МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

ГОСТ

31960—

2012

(ISO 10253:2006)

ВОДА

Методы определения токсичности по замедлению роста морских одноклеточных водорослей Phaeodactylum tricornutum Bohlin и Sceletonema costatum (Greville) Cleve

(ISO 10253:2006, MOD)

Издание официальное

Москва

Стандартинформ

2014

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2 - 2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения,обновления и отмены».

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН Обществом с ограниченной ответственностью «Протектор» совместно с Федеральным государственным унитарным предприятием «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии» на основе официального аутентичного перевода на русский язык, указанного в пункте 4 стандарта, находящегося в Федеральном информационном фонде

2    ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 343 «Качество воды»)

3    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации

4    Настоящий стандарт модифицирован по отношению к международному стандарту ISO 10253:2006 Water quality-Marine algal growth inhibition test with Sceletonema costatumand Phaeodactylum tricornutum (Качество воды. Испытание на замедление роста морских водорослей Sceletonema costatum и Phaeodactylum tricornutum) путем:

-    изменения структуры. Сравнение структуры международного стандарта со структурой настоящего стандарта приведено в приложении Д.Е;

-    внесения дополнительных положений, фраз и слов, что обусловлено учетом потребностей экономики и особенностей межгосударственной стандартизации, выделенных в тексте настоящего стандарта курсивом, за исключением наименований тест-организмов;

-    исключения отдельных пунктов указанного международного стандарта. Полный текст исключенных пунктов с обоснованиями исключения приведен в приложении Д.Ж.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5-2001 (подраздел 3.6).

Сведения о соответствии межгосударственных стандартов ссылочным международным стандартам приведены в приложении Д.И.

Степень соответствия - модифицированная (MOD).

Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 53910 - 2010

5    Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 12 декабря 2012 г. №1897-ст межгосударственный стандарт введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2014 г.

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Окончание таблицы 1

Наименование реактива Масса реактива, вносимая на 1 d/и3 дистиллированной воды, г Натрий сернокислый по ГОСТ 4166 (Na2SOA), безводный 3,70 Кальций хлористый (СаС12), безводный 1,00 Калий хлористый по ГОСТ 4234 (KCI) 0,65 Натрий углекислый кислый по ГОСТ 4201 (ЫаНСОт) 0,20 Борная кислота по ГОСТ 9656 (Н3ВО^ 0,023

Минерализация (соленость) приготовленной из указанных реактивов искусственной морской воды составляет 33 г/дм³ (33 %о). При необходимости, для уменьшения минерализации (солености), искусственную морскую воду разбавляют дистиллированной водой.

Допускается готовить искусственную морскую воду, используя готовую морскую соль (например, марки «Wieqandt»).

Приготовленную искусственную морскую воду аэрируют в течение 1-2 сут при помощи микрокомпрессора, затем дают отстояться в течение 10 - 14 сут.

Искусственная морская вода должна соответствовать следующим требованиям:

-    значение pH в пределах 8,0- 8,3;

-    содержание растворенного кислорода не менее 7 мг 0₂ / дм³;

-    температура (20 ± 2) ⁰ С.

Искусственную морскую воду хранят в емкости из темного стекла с притертой крышкой (используют емкости до 10 дм³) при комнатной температуре не более года.

5.3.3 Подготовка проб

Перед тестированием предварительно охлажденные или замороженные пробы доводят до комнатной температуры (от 19 °С до 24°С).

5.3.3.1    Подготовка исходных проб природной морской воды и воды эстуариев

Отобранные пробы природной морской воды и воды эстуариев фильтруют через мембранные

фильтры с порами диаметром 3,5 мкм или через обеззоленные фильтры «белая лента», после чего измеряют минерализацию (соленость), pH и концентрацию растворенного кислорода отфильтрованной пробы.

Примечание - Мембранные фильтры перед применением должны быть промыты и простерилизова-ны кипячением в дистиллированной воде не менее 10 мин.

Не допускается для фильтрования использовать фильтр «синяя лента».

Примечание - Фильтр «синяя лента» задерживает коллоидные вещества, что занижает результаты тестирования.

Пробы природной морской воды и воды эстуариев тестируют без разбавлений (в случаях, когда пробы проявляют высокую токсичность - допускается их разбавление непосредственно перед тестированием).

5.3.3.2    Подготовка исходных проб сточной воды

Отобранные пробы сточной воды непосредственно перед тестированием фильтруют через мембранный фильтр с порами диаметром 3,5 мкм или через обеззоленный фильтр «белая лента», после чего измеряют минерализацию (соленость), pH и концентрацию растворенного кислорода отфильтрованных проб.

5.3.3.3    Подготовка исходных проб отработанных буровых растворов, твердых промышленных отходов и донных отложений

Из проб донных отложений, отработанных буровых растворов, твердых промышленных отходов готовят водные вытяжки, затем измеряют минерализацию (соленость), pH и концентрацию растворенного кислорода подготовленных водных вытяжек.

Подготовка водных вытяжек из проб отработанных буровых растворов

Перед приготовлением водной вытяжки из пробы отработанных буровых растворов отобранную пробу тщательно перемешивают в смесителе со скоростью вращения 17 cr^fl ООО об/мин) в течение 5 мин и определяют pH отработанного бурового раствора. Пробу отработанного бурового раствора считают не пригодной для тестирования, если:

7

-    pH пробы отработанного бурового раствора более 9,0 или ниже 6,0;

-    на стенках сосуда с пробой отработанного бурового раствора появились черные пятна;

-    проба отработанного бурового раствора имеет неприятный запах.

После перемешивания пробу отработанного бурового раствора смешивают с морской водой (см. 5.2) в соотношении, соответственно, 1 : 9 по объему, и снова перемешивают с применением смесителя со скоростью вращения 17 сг¹ (1000 об/мин) в течение 5 мин.

