, скальпель)

А.1.2.6.2 Центрифуга, поддерживающая ускорение как минимум 12 000 д. На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.

А.1.2.6.3 Водяная баня или инкубатор.

А.1.2.6.4 Вакуумная сушилка (при необходимости).

А.1.2.6.5 Смеситель, например Vortex.

А.1.2.7 Методика

А.1.2.7.1 Общие положения

Сразу после приготовления навески пробы из исследуемого продукта (матрицы) необходимо выполнить описанную ниже процедуру экстрагирования и очистки ДНК.

При изменении размера навески пробы требуется соответственно масштабировать массу реактивов и объем реактивов.

А.1.2.7.2 Приготовление пробы

Измельчить колбасу, гомогенизировать и добавить к 200 - 500 мг гомогенизата 3 объема воды (до 1,5 мл). Выдержать при комнатной температуре приблизительно 10 мин.

А.1.2.7.3 Методика экстрагирования

Осторожно перенести 500 мкл водной фазы (суспензии) в новую пробирку. Центрифугировать в течение 10 мин при ускорении 12 000 д.

Отбросить образовавшийся сверху слой и повторно растворить осадок после центрифугирования в 500 мкл буфера для экстрагирования/лизиса (А. 1.2.5.23).

Добавить 50 мкл раствора лизоцима (А.1.2.5.20). Инкубировать при температуре 37 °С в течение 1 ч. Если результаты неудовлетворительные, можно добавить к лизоциму 10 ед. мутанолизина (А.1.2.5.19). Однако перед систематическим применением необходимо проверить специфичное для матрицы воздействие этой добавки.

Добавить 25 мкл раствора SDS (А.1.2.5.24) и 25 мкл раствора протеиназы-К (А.1.2.5.25), затем инкубировать в течение 10 мин при температуре 60 °С.

Добавить 1 объем смеси фенол - хлороформ - изоамиловый спирт (А. 1.2.5.18) и перемешать.

Центрифугировать смесь в течение 3 мин при ускорении приблизительно 12 000 д. Перенести верхнюю водную фазу в новую пробирку.

Добавить 1 объем смеси хлороформ - изоамиловый спирт (А. 1.2.5.17) и перемешать.

Центрифугировать смесь в течение 3 мин при ускорении приблизительно 12 000 д. Перенести верхнюю фазу в новую пробирку.

Добавить 0,1 объема раствора ацетата натрия (А. 1.2.5.27) и 1 объем изопропанола (А. 1.2.5.1). Осторожно перемешать несколько раз путем переворачивания пробирки.

Выдержать при комнатной температуре не менее 30 мин. Центрифугировать в течение 15 мин при ускорении приблизительно 12 000 д. Декантировать образовавшийся верхний слой и отбросить его.

11

Тщательно промыть осадок после центрифугирования не менее 500 мкл раствора этанола (А. 1.2.5.26), осторожно встряхивая или перемешивая. Центрифугировать смесь в течение 10 мин при ускорении приблизительно 12 000 д. Эта стадия является особенно важной для удаления осаждающихся солей, которые могут оказать влияние на последующий анализ (например, ПЦР).

Отбросить образовавшийся верхний слой.

Высушить осадок после центрифугирования и повторно растворить его в 100 мкл воды или соответствующего буфера, например буфера ТЕ (А.1.2.5.28). Полученный раствор является основным раствором ДНК.

А.1.2.8 Перечень примеров

См. таблицу А. 1.

Таблица А.1 - Перечень матриц, к которым был успешно применен данный метод

Успешно проанализированные матрицы Микроорганизм Ссылка Колбаса, подвергнутая ферментации Lactobacillus curvatus [6] Летняя колбаса (термообработанная) Lactobacillus curvatus [7] Сливки Staphylococcus aureus [8]

А.1.2.9 Валидация

Данные по валидации, приведенные в таблице А.2, были получены в результате совместного исследования, выполненного рабочей группой «Разработка методов идентификации пищевых продуктов, полученных с использованием способов генной инженерии» Комиссии Федерального управления по охране здоровья Германии для внедрения методов согласно статье 35 закона Германии о пищевых продуктах [6].

При проведении этого исследования две пробы дали ошибочные положительные результаты, вызванные, возможно, недостатками упаковки. Для данного исследования муганолизин не использовался.

Таблица А.2 - Данные по валидации

Количество участвующих лабораторий Количество проб колбасы на лабораторию Общее количество проб Количество правильно идентифицированных проб 15 10 150 148 (контрольные пробы и пробы ГМО)

А.1.3 Метод на основе фенола/хлороформа. Процедура для заквасочных культур йогурта

А.1.3.1 Общие положения

Этот метод описывает методику экстрагирования основной массы ДНК из заквасочных культур, используемых для ферментации йогурта из молочных продуктов. Эта методика успешно применяется для обычных йогуртов, включая йогурты, содержащие различные ингредиенты, такие как фрукты, добавки и стабилизаторы, а также для продуктов с различным содержанием жира (см. А. 1.3.8 и [9] - [11]). Из йогуртов, подвергнутых термической обработке [12], также экстрагируется ДНК, применимая для ПЦР.

А.1.3.2 Статус валидации

Этот метод был проверен при межлабораторном исследовании (см. А. 1.3.9).