После окончания перемешивания смесь отстаивают при температуре (20 ±5)°С в течение 1 ч, затем водную вытяжку над осадком осторожно переливают за один прием в стеклянную емкость и перемешивают в течение 5 мин, после чего используют ее для подготовки анализируемой пробы.

Если отстоявшаяся смесь не имеет четкого раздела фаз, то весь объем подготовленной пробы используют для приготовления анализируемой пробы.

Не допускается консервация и хранение подготовленных водных вытяжек проб отработанных буровых растворов.

Подготовка водных вытяжек из проб твердых промышленных отходов

Перед приготовлением водной вытяжки из твердых промышленных отходов отобранную пробу твердых промышленных отходов разрыхляют и тщательно осматривают. В случае обнаружения частиц размером более 10 мм их измельчают с помощью металлического шпателя до размера менее 10 мм. Не допускается измельчать смесь с помощью механизированных устройств.

Измельченную пробу отходов высушивают при комнатной температуре до воздушно-сухого состояния в вытяжном шкафу или в хорошо проветриваемом помещении.

Водную вытяжку из высушенной пробы твердых промышленных отходов готовят в соотношении: твердые промышленные отходы / морская вода, соответственно 1:10, следующим способом:

В стеклянную емкость вместимостью 1500 см³ вносят 100 г сухой массы пробы твердых промышленных отходов, добавляют 1000 см³ морской воды (см. 5.2) и перемешивают в течение 6-7 ч с использованием магнитной мешалки (или орбитального шейкера) с минимальной скоростью перемешивания, при которой проба твердых промышленных отходов поддерживается во взвешенном состоянии.

Примечание - Для приготовления 900 см³ водной вытяжки обычно требуется 100 г сухой массы пробы твердых промышленных отходов.

Не допускается использовать для приготовления водной вытяжки менее 20 г сухой массы пробы твердых промышленных отходов и менее 200 см³ морской воды.

После окончания перемешивания емкость с полученной смесью ставят в холодильник, где ее выдерживают при температуре от 2°С до 4°С в течение 12 - 14 ч, затем жидкость над осадком осторожно переливают в другую емкость, после чего используют ее для подготовки анализируемой пробы.

Примечание - Жидкие промышленные отходы тестируют без разбавления, а также при разбавлениях в 10, 100, 1000 и 10000 раз.

Допускается хранение подготовленных водных вытяжек из твердых промышленных отходов при температуре от 2° С до 4° С не более 48 ч.

Подготовка водных вытяжек из проб донных отложений

Перед приготовлением водной вытяжки из донных отложений отобранную пробу донных отложений высушивают при температуре (20 ± 5) ⁰ С до воздушно-сухого состояния, удаляют остатки растений, камешки и т. п., затем измельчают в ступке и просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

После просеивания навеску пробы донных отложений вносят в стеклянную емкость и заливают морской водой (см. 5.2) в соотношении, соответственно, 1 : 4 по объему, перемешивают с использованием орбитального шейкера (или качалки - мешалки) в течение 2 ч. После окончания перемешивания смесь выдерживают в течение 1 ч при температуре (20 ± 5) °С, ставят в холодильник и выдерживают при температуре от 2°С до 4°С в течение 12 - 14 ч, затем водную вытяжку над осадком осторожно переливают в стеклянную емкость и фильтруют, после чего используют ее для подготовки анализируемой пробы.

Допускается хранение подготовленных водных вытяжек донных отложений при температуре от 2°С до 4 °С не более 72 ч.

ГОСТ 31960-2012

5.3.3.4    Подготовка исходных растворов веществ

Исходные растворы веществ, в зависимости от заданной концентрации, готовят в стеклянной мерной колбе путем растворения определенного количества пробы вещества в определенном объеме морской воды (см. 5.2).

Исходные растворы веществ готовят непосредственно перед их тестированием, при этом, если известно, что вещества стабильны в растворе, исходные растворы допускается готовить заранее, но не более чем за 2 сут до начала тестирования.

Примечания

1    Для веществ трудно растворимых в воде при приготовлении их исходных растворов могут быть использованы ультразвуковые или другие устройства (шейкеры) для облегчения растворимости или диспергирования веществ.

2    Допускается использовать органические растворители, обладающие малой токсичностью в отношении тест-организмов (например, ацетон), при условии, что концентрация растворителя в анализируемой пробе раствора не превышает 0,1 см³/дмР, при этом параллельно с основным тестированием проводят два контрольных тестирования, одно без растворителя и другое с максимальной концентрацией растворителя.

Для приготовления исходного раствора вещества заданной концентрации невозможно рекомендовать какую-либо единую методику. Например, используют следующую процедуру: в стеклянную мерную колбу вместимостью 1000 см³ (или 100, 50, 25 см³) вносят 1 г вещества (или другое его количество, в зависимости от заданной концентрации раствора), затем осторожно добавляют в колбу небольшое количество морской воды (см. 5.2), перемешивают до полного растворения вещества, доводят объем до метки этой же морской водой и снова перемешивают. Приготовленный раствор выдерживают перед тестированием при комнатной температуре не менее 2 ч.

Измеряют минерализацию (соленость), pH и концентрацию растворенного кислорода в исходном растворе вещества.

5.3.3.5    Исходные пробы (см. 5.3.3.1 - 5.3.3.3) и исходные растворы веществ (см. 5.3.3.4) должны иметь следующие характеристики:

a)    Минерализация от 6 до 33 г/дм³ (соленость от 6 %о до 33 %о)

Примечание - Приведен диапазон минерализации (солености) в зависимости от исследуемого объекта; минерализация (соленость) исходных проб (растворов) должна входить в указанный диапазон.

b)    Значение pH 8,0 - 8,3

Если значение pH исходной пробы (раствора) выходит за указанные пределы, то в пробу (раствор) добавляют 10%-ный раствор соляной кислоты или 10%-ный раствор гидроокиси натрия, после чего аэрируют пробу (раствор) при помощи аквариумного компрессора в течение 10 - 20 мин для стабилизации pH.

Для исходных проб водных вытяжек из твердых промышленных отходов регулирование pH не допускается.

c)    Концентрация растворенного кислорода не ниже 7 мг О^дм³

Если концентрация растворенного кислорода исходной пробы (раствора) ниже указанного значения, пробу (раствор) аэрируют при помощи аквариумного компрессора.

5.3.3.6    Подготовка анализируемых проб

Анализируемые пробы природной морской воды и воды эстуариев готовят следующим способом: в три конические колбы вместимостью 150 см³ вносят по 100 см³ отфильтрованной исходной пробы (см. 5.3.3.1) и добавляют исходные растворы питательной среды Гэльдберга (см. приложение А) в следующих объемах: раствор №1-0,2 см³; раствор №2- 0,05 см³; раствор №3-0,1 см³; раствор №4-0,1 см³.

Примечание - При необходимости, если анализируемая проба природной морской воды при тестировании по 5.4. показала высокую токсичность, то проводят разбавление исходной пробы природной морской воды (см. 5.3.3.1) в два, пять, 10 и более раз искусственной морской водой (см. 5.3.2), которая соответствует солености исходной пробы.

Анализируемые пробы сточной воды готовят в следующей последовательности:

а) проводят разбавление исходной пробы сточной воды следующим способом: в три конические колбы вместимостью 250 см³ вносят исходную пробу сточной воды (см. 5.3.3.2) и питательную среду Гэльдберга (см. приложение А) в объемах:

-100 см³ исходной пробы сточной воды (проба без разбавления);

9

-    50 см³ исходной пробы сточной воды и 50 см³ питательной среды (кратность разбавления: 50 %, в два раза);

-    10 см³ исходной пробы сточной воды и 90 см³ питательной среды (кратность разбавления: 10 %, в 10 раз);

-    1 см³ исходной пробы сточной воды и 99 см³ питательной среды (кратность разбавления: 1 %, в 100 раз);

-0,1 см³ исходной пробы сточной воды и 99,9 см³ питательной среды (кратность разбавления: 0,1%, в 1000 раз).

Ь) затем в колбы с разбавленными пробами сточной воды добавляют исходные растворы питательной среды Гэльдберга (см. приложение А), как указано ниже:

в колбы без разбавления исходной пробы последовательно добавляют исходные растворы питательной среды в следующих объемах: раствор № 1 - 0,2 см³; раствор №2 - 0,05 см³; раствор №3-0,1 см³; раствор №4-0,1 см³;

в колбы с разбавлением исходной пробы сточной воды в два раза добавляют в той же последовательности (но в два раза меньше) исходные растворы питательной среды, соответственно: 0,1; 0,025; 0,05; 0,05 см³;

в колбы с разбавлением исходной пробы в 10 раз - соответственно: 0,02; 0,005; 0,01; 0,01 см³;

в колбы с разбавлениями исходной пробы в 100 и 1000 раз исходные растворы питательной среды не добавляют.

Анализируемые пробы отработанных буровых растворов, донных отложений и твердых промышленных отходов готовят из их водных вытяжек (см. 5.3.3.3) путем разбавления водных вытяжек и добавления исходных растворов питательной среды аналогично, указанным в а) и Ь) для анализируемой пробы сточной воды.

Анализируемую пробу вещества готовят следующим способом: в конические колбы вместимостью 250 см³ вносят по 100 см³ питательной среды Гэльдберга (см. приложение А), затем добавляют рассчитанные объемы исходного раствора вещества (см. 5.3.3.4) для получения заданных концентраций, отвечающих требованиям, установленным в 5.4.1.

5.3.3.7    Измеряют и регистрируют минерализацию (соленость,), pH и концентрацию растворенного кислорода в каждой колбе с анализируемой пробой.

Примечание - Минерализация (соленость,) анализируемой пробы и питательной среды для культивирования водорослей должна быть одна и та же; если минерализация (соленость) разная, то проводят адаптацию водорослей к минерализации (солености) анализируемой пробы (см. приложение А). Если минерализация (соленость) анализируемой пробы отличается от минерализации (солености) среды для культивирования водорослей не более чем на 5 %о, адаптацию не проводят.

5.3.3.8    Подготовку тест-организмов к тестированию проводят в соответствии с требованиями приложения Д.А с учетом требований 5.3.4.

5.3.4 Проверка физиологической чувствительности тест-организмов

Периодически (не реже одного раза в месяц), а также непосредственно перед тестированием анализируемых проб и в случае проведения адаптации водорослей к минерализации (солености) анализируемых проб культуру водорослей в экспоненциальной фазе роста проверяют на физиологическую чувствительность. Для этого определяют эффективную концентрацию модельного токсиканта (72 ч ЭК₅₀), как указано ниже.

5.3.4.1    Готовят исходный раствор модельного токсиканта массовой концентрацией 1 г/дм³ следующим способом: в мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 1 г двухромовокислого калия и растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, затем доводят содержимое колбы до метки дистиллированной водой, тщательно перемешивают.

Срок хранения исходного раствора модельного токсиканта - не более 7 сут.