А.1.3.3 Принцип метода

Этот метод основывается на методике экстрагирования смесью фенол - хлороформ, которая адаптирована к специальной пищевой матрице (составу) пробы. Грамположительные заквасочные культуры йогуртов концентрируются после расщепления коагулированного казеина при щелочном pH. Выделенные клетки повторно суспендируют в буферном водном растворе и обрабатывают лизоцимом (и мутанолизином) для расщепления клеточных оболочек. Лизис клеток происходит при добавлении ионного детергента, такого как додецилсульфат натрия (SDS). Белки удаляют путем обработки протеиназой-К, а затем экстрагируют смесью фенол - хлороформ и хлороформом в несколько стадий. Последней стадией является осаждение ДНК этанолом.

А.1.3.4 Меры безопасности

Работы с органическими реактивами должны выполняться в вытяжном шкафу.

ГОСТ ИСО 21571-2009

А.1.3.5 Реактивы

А.1.3.5.1 Изопропанол [СН₃СН(ОН)СН₃].

А.1.3.5.2 Этанол, с (С₂Н₅ОН) = 96 %.

Хранить и использовать при температуре минус 20 °С.

А.1.3.5.3 Ледяная уксусная кислота (СН₃СООН).

А.1.3.5.4 Хлорид натрия (NaCI).

А.1.3.5.5 Цитрат натрия (C₆H₅Na₃0₇).

А.1.3.5.6 Соляная кислота, с (HCI) = 37 %.

А.1.3.5.7 Гидроксид натрия (NaOH).

А.1.3.5.8 Изоамиловый спирт [(СН₃)2СНСН₂СН2(ОН)].

А.1.3.5.9 Фенол (С₆Н₅ОН).

А.1.3.5.10 Хлороформ (СНС1₃).

А. 1.3.5.11 Трис(оксиметил) аминометан (Трис) (C₄HnN0₃).

А.1.3.5.12 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (Na₂EDTA) (CioH₁₄N₂08Na₂).

А.1.3.5.13 Додецилсульфат натрия (SDS) (Ci₂H₂₅0₄SNa).

А.1.3.5.14 Лизоцим, 50 ООО ед./мг белка (1 ед. будет давать ЛА₄₅₀ 0,001 в минуту при pH 6,24 и температуре 25 °С, используя суспензию Micrococcus lysodeikticus в качестве субстрата, в 2,6 мл реакционной смеси при оптической длине пути 1 см).

А.1.3.5.15 Сахароза (С₁₂Н₂₂0ц).

А.1.3.5.16 Протеиназа-К, приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.

А.1.3.5.17 Ацетат натрия (C₂H₃0₂Na).

А.1.3.5.18 Раствор цитрата натрия, с (C₆H₅Na₃0₇) = 400 г/л.

А.1.3.5.19 Раствор гидроксида натрия, с (NaOH) = 0,4 моль/л.

Растворить в стерильной воде. Не автоклавировать. Перед использованием готовить свежий раствор.

А.1.3.5.20 Раствор хлорида натрия/цитрата натрия (SSC 5х, концентрированный 5-кратный основной раствор), с (NaCI) = 0,75 моль/л, с (C₆H₅Na₃0₇) = 0,075 моль/л.

Целесообразно готовить концентрированный основной раствор SSC 20х (например, 20-кратный основной раствор, так как растворы с высокой концентрацией солей обычно более устойчивы). Разбавлять перед использованием.

А.1.3.5.21 Насыщенный фенол

Используется фенол со значением pH 8 и насыщенный буфером Трис/НС1 (pH > 7,8) или, например, приготовленный в соответствии с [5] или рекомендациями изготовителя.

А.1.3.5.22 Смесь хлороформ - изоамиловый спирт

Смешать 24 объемные части хлороформа (А.1.3.5.10) и 1 объемную часть изоамилового спирта (А.1.3.5.8).

А.1.3.5.23 Смесь фенол - хлороформ - изоамиловый спирт

Смешать 25 объемных частей насыщенного фенола (А.1.3.5.21) с 24 объемными частями хлороформа (А.1.3.5.10) и 1 объемной частью изоамилового спирта (А.1.3.5.8).

А.1.3.5.24 Раствор мутанолизина в стерильной воде, содержащий 500 или 5 000 ед./мл мутано-лизина.

Не автоклавировать. Хранить при температуре минус 20 °С, избегать многократного замораживания и оттаивания.

А.1.3.5.25 Раствор лизоцима в стерильной воде, содержащий 10 мг/мл лизоцима.

Не автоклавировать. Хранить при температуре минус 20 °С, избегать многократного замораживания и оттаивания

А.1.3.5.26 Раствор сахарозы, с (Ci₂H₂₂0n) = 400 г/л.

А.1.3.5.27 Буферный раствор А, с (Трис) = 0,020 моль/л, с (Na₂EDTA) = 0,020 моль/л, с (NaCI) = = 0,100 моль/л.

Довести значение pH до 8,0, используя HCI или NaOH.

А.1.3.5.28 Буфер для экстрагирования/лизиса, содержащий 1 объемную часть буферного раствора А (А. 1.3.5.27) и 1 объемную часть раствора сахарозы (А. 1.3.5.26).

А.1.3.5.29 Раствор SDS, с (SDS) = 250 г/л.

А.1.3.5.30 Раствор протеиназы-К в стерильной воде, с = 20 мг/мл.