5.3.4.2    Готовят анализируемые растворы модельного токсиканта двухромовокислого калия с массовой концентрацией от 1,0 до 10 мг/дм³ следующим способом: в пять мерных колб вместимостью 500 см³ вносят исходный раствор двухромовокислого калия массовой концентрацией 1 г/дм³ (см. 5.3.3.1), соответственно, в первую колбу - 0,5 см³, во вторую колбу - 1,0 см³, в третью колбу -2,0 см³, в четвертую колбу -4,0 см³, в пятую колбу -5,0 см³, доводят содержимое каждой колбы до метки питательной средой Гэльдберга (см. приложение А) и перемешивают. При этом в каждой колбе массовая концентрация раствора двухромовокислого калия составляет соответственно: 1,0; 2,0; 4,0; 8,0 и 10,0 мг/дм³-.

ГОСТ 31960-2012

Анализируемые растворы двухромовокислого калия каждой концентрации готовят непосредственно перед определением физиологической чувствительности водорослей.

Для приготовления контрольной пробы используют среду Гэльдберга (приложение А).

Измеряют минерализацию (соленость) и pH в каждой колбе с анализируемым раствором модельного токсиканта и контрольной пробе.

5.3.4.3    Проводят тестирование анализируемых растворов модельного пюксиканта аналогично процедуре тестирования анализируемой пробы по 5.4.3 в течение 72 ч.

5.3.4.4    Подсчитывают плотность (численность) клеток водорослей в соответствии с требованиями приложения Д.В и на основании полученных результатов определяют по 5.5 значение 72 ч ЭК₅₀ модельного токсиканта (двухромовокислого калия).

При этом:

-    если значение 72 ч ЭК₅₀ указанного модельного токсиканта находится в диапазоне от 5,8 до 10,0 мг/дм³, то считают, что подготовленные водоросли пригодны для тестирования;

-    если значение 72 ч ЭК₅₀ указанного модельного токсиканта не входит в указанный диапазон, то считают, что подготовленные водоросли не пригодны для тестирования. Проверяют соблюдение правильности процедуры тестирования, условия подготовки водорослей к тестированию и, при необходимости, повторяют тестирование с использованием обновленной культуры водорослей.

5.3.4.5    Если в результате тестирования не удалось получить конкретное значение 72 ч ЭК₅₀, то для определения 72 ч ЭК₅₀ модельного токсиканта используют пробит-анализ. Пример приведен в приложении Д.Б.

5.4 Проведение тестирования

Тестирование проводят в два этапа: предварительное и окончательное.

5.4.1    Предварительное тестирование

Предварительное тестирование проводят для установления диапазона разбавлений (концентраций,) проб, в пределах которого необходимо провести окончательное тестирование для определения значения 72 ч ЭКР₅₀ (96 ч ЭКР₅₀) или 72 ч ЭК₅₀ в зависимости от анализируемых проб.

При предварительном тестировании исследуют широкую область разбавлений (не менее пяти) сточных вод, водных вытяжек и концентрации растворов вещества, выбираемых в геометрической прогрессии, при этом, как правило, используют коэффициент 10 между разбавлениями (концентрациями,).

При предварительном тестировании применяют не менее двух колб на каждое анализируемое разбавление (концентрацию,) пробы.

Процедура предварительного тестирования - по 5.4.3.

Пример проведения предварительного тестирования и установления диапазона концентраций вещества, в пределах которого необходимо проводить окончательное тестирование, приведен в приложение Д.Б.

5.4.2    Окончательное тестирование

По результатам предварительного тестирования (см. 5.4.1) для установленного диапазона разбавлений (концентраций,) подготавливают анализируемые пробы для окончательного тестирования. При этом используют коэффициент между разбавлениями (концентрациями,), как правило, 2,0 или 2,5.

Разбавления (концентрации,) проб необходимо, по возможности, подбирать таким образом, чтобы обеспечить два уровня снижения плотности (численности) клеток водорослей: ниже и выше предполагаемого значения ЭК₅₀ (ЭКР₅₀).

Процедура окончательного тестирования - по 5.4.3. При этом используют не менее пяти разбавлений (концентраций) анализируемых проб, применяют не менее трех колб для каждого разбавления (концентрации).

Пример проведения окончательного тестирования и установление значений эффективной концентрации 72 ч ЭК₅₀ для вещества приведен в приложение Д.Б.

Примечание - Если имеется достаточное количество статистических данных, схема тестирования может быть изменена, например, увеличено количество тестируемых разбавлений (концентраций) пробы или уменьшено количество колб с анализируемыми пробами для каждого разбавления (концентрации).

11

5.4.3 Процедура тестирования

5.4.3.1 В каждую колбу (см. 5.4.1 и 5.4.2) вместимостью 250 см³ вносят по 100 см³ анализируемой пробы (см. 5.3.3.6), затем в каждую колбу добавляют рассчитанный объем суспензии водорослей в экспоненциальной фазе роста (см.5.3.3.8), перемешивают, выдерживают 30 мин на свету и определяют плотность (численность) клеток водорослей, соответствующую началу тестирования, по приложению Д.В.

Плотность (численность) клеток водорослей в начале тестирования должна находиться в пределах 2,0- 10*-2,5- 10⁴ клеток/см³.

5.4.3.2    Для каждой анализируемой пробы (разбавлений, концентраций) подготавливают контрольную пробу следующим способом: в три конические колбы вместимостью 250 см³ вносят по 100 см³ питательной среды Гзльдберга [см. А. 1.2 (приложение А)], добавляют по 1,0 см³ суспензии водорослей в экспоненциальной фазе роста (см. 5.3.3.8), перемешивают, выдерживают 30 мин на свету и определяют плотность (численность) клеток водорослей соответствующую началу тестирования, по приложению Д.В. При этом плотность (численность) клеток водорослей в контрольной пробе должна находиться в пределах 2,0 ■ 10* - 2,5 ■ 10⁴ клеток/см³.

Примечание - Чтобы получить в начале тестирования плотность (численность) клеток водорослей в пределах от 2 ■ 10⁴ до 2,5 ■ 10⁴ клеток/см³, достаточно в каждую колбу внести 1,0 см³ суспензии водорослей из культуры, плотность (численность) которой находится в пределах от 2 ■ 1(Р до 2,5 ■ 1(Р клеток/см³-

Минерализация (соленость) контрольной пробы должна соответствовать минерализации (солености) анализируемой пробы.

5.4.3.3    Колбы с пробами, подготовленными по 5.4.3.1, 5.4.3.2, закрывают ватно-марлевыми пробками, встряхивают и помещают в климатостат.

Примечания

1    Колбы с водорослями должны быть закрытыми для предотвращения снижения испарения раствора; однако колбы не следует закрывать герметично, чтобы обеспечить воздухообмен, рекомендуется применять ватномарлевые пробки.

2    Клетки водорослей необходимо поддерживать во взвешенном состоянии, путем легкого встряхивания колбы (например, вручную), чтобы обеспечить единый уровень pH и газовый режим в различных слоях анализируемой пробы.

3    Значение pH контрольной пробы при тестировании не должно меняться более чем на ± 1,0 ед. pH.

Тестирование проводят в течение 72 ч или 96 ч (в зависимости от анализируемой пробы) в климатостате при температуре (20 ± 2) ⁰ С, имитируя светлый период суток - 16 ч и темный период -8 ч. Содержимое каждой колбы перемешивают (встряхивают вручную) один-два раза в сутки.

Климатостат должен обеспечивать равномерное и белое освещение в диапазоне от 3000 до 6000 лк на расстоянии 0,35 м от поверхности анализируемых проб в колбах.

5.4.3.4    Через каждые 24 ч тестирования определяют плотность (численность) клеток водорослей в каждой колбе (включая контрольную) в соответствии с требованиями приложения Д.В.

5.5 Обработка результатов

5.5.1    По результатам подсчета плотности (численности) клеток водорослей для каждого заданного разбавления (концентрации) анализируемой пробы по трем емкостям, в том числе контрольной, рассчитывают среднеарифметическое значение плотности (численности) клеток водорослей.

5.5.2    Определение токсичности анализируемых проб

100,

5.5.2.1 Токсический эффект анализируемых проб определяют по снижению плотности (численности) клеток водорослей для каждого заданного разбавления (концентрации) анализируемой пробы, относительно контрольной пробы А, %, после 72 ч (96 ч) тестирования и рассчитывают по формуле

(2)

ГОСТ 31960-2012

где х_к - среднеарифметическое значение плотности (численности) клеток водорослей в контрольной пробе, клеток/см³;

х_к - среднеарифметическое значение плотности (численности) клеток водорослей для каждого заданного разбавления (концентрации) в анализируемой пробе, клеток/см³.

5.5.2.2.Если по результатам тестирования за 72 ч (96 ч) получают данные, указывающие на стимуляцию роста плотности (численности) клеток водорослей, то стимуляцию отмечают в протоколе испытаний и проводят расчет по формуле (2), используя данные для другой продолжительности тестирования (например за 24 ч), когда эффекта стимуляции роста не наблюдается.

5.5.3    Определение кратности разбавления (концентрации)

5.5.3    Определение эффективной кратности разбавления (концентрации^

5.5.3.1    Для каждого заданного разбавления (концентрации) анализируемой пробы рассчитывают процент снижения плотности (численности) клеток водорослей после 72 ч (96 ч) тестирования по отношению к плотности (численности) клеток водорослей в контрольной пробе, используя полученные по 5.5.1 среднеарифметические значения и формулу (2).

По полученным значениям процентов снижения плотности (численности) клеток водорослей определяют конкретное значение эффективной кратности разбавления (концентрации) пробы, вызывающее 50%-ное снижение плотности (численности) клеток водорослей 72 ч ЭКР₅₀ (96 ч ЭКР₅₀) или 72 ч ЭК₅₀ в зависимости от анализируемой пробы.

При необходимости определяют:

-    минимальную кратность разбавления (концентрацию) пробы, соответствующую 100%-ному снижению плотности (численности) клеток водорослей;

-    максимальную кратность разбавления (концентрацию) пробы, соответствующую 0%-ному снижению плотности (численности) клеток водорослей за 72 ч ( 96 ч).

5.5.3.2    Допускается определять значение эффективной кратности разбавления (концентрации) по замедлению скорости роста клеток водорослей как указано в 6.5.1 - 6.5.3. Пример приведен в приложении Д.Б.

5.5.3.3    Если по результатам, полученным по 5.5.3.1 (5.5.3.2), не удалось определить конкретное значение эффективной кратности разбавления (концентрации^ пробы, вызывающей 50%-ное снижение плотности (численности) клеток водорослей за 72 ч (96 ч), то для определения этого значения используют пробит-анализ. Пример приведен в приложении Д.Б.

5.5.4 Определение степени токсичности анализируемых проб

5.5.4.1    Если значение токсического эффекта анализируемых проб, рассчитанное по формуле (2), составляет менее 10 %, то эффективную кратность разбавления (эффективную концентрацию) анализируемой пробы, при которой плотность (численность) клеток водорослей изменилась относительно контрольной пробы не более 10 % за 72 ч тестирования (или 96 ч тестирования в зависимости от исследуемого объекта), относят к безвредной кратности разбавления (безвредной концентрации).

5.5.4.2    Степень токсичности исследуемых объектов оценивают:

-    природной морской воды и воды эстуариев - по таблице 2;

-    донных отложений - по таблице 3;

-    отработанных буровых растворов - по таблице 4;

-    химической продукции, смесевой химической продукции - по таблице 5*;

-    сточной воды, поступающей в морские водоемы, твердых промышленных отходов по стандартам и другим нормативным документам, утвержденным в установленном порядке.