Не автоклавировать. Хранить при температуре минус 20 °С, избегать многократного замораживания и оттаивания.

А.1.3.5.31 Раствор этанола, с (С₂Н₅ОН) = 70 %.

Хранить и использовать при температуре минус 20 °С.

13

А.1.3.5.32 Раствор ацетата натрия, с (C₂H₃0₂Na) = 3 моль/л.

Доводят значение pH до 5,2 ледяной уксусной кислотой.

А.1.3.5.33 Буфер ТЕ, с (Трис) = 0,010 моль/л, с (Na₂EDTA) = 0,001 моль/л.

Довести значение pH до 8,0, используя HCI или NaOH.

А. 1.3.6 Оборудование

Применяется обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.

А.1.3.6.1 Центрифуга, поддерживающая ускорение не менее 12 000 д. На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.

А.1.3.6.2 Водяная баня или инкубатор.

А.1.3.6.3 Вакуумная сушилка (при необходимости).

А.1.3.6.4 Смеситель, например Vortex.

А.1.3.7 Методика

А.1.3.7.1 Общие положения

Сразу после приготовления навески пробы из исследуемого продукта (матрицы) необходимо выполнить описанную ниже процедуру экстрагирования и очистки ДНК.

При изменении размера пробы требуется соответственно масштабировать массы реактивов и объемы реактивов.

А.1.3.7.2 Методика экстрагирования

Хорошо встряхнуть или перемешать йогурт. Перенести 250 мкл йогурта в пробирку вместимостью 2 мл. Добавить 80 мкл раствора цитрата натрия (А. 1.3.5.18). Добавить 150 мкл раствора NaOH (А.1.3.5.19) и хорошо перемешать. Центрифугировать при ускорении 12 000 д в течение 2 мин.

Осадок после центрифугирования должен иметь диаметр не более 0,7 см и занимать объем не более 100 мкл. В противном случае указанные стадии (добавление 80 мкл раствора цитрата натрия и 150 мкл раствора NaOH) необходимо повторить.

Отбросить верхний слой жира и образовавшийся верхний водный слой и повторно суспендировать осадок после центрифугирования в 500 мкл раствора 5х SSC (А.1.3.5.20). Центрифугировать не менее 2 мин при ускорении около 12 000 д. Отбросить образовавшийся верхний слой. Повторно суспендировать осадок после центрифугирования в 500 мкл раствора 5х SSC. Центрифугировать в течение 2 мин при ускорении около 12 000 д. Отбросить образовавшийся верхний слой.

Повторно суспендировать осадок после центрифугирования в 500 мкл буфера для экстрагиро-вания/лизиса (А.1.3.5.28). Добавить 50 мкл раствора лизоцима (А.1.3.5.25). Инкубировать при температуре 37 °С в течение 1 ч. Если результаты неудовлетворительные, к лизоциму может быть добавлено 10 ед. мутанолизина (А.1.3.5.24). Однако перед систематическим применением необходимо проверить специфичное для матрицы воздействие этой добавки.

Добавить 25 мкл раствора SDS (А. 1.3.5.29) и 25 мкл раствора протеиназы-К (А. 1.3.5.30). Инкубировать в течение 10 мин при температуре 60 °С. Добавить 500 мкл смеси фенол - хлороформ - изо-амиловый спирт (А. 1.3.5.23) и перемешать. Центрифугировать в течение 3 мин при ускорении около 12 000 д. Перенести верхнюю водную фазу в новую пробирку. Добавить 1 объем смеси хлороформ -изоамиловый спирт (А.1.3.5.22) и перемешать. Центрифугировать в течение 3 мин при ускорении около 12 000 д.

Перенести верхнюю фазу в новую пробирку. Добавить 0,1 объема раствора ацетата натрия (А.1.3.5.32) и 1 объем изопропанола (А.1.3.5.1). Выдержать при комнатной температуре не менее 30 мин. Центрифугировать в течение 15 мин при ускорении около 12 000 д. Отбросить образовавшийся верхний слой. Тщательно промыть осадок после центрифугирования не менее 500 мкл раствора этанола (А. 1.3.5.31). Центрифугировать смесь в течение 10 мин при ускорении около 12 000 д. Эта стадия является очень важной для удаления осаждающихся солей, которые могут оказывать влияние на последующий анализ (например, ПЦР).

Отбросить образовавшийся верхний слой.

Высушить осадок после центрифугирования и повторно растворить его в 100 мкл воды или соответствующего буфера, например буфера ТЕ (А.1.3.5.33). Полученный раствор является основным раствором ДНК.

А.1.3.8 Перечень примеров

См. таблицу А.З.

Таблица А.З - Перечень матриц, к которым был успешно применен указанный метод

Успешно проанализированные матрицы Содержание, добавки и т. д. Микроорганизм Ссылка Обычный йогурт 0,3 % жира, 3,5 % жира Streptococcus thermophilus [9], [11] Фруктовые йогурты 1,5% жира, модифицированный крахмал, лесной орех, желатин 1.5    % жира, 3,8 % белка, аспартам, аце-сульфам, ананас 3.5    % жира, ароматизатор, желатин, персик, кокосовый орех 10 % жира, модифицированный крахмал, лимон, ароматизатор, миндаль, пектин, каротин, рибофлавин Streptococcus thermophilus [9] Термообработанный обычный йогурт 3,5 % жира Streptococcus thermophilus [12]

А.1.3.9 Валидация

Данные по валидации, приведенные в таблице А.4, были получены в результате совместного исследования, выполненного рабочей группой «Разработка методов идентификации пищевых продуктов, полученных с использованием способов генной инженерии» Комиссии Федерального управления по охране здоровья Германии для внедрения методов согласно статье 35 закона Германии о пищевых продуктах [11].