Примечание - Под нормативным документом следует понимать документы, устанавливающие критерии отнесения исследуемых объектов к классу опасности для окружающей природной среды, разработанные в целях реализации федеральных законов (технических регламентов) в данной области.

В Российской Федерации - по ГОСТ Р 53857, ГОСТ Р 53858; при необходимости оценки других водных растворов веществ - по таблице 4 настоящего стандарта.

13

Таблица 2- Степень токсичности проб природной морской воды и воды эстуариев

Степень токсичности проб морской природной воды и воды эстуариев Значение токсического эффекта (см. 5.5.2.1) для проб природной морской воды и воды эстуариев без разбавления А, % Общая Детализированная Токсичность отсутствует Нетоксичная до 10 включ. Не обладает острой токсичностью Слаботоксичная Св. 10 » 25 » Малотоксичная »25 » 35» Среднетоксичная »35 » 50» Обладает острой токсичностью Высокотоксичная » 50 » 100 »

Таблица 3- Степень токсичности проб донных отложений

Степень токсичности проб водных вытяжек донных отложений Значение токсического эффекта (см. 5.5.2.1) для проб донных отложений А, % Общая Детализированная Токсичность отсутствует Нетоксичная до 10 включ. Не обладает острой токсичностью Слаботоксичная Св. 10 » 35 » Среднетоксичная » 35 » 50» Обладает острой токсичностью Высокотоксичная » 50 » 100 »

Примечание - При необходимости более детальной оценки токсичности загрязненных проб донных отложений степень токсичности определяют по значению кратности разбавления (см. 5.5.3) 96 ч ЭКР50, приведенным в таблице 3._

Таблица 4 - Степень токсичности проб отработанных буровых растворов, загрязненности проб донных отложений

Степень токсичности водных вытяжек проб отработанных буровых растворов (донных отложений) Значение кратности разбавления (см. 5.5.3) водных вытяжек проб отработанных буровых растворов (донных отложений) 96 ч ЭКР50, разы Нетоксичные 1,0 Слаботоксичная Менее 100 Среднетоксичная От 100 до 1000 Высокотоксичная » 1000» 10000 Гипертоксичная Более 10000

Таблица 5- Степень токсичности водных растворов веществ

Степень токсичности водных растворов веществ Значение эффективной концентрации вещества (см.5.5.3) 72 ч ЭК50 мг/ дм3 Нетоксичные Св. 1000 Практически нетоксичные От 1000 до 100 включ. Слаботоксичные Менее 100 » 10 » Среднетоксичные » 10 » 1,0 » Высокотоксичные » 1,0 » 0,01 » Гипертоксичные » 0,01

5.5.5 Результаты тестирования считают достоверными, если соблюдаются следующие условия:

a)    плотность (численность) клеток водорослей в контрольной пробе в конце тестирования увеличилась не менее чем в три раза по сравнению с плотностью (численностью) клеток водорослей в начале тестирования;

b)    коэффициент колебаний темпов роста клеток водорослей в контрольных пробах в каждой из трех колб тестируемой серии анализируемых проб в течение тестирования должен быть не более 7 % относительно среднеарифметического значения плотности (численности) клеток водорослей;

c)    уровень pH в контрольной пробе изменился не более чем на 1,0 ед. pH в конце тестирования;

d)    токсичность модельного токсиканта находится в пределах, указанных в 5.3.4.4.

5.6 Оформление результатов тестирования

5.6.1 Результаты тестирования регистрируют в протоколе испытаний в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО/МЭК 17025, при этом указывают следующую информацию:

а) ссылку на настоящий стандарт с указанием метода определения;

ГОСТ 31960-2012

b)    данные, необходимые для идентификации пробы или анализируемого вещества, прошедшего испытания;

c)    тест-организмы: род, вид, метод культивирования;

d)    подробное описание тестирования:

-    дата начала тестирования и продолжительность;

-    для природной морской воды, воды эстуариев, сточных вод, водных вытяжек отработанных буровых растворов, твердых промышленных отходов, донных отложений - кратность разбавления, способ и продолжительность хранения проб и, при необходимости, условия, в которых проводились отстаивание, фильтрование, а также размораживание пробы;

-    для веществ - анализируемые концентрации, способ их приготовления;

-    наименование и состав питательной среды для культивирования водорослей;

-    источник и минерализацию (соленость) морской воды;

-    значение pH анализируемых проб перед тестированием и после его окончания;

e)    значение степени токсичности исследуемого объекта с указанием, при необходимости, эффективной кратности разбавления (концентрации) анализируемой пробы, ей соответствующей, а также результаты окончательного определения эффективной кратности разбавления 72 ч ЭКР₅₀ (96 ч ЭКР₅₀), эффективной концентрации 72 ч ЭК₅₀ в зависимости от анализируемой пробы, метод расчета (при необходимости);

f)    обстоятельства и условия, не предусмотренные настоящим стандартом, способные повлиять на результат тестирования.

Примечание - Допускается в протокол дополнительно включать следующую информацию:

-    метод определения плотности (численности) клеток водорослей;

-    плотность (численность) клеток водорослей в каждой колбе после окончания любой заданной продолжительности тестирования;

-    среднеарифметическое значение плотности (численности) клеток водорослей для каждой кратности разбавления (концентрации) в анализируемых и контрольных пробах после окончания любой заданной продолжительности тестирования;

-    зависимость между кратностью разбавления (концентрации) пробы и значениями плотности (численности) клеток водорослей в процентах в табличной или графической форме.

5.6.2 Значения 72 ч ЭКР₅₀ (96 ч ЭКР₅₀), 72 ч ЭК₅₀ выражают:

-    в процентах (%) или в кратности разбавления (разы) - для природной морской воды, воды эстуариев, сточных вод и водных вытяжек;

-    в миллиграммах на кубический дециметр (мг/дм³) - для растворов веществ.

6 Метод Б

6.1    Сущность метода

Сущность метода заключается в регистрации замедления скорости роста клеток морских одноклеточных водорослей Phaeodactylum tricornutum Bohlin или Sceletonema costatum (Greville) Cleve в анализируемой пробе исследуемого объекта относительно контрольной пробы, определении ее токсичности и токсикологических показателей при тестировании в течение 72 ч при постоянном воздействии света и температуры.

6.2    Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы, материалы - по 5.2 со следующими дополнениями:

фильтры мембранные с порами диаметром 0,2 мкм;

автоклав, обеспечивающий рабочее давление (0,11 ± 0,02) МПа и температуру (120 ± 2) °С;

тест-организмы: морские одноклеточные водоросли по 5.2 или Sceletonema costatum (Greville) Cleve (ССАР 1077/1 C, NIVA ВАС 1).

Примечание - Методы культивирования водорослей приведены в приложении Д.А\

питательная среда, приготовленная в соответствии с требованиями приложения А.

Примечание - Для длительного содержания водорослей Sceletonema costatum (Greville) Cleve и приготовления питательной среды для культивирования необходимо применение природной морской воды (см. 5.2), поскольку питательная среда, приготовленная на искусственной морской воде (см. 5.3.2), не всегда обеспечивает достаточный рост этих водорослей для тестирования;

15

модельный токсикант по 4.2 или 3,5-дихлорфенол, ч. д. а.;

соль динатриевая этилендиамин-N, N, N', N'-тетрауксусной кислоты 2-водная (трилон Б) по ГОСТ 10652, х. ч.;

цинк сернокислый 7-водный по ГОСТ 4174, х. ч.; медь (II) сернокислая 5-водная по ГОСТ 4165, х. ч.; тиамина гидрохлорид, х. ч.; биотин;

калий фосфорнокислый, х. ч.;

натрий азотнокислый по ГОСТ 4168, х. ч.;

натрий кремниевокислый 5-водный, х. ч.

6.3    Подготовка к тестированию - аналогично 5.3, при этом подготовку анализируемых проб сточных вод проводят в соответствии с требованиями приложения Д.Г.

Примечание - При необходимости определения физиологической чувствительности тест-организмов [в т. ч. водорослей Sceletonema costatum (Greville) Cleve (ССАР 1077/1 C, NIVA ВАС 1)7 по отношению к модельному токсиканту 3,5-дихлорфенолу ее проводят аналогично модельному токсиканту калию двухромовокислому (см. 5.3.4), но с использованием данных, приведенных в таблице Д.Д.1 (приложение Д.Д).

6.4    Проведение тестирования - аналогично 5.4 со следующими уточнениями:

6.4.1    Тестирование проводят в течение (72 ± 2) ч в помещении с регулируемой температурой (20 ± 2) °С при постоянном воздействии равномерного белого освещения в диапазоне от 6000 до 10000 лк на расстоянии 0,35 м от поверхности анализируемых проб в колбах при непрерывном и легком взбалтывании анализируемых проб.

Примечание - Требуемая освещенность может быть достигнута с использованием люминесцентных ламп мощностью 300 Вт универсального белого (естественного) света, то есть номинальный цвет эталона цвета 2 (цветовая температура 4300 К).

6.4.2    При предварительном тестировании анализируемой пробы используют по одной колбе для каждого разбавления (концентрации) пробы.

6.4.3    Окончательное тестирование проводят с анализируемыми пробами, которые приготовлены с использованием коэффициента между разбавлениями (концентрациями) не более 3,2 (например, 1,0; 1,8; 3,2; 5,6 и 10,0 мг/дм³).

6.4.4    Количество добавленной во все колбы (включая контрольную пробу) суспензии водорослей в экспоненциальной фазе роста должно обеспечить начальную плотность (численность) клеток водорослей в пробе не более 10⁴ клеток/см³; для Sceletonema costatum (Greville) Cleve рекомендуется более низкая начальная плотность (численность) клеток (в три - пять раз менее), так как клетки этих водорослей большего объема.

Примечание - Исходная плотность (численность) клеток водорослей в начале тестирования должна быть достаточно низкой, чтобы обеспечить экспоненциальный рост в контрольной пробе за период проведения всего тестирования.

Для приготовления контрольной пробы используют питательную среду по А.2.2 (приложение А).

6.4.5    Если для определения плотности (численности) клеток водорослей используют спектрофотометр или флюорат [см. Д.В.2 (приложение Д.В)], то для каждого анализируемого разбавления (концентрации) пробы готовят в отдельных емкостях фоновые растворы без разбавлений и без водорослей (например, исследуемые пробы воды прозрачные, окрашенные или мутные), которые будут служить фоном при проведении измерений.

Примечание - При тестировании окрашенных или мутных проб с использованием водорослей может возникнуть интерференция, ослабляя свет, необходимый для роста клеток водорослей. В таком случае измеряют интенсивность флуоресценции пробы без водорослей (фоновые растворы) и полученное значение вычитают из значения интенсивности флуоресценции полученного при измерении пробы с водорослями.

6.5    Обработка результатов тестирования - по 5.5 с учетом расчетов эффективной кратности разбавления (концентрации), как указано ниже.

ГОСТ 31960-2012

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ, 2014

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

ГОСТ 31960-2012

6.5.1    Построение графической зависимости скорости роста клеток водорослей от продолжительности тестирования

Для каждой кратности разбавления (концентрации,) анализируемой пробы (в том числе и контрольной) строят график скорости роста клеток водорослей в виде зависимости логарифма среднеарифметических значений плотности (численности) клеток водорослей от продолжительности тестирования.