При проведении этого исследования две лаборатории не выполнили проверку гибридизацией. Для данного исследования мутанолизин не использовался.

Таблица А.4 - Данные по валидации

Количество участвующих лабораторий Количество проб йогурта на лабораторию Общее количество проб Количество правильно идентифицированных проб 20 10 200 200 (99 контрольных проб и 101 проба ГМО)

А.1.4 Метод на основе фенола/хлороформа. Процедура для дрожжей и/или гифомицетов, собранных из пищевых продуктов

А.1.4.1 Общие положения

Данный метод описывает одноступенчатое экстрагирование и очистку ДНК, пригодной для ПЦР, из дрожжей, гифомицетов [13] или выделенных микробных популяций. Метод применим для экстрагирования ДНК из генетически модифицированных микроорганизмов в пробах с очень сложной матрицей [14], [15]. Метод может использоваться для экстрагирования общей ДНК из матриц [14], [15] или из микробной фракции, которая непосредственно выделена из матрицы либо собрана из заква-сочных культур (колонии на жидких или агаровых средах).

Примечание- Предварительное выделение микробной фракции из пробы для анализа дает наиболее достоверные результаты при экстрагировании ДНК.

Общую ДНК из матрицы пробы допускается экстрагировать с помощью альтернативных методов, приведенных в приложении А. Однако эти методы не гарантируют, что достаточное количество ДНК будет выделено из всех микроорганизмов (особенно из грибов, устойчивых к лизису, или грамотрица-тельных бактерий). Данный метод может использоваться для экстрагирования общей ДНК из таких матриц, как йогурт, молоко или сыр. Однако было показано, что достоверное экстрагирование хорошо обеспечивается только для тонкоизмельченных или размолотых твердых матриц. В силу этого перед применением метода его эффективность необходимо всегда проверять на основной матрице исследуемой пробы.

15

ГОСТ ИСО 21571-2009

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных (государственных) стандартов, издаваемых в этих государствах.

© Госстандарт, 2010

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания на территории Республики Беларусь без разрешения Госстандарта Республики Беларусь

А.1.4.2 Статус валидации

Этот метод экстрагирования ДНК был применен и проверен [13] на 25 родах грибов, представляющих 325 видов (включая дрожжи, используемые в хлебопекарном производстве или виноделии, и Penicillia spp. [16], используемые производителями голубого сыра), в форме мицелия и спор (среди которых виды, наиболее устойчивые к разрыву или лизису, например Aspergillus fumigatus и Cryptococcus neoformans). Данный метод был разработан таким образом, чтобы избежать лабораторного загрязнения и загрязнения между пробами. Такое свойство метода позволяет применять его для проведения систематических экстрагирований ДНК и ПЦР в больших объемах. При применении метода не было обнаружено изменений качества матрицы при качественной ПЦР после долгосрочного хранения при температуре минус 20 °С в течение 5 лет или между различными препаратами ДНК из одного и того же организма. Несмотря на то, что качество экстрагированной данным методом ДНК подходит для качественной ПЦР, она может подвергаться недостаточному расщеплению в процессе рестрикционного анализа. Однако для использования ДНК, экстрагированной данным методом, для количественной ПЦР необходимо выполнить процедуру ее дополнительной очистки с применением другого метода, например такого, который описан в А.4.

Этот метод, примененный к микробным осадкам после центрифугирования и мицелиальной пленке, был подвергнут межлабораторной проверке [17].

А.1.4.3 Принцип метода

Как правило, бактерии, дрожжи или мицелий разрушаются и ДНК одновременно экстрагируется при перемешивании с высокой скоростью в присутствиии стеклянных шариков в смеси трис - фенол -хлороформ - EDTA - SDS, а затем осаждается этанолом.

А.1.4.4 Меры безопасности

Работы с органическими реактивами должны выполняться в вытяжном шкафу.

А.1.4.5 Реактивы

А.1.4.5.1 Этанол, с (С₂Н₅ОН) = 96 %.

Хранить и использовать при температуре минус 20 °С.

А.1.4.5.2 Ледяная уксусная кислота (СН₃СООН).

А.1.4.5.3 Серная кислота, с (H₂S0₄) > 90 %.

А.1.4.5.4 Бикарбонат калия (КНС0₃).

А.1.4.5.5 Ацетат калия (С₂Н₃0₂К).

А.1.4.5.6 Соляная кислота, с (HCI) = 37 %.

А.1.4.5.7 Изоамиловый спирт [(СН₃)₂СНСН₂СН₂ОН].

А.1.4.5.8 Фенол (С₆Н₅ОН).

А.1.4.5.9 Хлороформ (СНС1₃).

А. 1.4.5.10 Трис(оксиметил) аминометан (Трис) (C₄HnN0₃).

А.1.4.5.11 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (Na₂EDTA) (CioH₁₄N₂0₃Na₂).

А. 1.4.5.12 Гидроксид калия (КОН).

А.1.4.5.13 Додецилсульфат натрия (SDS) (C₁₂H₂₅0₄SNa).

А.1.4.5.14 Рибонуклеаза-А, выделенная из бычьей поджелудочной железы, свободная от дезоксирибонуклеазы, приблизительно 50 Kunitz ед./мг лиофилизата.

А.1.4.5.15 Насыщенный фенол, pH > 7,8.

Используют фенол (А.1.4.5.8), приготовленный в соответствии с [5] или (по выбору) полностью насыщенный буфером для экстрагирования (А. 1.4.5.18) без SDS или в соответствии с рекомендациями изготовителя.

А.1.4.5.16 Смесь хлороформ - изоамиловый спирт

Смешать 24 объемные части хлороформа (А.1.4.5.9) с 1 объемной частью изоамилового спирта (А.1.4.5.7).

А.1.4.5.17 Смесь фенол - хлороформ - изоамиловый спирт

Смешать 1 объемную часть насыщенного фенола (А. 1.4.5.15) с 1 объемной частью смеси хлороформ - изоамиловый спирт (А. 1.4.5.16).

А.1.4.5.18 Буфер для экстрагирования/лизиса, с (Трис) = 0,050 моль/л, с (K₂EDTA) = 0,050 моль/л, с (SDS) = 30 г/л.

Довести значение pH до 8,0, используя HCI или NaOH.

ГОСТ ИСО 21571-2009

Содержание

Введение...................................................................................................................................................V

1    Область применения..............................................................................................................................1

2    Нормативные ссылки.............................................................................................................................1

3    Принцип метода......................................................................................................................................1

4    Общие требования к лаборатории........................................................................................................2

5    Методика.................................................................................................................................................2

6    Оценка результатов...............................................................................................................................6

7    Протокол испытаний...............................................................................................................................6

Приложение А (обязательное)    Методы экстрагирования    ДНК.............................................................7

Приложение В (обязательное)    Методы количественной оценки экстрагированной ДНК................28

Библиография..........................................................................................................................................34

IV

ГОСТ ИСО 21571-2009

Введение

Исследование генетически модифицированных организмов (далее - ГМО) и производных продуктов осуществляется посредством следующих стадий, выполняемых последовательно или одновременно. После отбора проб нуклеиновые кислоты экстрагируются из навески пробы. Экстрагированные нуклеиновые кислоты далее могут быть очищены в процессе экстрагирования или после него. Следующими этапами являются: оценка количества экстрагированных нуклеиновых кислот (при необходимости), разведение нуклеиновых кислот (при необходимости) и выполнение аналитических процедур, например полимеразной цепной реакции (далее - ПЦР). Указанные этапы подробно изложены в настоящем стандарте и следующих международных стандартах:

-    ISO 21568 «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Отбор проб»;

-    ISO 21569 «Продукты пищевые. Методы анализа на обнаружение генетически модифицированных организмов и их производных продуктов. Качественные методы, основанные на нуклеиновой кислоте»;

-    ISO 21570 «Продукты пищевые. Методы анализа на обнаружение генетически модифицированных организмов и их производных продуктов. Количественные методы, основанные на нуклеиновой кислоте».

Дополнительная информация об общих требованиях и определениях, относящихся к упомянутым выше этапам, приведена в ISO 24276 «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Общие требования и определения».

V

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов

и производных продуктов.

Экстрагирование нуклеиновых кислот

ПРАДУКТЫ ХАРЧОВЫЯ Метады анал1зу для выяулення генетычна мадыфкаваных аргашзмау i вытворных прадуктау. Экстрагаванне нуклешавых к1слот

Foodstuffs

Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products.

Nucleic acid extraction

Дата введения 2011-01-01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает общие требования и специфические методы экстрагирования, очистки и количественной оценки дезоксирибонуклеиновой кислоты (далее - ДНК). Эти методы изложены в приложениях А и В.

Настоящий стандарт разработан для пищевых матриц, но может быть также применен к другим матрицам, например зерновым культурам и кормам.

Настоящий стандарт следует применять совместно с ISO 21569, ISO 21570 в части аналитических методов на основе нуклеиновых кислот, в частности качественных аналитических методов, установленных в ISO 21569, и количественных аналитических методов, установленных в ISO 21570.

2    Нормативные ссылки

Для применения настоящего стандарта необходимы следующие ссылочные стандарты. Для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта.

ISO 24276:2006 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Общие требования и определения

ISO/DIS 21568:2003 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Отбор проб

3    Принцип метода

3.1 Общие положения

Основной целью применения методов экстрагирования нуклеиновых кислот является обеспечение выделения нуклеиновых кислот, пригодных для последующего анализа (см. ISO 24276).

Примечание - Качество ДНК зависит от средней длины экстрагированных молекул ДНК, химической чистоты и структурной целостности одной нити и двойной спирали ДНК (например, внутри- и межцепочечные связи оснований ДНК, выпадение оснований в цепочке ДНК, перекрестные сшивки с высокомолекулярными спиртами, ге-мином и т. д.). Кроме того, такие структурные изменения часто являются специфичными для определенной последовательности ДНК и поэтому не распределены по геному случайным образом (см. [1] - [4]).

Пользователям настоящего стандарта необходимо иметь в виду, что некоторые методы (например, методы на основе диоксида кремния) могут быть запатентованы.

Издание официальное

3.2    Экстрагирование ДНК

Основной принцип экстрагирования ДНК заключается в выделении ДНК, присутствующей в матрице пробы, а затем одновременной или последующей очистке ДНК от ингибиторов ПЦР.

Методы экстрагирования и очистки ДНК изложены в приложении А. Выбор метода основывается на опыте пользователя с учетом области применения и примеров матриц, которые указаны в каждом методе.

Альтернативные методы могут применяться при условии, что метод был проверен на соответствующей матрице, подлежащей исследованию.

3.3    Количественная оценка содержания ДНК

Количественная оценка экстрагированной ДНК может потребоваться для последующего анализа ПЦР.

Такая оценка может выполняться либо физическими (например, измерением поглощения на специфической длине волны), физико-химическими (например, применением интеркалирующих или связующих агентов, обладающих флюоресцентными свойствами), ферментативными (например, биолю-минесцентным обнаружением) методами, либо путем количественной ПЦР. Последний метод применяется для составных и сложных матриц, проб с низким содержанием ДНК или проб, в которых ДНК подверглась деградации.

Существует несколько методов, применяемых для определения количества ДНК, присутствующей в растворе. Эти методы изложены в приложении В.

Выбор наиболее подходящего метода осуществляется пользователем в зависимости от количества и качества ДНК, подлежащей количественному определению, а также от матрицы, из которой была экстрагирована ДНК.

Альтернативные методы могут применяться при условии, что метод был проверен на соответствующей матрице.

4    Общие требования к лаборатории

Вследствие воздействия пыли и распыляемых аэрозолей может происходить случайная контаминация ДНК, поэтому организация рабочих мест в лаборатории основывается на строгом соблюдении:

-    последовательности всех установленных методологических этапов, используемых для получения промежуточных и конечных результатов;

-    принципа «прямого потока» при обращении с пробами.

Использование последнего принципа гарантирует, что ДНК, подлежащая анализу, и амплифици-рованная ДНК, полученная в результате ПЦР, остаются физически разделенными.

Дополнительные требования к лабораториям приведены в ISO 24276.

5    Методика

5.1    Приготовление пробы для анализа

5.1.1    Общие положения

Специфические параметры анализируемого продукта (например, влажность) и его обработка могут влиять на количество и качество ДНК, экстрагируемой из анализируемого продукта. В связи с этим рабочие характеристики применяемого метода экстрагирования ДНК зависят от матрицы анализируемого продукта.

Необходимо принять соответствующие меры, чтобы гарантировать, что навеска пробы является представительной лабораторной пробой.

Навеска пробы должна быть достаточного размера (объема, массы) и содержать достаточное количество частиц для обеспечения представительности лабораторной пробы (например, 3 ООО частиц для предела обнаружения LOD 0,1 %), возможности проведения дальнейшего статистического анализа и получения статистически обоснованного вывода по результатам анализа (см. ISO/DIS 21568).

Исходя из практических и технических соображений не рекомендуется, чтобы величина навески пробы превышала 2 г.

Любые ограничения, связанные с размером навески пробы, не позволяющие рассматривать ее как представительную пробу, должны быть учтены при интерпретации аналитических результатов и указаны в протоколе испытаний.

ГОСТ ИСО 21571-2009

Методы экстрагирования ДНК, приведенные в приложении А, устанавливают размер навески пробы от 200 до 500 мг, что обычно является приемлемым для продукции с высоким содержанием ДНК (твердое и дробленое зерно, мука). Однако некоторые продукты содержат очень малое количество ДНК или деградировавшую ДНК, в связи с этим указанная навеска пробы не позволит экстрагировать достаточное для анализа количество ДНК. В таких случаях размер навески пробы может быть увеличен.

Экстрагирование ДНК должно выполняться не менее чем из двух навесок пробы одной и той же продукции.

Хранение стандартов, лабораторных проб и навесок проб должно соответствовать требованиям ISO 24276 и быть организовано таким образом, чтобы анализируемые биохимические параметры были сохранены (подробнее см. ISO/IEC 17025).

5.1.2 Пробы

Все операции по приготовлению лабораторных проб (например, измельчение, гомогенизация, деление, высушивание) должны выполняться в соответствии с методиками, описанными в ISO 24276. При выполнении всех необходимых операций должны быть приняты меры предосторожности для защиты лабораторной пробы от загрязнения или изменения ее состава.

Лабораторные пробы должны быть тщательно гомогенизированы перед их сокращением и отбором навесок пробы.

В случае жидких проб необходимо встряхивать сосуд с пробой для обеспечения гомогенизации продукта. В случае негомогенных продуктов типа неочищенных масел необходимо убедиться, что осадок и все нерастворимые составляющие полностью удалены со стенок сосуда.

В случае проб с твердыми матрицами, отличающимися затрудненным измельчением, лабораторная проба должна быть измельчена для уменьшения размера частиц и/или улучшения экстрагирования ДНК. В таких случаях особое внимание необходимо обратить на размер частиц. Навеска пробы, подвергаемая экстрагированию, должна содержать минимальное количество частиц, как установлено в ISO/DIS 21568. Необходимо, чтобы оборудование, предназначенное для дробления и измельчения пробы, было легко моющимся по всей рабочей поверхности и обеспечивало требуемое количество и размер частиц (гранулометрический состав) анализируемой пробы согласно ISO/DIS 21568.

Если какие-либо компоненты лабораторной пробы были удалены до проведения экстрагирования, то это должно быть указано в протоколе испытаний с описанием проведенных операций.

Для твердых или пастообразных готовых пищевых продуктов с высоким содержанием липидов достаточно трудно достичь требуемого размера частиц за один этап измельчения. В таких случаях допускается перед измельчением применять дополнительные процедуры, такие как удаление липидов гексаном после промежуточного измельчения, замораживание или сублимационная сушка.

Для улучшения измельчения пастообразных или вязких продуктов для некоторых матриц можно использовать одну из следующих обработок:

-    нагрев до максимальной температуры 40 °С;

-    растворение в соответствующей жидкости, например воде;

-    замораживание при температуре минус 20 °С или ниже.

Гомогенизировать необходимо всю лабораторную пробу. Затем необходимо отобрать две навески пробы с учетом возможного проведения в дальнейшем процедур разбавления или концентрирования.

Во время проведения процедур размола и измельчения необходимо соблюдать меры, гарантирующие поддержание нагрева лабораторной пробы на минимальном уровне и не допускающие ее сильного нагревания, так как нагрев может отрицательно воздействовать на качество экстрагируемой ДНК.

По возможности необходимо избегать способов размола/измельчения, при которых возникает высокий риск перекрестного загрязнения (например, комбинированное использование жидкого азота и ступки, а также использование одной ступки для разных образцов). Одним из основных требований является необходимость изолирования любого методологического этапа, при проведении которого происходит образование пыли, от всех других аналитических этапов и процедур.

В случае присутствия в лабораторной пробе соли, сахарной пудры, специй и/или других веществ, которые могут потенциально оказывать влияние на экстрагирование или дальнейший аналитический метод, должны быть предприняты дополнительные соответствующие процедуры очистки в соответствии с используемым методом (см. приложение А).

Например, в случае проб сложного состава материал для исследования (матрица) (например, панировочный слой рыбных палочек) может быть отделен от остальной части продукта для экстрагирования ДНК.

3

5.2 Экстрагирование и очистка ДНК

5.2.1    Общие положения

При разработке методов экстрагирования необходимо учитывать следующие требования.

Качество и количество экстрагируемой нуклеиновой кислоты при использовании заданного метода на заданной матрице пробы должны быть как повторяемыми, так и воспроизводимыми при условии содержания достаточного количества нуклеиновой кислоты в матрице пробы, из которой она была экстрагирована.

Для получения ДНК хорошего качества рекомендуется при необходимости удалить следующие компоненты:

-    полисахариды (пектин, целлюлозу, гемицеллюлозу, крахмал, загустители и т. д.) путем обработки соответствующим ферментом (например, пекгиназой, целлюлазой, гемицеллюлазой, а-амила-зой) или экстрагирования органическим растворителем (например, гексадецилтриметиламмонийбро-мид (ЦТАБ)/хпороформ);

-    рибонуклеиновую кислоту (далее - РНК) и/или белки путем соответствующей обработки, например ферментативной обработки рибонуклеазой и протеиназой соответственно;

-    липидные фракции путем, например, ферментативной обработки или использования растворителей (например, н-гексана);

-    соли (например, из буфера для экстрагирования и лизиса на стадии осаждения), способные оказывать влияние на последующий анализ.

В частности, в случае твердых или высушенных проб объем буфера для экстрагирования и лизиса должен быть таким, чтобы гарантировать растворение в нем ДНК.

Примечание 1 - Очистка ДНК может выполняться различными способами, например путем фракционного осаждения с использованием таких растворителей, как фенол, хлороформ, этанол, изопропанол, и/или с использованием адсорбции на твердые матрицы (анионообменную смолу, силикагель или стеклянный гель, диатомовую землю, мембраны и т. д.). Можно объединить несколько принципов очистки ДНК. При необходимости экстрагирование и очистка могут совмещаться путем выполнения на одном и том же этапе.

В случае использования соосадителей ДНК, например гликогена, полиэтиленгликоля (ПЭГ), транспортной РНК (т-РНК), для увеличения соосаждения ДНК они не должны обладать нуклеазной активностью (содержать регистрируемый уровень нуклеаз), содержать ингибиторы и/или конкуренты ПЦР или последовательности нуклеиновых кислот, гомологичные анализируемым последовательностям. При выделении ДНК из генетически модифицированных растений в качестве соосадителя может быть использована, например, ДНК спермы лосося или сельди.

При использовании сублимационных сушилок для высушивания осадка ДНК, полученного после стадии осаждения, необходимо учитывать риск перекрестного загрязнения.

Необходимо повторно растворить ДНК в воде или буферном растворе для предотвращения деградации ДНК.

При применении нового метода экстрагирования ДНК или применении одного из методов, описанных в приложении А, для новых объектов потенциальные качество и целостность экстрагированной ДНК с использованием выбранного метода должны быть проверены следующим образом: добавлением в лизирующий буфер известного количества меченой ДНК вместе с объектом, из которого необходимо выделить ДНК. Если оценка нового метода производится на основании использования меченой ДНК, количество (масса) которой известно, или подсчета количества копий определенной последовательности ДНК, необходимо оценить возможную перекрестную реактивность такой ДНК с ДНК, содержащейся в исследуемой матрице.

Примечание 2 - Использование меченой ДНК является наилучшим приближением к реальной ситуации, когда предполагается образование комплекса ДНК данной матрицы с другими компонентами (например, белками). Такой метод также может использоваться для оценки присутствия растворимых и трансдействующих ингибиторов ПЦР в экстрагированной ДНК (см. ISO 24276, ISO 21569 и ISO 21570).

Однако меченая ДНК может привести к ложному представлению о степени извлечения ДНК, так как она может гораздо легче отделяться от матрицы, чем ДНК-мишень.

5.2.2    Процедуры контроля

Процедуры контроля, подлежащие использованию при проведении анализа, описаны в таблице 1 ISO 24276. Они должны включать как минимум отрицательный и положительный контроль экстрагирования, а также могут включать контроль окружающей среды.

4

ГОСТ ИСО 21571-2009

5.2.3    Контроль чистоты ДНК. Внутренний контроль ПЦР

При отработке нового метода экстрагирования присутствие ингибиторов ПЦР в экстрагированной ДНК может быть оценено с помощью внесения ДНК (см. ISO 24276, ISO 21569 и ISO 21570). Количество добавленной ДНК не должно превышать максимальный уровень, допустимый для применяемой системы ПЦР, и должно содержать установленное число копий последовательности мишени. Это число необходимо определять отдельно для каждой последовательности мишени и указывать как кратное нижнему пределу обнаружения. В идеальном случае концентрация мишени в ПЦР при положительном контроле должна соответствовать чувствительности, требуемой для анализа. При использовании в качестве положительного контроля ПЦР высококонцентрированной клонированной искомой последовательности ДНК необходимо соблюдать осторожность из-за высокой опасности перекрестного загрязнения. По возможности нуклеиновые кислоты положительного контроля должны максимально соответствовать параметрам нуклеиновых кислот исследуемого материала.

5.3    Количественная оценка экстрагированной ДНК

5.3.1    Общие положения

Качество, целостность и количество матрицы нуклеиновой кислоты оказывают влияние на рабочие характеристики аналитического метода и, следовательно, на полученные аналитические результаты. Предел обнаружения конкретного метода может, таким образом, зависеть от количества использованных нуклеиновых кислот.

Количественная оценка ДНК помогает при:

-    определении эффективности различных методов выделения ДНК для определенного вида объектов (повторяемость);

-    измерении концентрации нуклеиновых кислот перед анализом.

5.3.2    Область применения

Каждый метод количественной оценки должен применяться в пределах его динамического диапазона с учетом уровня прецизионности.

5.3.3    Количественные стандарты

Точность методов количественной оценки зависит от стандартов нуклеиновых кислот, используемых для калибровки метода.

При использовании метода, чувствительного к размеру и/или качеству фрагментов нуклеиновой кислоты, должны применяться стандарты нуклеиновой кислоты, которые соответствуют размеру и/или качеству ожидаемой нуклеиновой кислоты, экстрагированной из пробы.

Используемый референсный материал (национальный или международный стандартный образец) должен обеспечивать прослеживаемость заявленных характеристик по непрерывной цепи сравнения до национального или международного эталона (см. ISO Guide 30).

При применении метода с использованием интеркалирующих агентов необходимо применять стандарт ДНК с высокой молекулярной массой, если количественной оценке подлежит ДНК с высокой молекулярной массой. Соответственно, необходимо использовать стандарт ДНК с низкой молекулярной массой при количественной оценке ДНК с низкой молекулярной массой. Нуклеиновая кислота с высокой молекулярной массой, как правило, содержит некоторое количество фрагментов с более низкой молекулярной массой. Это означает, что многие методы количественной оценки ДНК имеют определенную степень неточности, которую необходимо учитывать при оценке результатов.

Примечание - Кроме того, в зависимости от исследуемого материала и применяемого метода экстрагирования некоторая часть экстрагируемой ДНК может быть извлечена в виде одноцепочечной ДНК (которая имеет гораздо более низкую способность к интеркапяции), что приводит к занижению общего содержания ДНК. С другой стороны, одноцепочечная ДНК также хорошо обнаруживается путем физических измерений.

Для построения калибровочного графика требуется не менее трех точек, предпочтительно в повторах. Количество стандартной ДНК, использованной для каждой точки калибровочного графика, зависит от чувствительности метода и динамического диапазона измерений.

5.4 Стабильность экстрагированной ДНК

Экстрагированная ДНК должна храниться в условиях, которые обеспечивают ее стабильность для проведения последующих анализов.

Следует избегать многократного замораживания и оттаивания растворов ДНК.

5

1

Vortex - это пример коммерчески доступного оборудования, пригодного для использования с описываемым методом. Эта информация приводится исключительно для информации пользователей настоящего стандарта и ни при каких условиях не может служить рекомендацией или одобрением конкретного типа оборудования. Допускается использование аналогичного оборудования, при условии, что оно позволяет получать такие же результаты.

2

Повторяемость может зависеть от партии матрицы и/или технологии ее получения. В некоторых случаях ДНК не может быть обнаружена или она подверглась расщеплению таким образом, что результаты ПЦР оказываются ниже предела обнаружения метода независимо от используемых затравок (праймеров), протоколов ПЦР. Это может быть причиной низкой воспроизводимости результатов между лабораториями.

9