6.5.2    Определение скорости роста клеток водорослей

Для каждой кратности разбавления (концентрации) анализируемой пробы рассчитывают скорость роста клеток водорослей p_i; клеток/ч, по формуле

(3)

lgA/_L-lgA/₀

где N_l-среднеарифметическое значение плотности (численности) клеток водорослей в анализируемой пробе в конце тестирования, клеток/см³;

Л/₀ - среднеарифметическое значение плотности (численности) клеток водорослей в анализируемой пробе в начале тестирования, клеток/см³; t- продолжительность тестирования, ч.

Аналогично по формуле (3) рассчитывают среднеарифметическое значение скорости роста клеток водорослей в контрольной пробе (ц_с).

6.5.3 Замедление скорости роста клеток водорослей /_ц, %, для каждой заданной кратности разбавления (концентрации) анализируемой пробы рассчитывают по формуле

V =^Ю0,    (4)

Их

где ц_с - среднеарифметическое значение скорости роста клеток водорослей в контрольной пробе, клеток/ч;

ц | - среднеарифметическое значение скорости роста клеток водорослей в анализируемой пробе, клеток/ч.

6.5.4    Определение эффективной кратности разбавления (концентрации)

Для каждой заданной кратности разбавления (концентрации) анализируемой пробы рассчитывают по формуле (4), значение замедления скорости роста клеток водорослей в процентах, с использованием формулы (3), или используя график скорости роста (см. 6.5.2), определяют значение 72 ч ЭКР₅₀ (72 ч ЭК₅₀) в зависимости от анализируемой пробы.

Пример определения эффективной кратности разбавления (концентрации) по замедлению скорости роста клеток водорослей приведен в приложении Д.Б.

Если по полученным результатам не удалось точно определить конкретное значение 72 ч ЭКР₅₀ (72 ч ЭК₅₀), то для определения этого значения используют пробит-анализ. Аналогичный пример приведен в приложении Д.Б.

6.5.5    Результаты тестирования считают достоверными, если соблюдаются следующие условия:

a)    плотность (численность) клеток водорослей в контрольной пробе в конце тестирования увеличилась не менее чем в 16 раз по сравнению с плотностью (численностью) клеток водорослей в начале тестирования.

Примечание - Такое увеличение плотности (численности) клеток водорослей соответствует скорости роста клеток 0,9 сут—¹;

b)    коэффициент колебаний темпов роста клеток водорослей в контрольных пробах в каждой из трех колб тестируемой серии анализируемых проб в течение тестирования должен быть не более 7 % относительно среднеарифметического значения плотности (численности) клеток водорослей;

c)    уровень pH в контрольной пробе изменился не более чем на 1,0 ед. pH в конце тестирования;

d)    токсичность модельного токсиканта находится в пределах, указанных в приложении Д.Д.

6.6    Информация о проведенных межпабораторных испытаниях приведена в приложении Д.Д.

6.7    Оформление результатов тестирования - по 5.6.

17

Содержание

1    Область применения....................................................................................................................................1

2    Нормативные ссылки...................................................................................................................................2

3    Термины и определения...............................................................................................................................3

4    Отбор проб....................................................................................................................................................3

5    Метод А..........................................................................................................................................................4

6    Метод Б......................................................................................................................................................15

ПРИЛОЖЕНИЕ А (обязательное) Приготовление питательных сред.......................................................18

ПРИЛОЖЕНИЕ Д.А (обязательное) Методы культивирования водорослей.............................................20

ПРИЛОЖЕНИЕ Д.Б (обязательное) Примеры определения

эффективной кратности разбавления (концентрации)....................................................22

ПРИЛОЖЕНИЕ Д.В (обязательное) Методы подсчета численности клеток водорослей .......................27

ПРИЛОЖЕНИЕ Д.Г (справочное) Приготовление анализируемых проб сточных вод для метода Б.....31

ПРИЛОЖЕНИЕ Д.Д (справочное) Информация о результатах тестирования модельного токсиканта,

проведенных при межлабораторных испытаниях для метода Б.....................................32

ПРИЛОЖЕНИЕ Д.Е (справочное) Сравнение структуры международного стандарта

со структурой межгосударственного стандарта...............................................................33

ПРИЛОЖЕНИЕ Д.Ж (справочное) Требования международного стандарта,

не вошедшие в настоящий стандарт................................................................................34

ПРИЛОЖЕНИЕ Д.И (справочное) Сведения о соответствии межгосударственных стандартов

ссылочным международным стандартам.........................................................................35

Библиография................................................................................................................................................38

IV

ГОСТ 31960-2012 (ISO 10253:2006)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ВОДА

Методы определения токсичности по замедлению роста морских одноклеточных водорослей Phaeodactylum tricornutum Bohlin и Sceletonema costatum (Greville) Cleve

Water. Methods of toxicity determination by growth inhibition of marine unicellular algae Phaeodactylum tricornutum

Bohlin and Sceletonema costatum (Greville) Cleve

Дата введения - 2014—01—01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на природные морские воды и воды эстуариев, а также сточные воды с минерализацией от 6 до 33 г/дм³ и устанавливает определение их токсичности по замедлению роста морских одноклеточных водорослей Phaeodactylum tricornutum Bohlin или Sceletonema costatum (Greville) Cleve после лабораторного биологического тестирования (далее - тестирование) следующими м етод а м и:

-    при переменном воздействии света и постоянной температуре (метод А);

-    при постоянном воздействии света и температуры (метод Б).

Примечание - Метод Б применим для оценки токсичности сточных вод, не содержащих тяжелых металлов, так как комплексообразование с тяжелыми металлами из-за относительно высокой концентрации трилона Б в питательной среде может сделать невозможным тестирование сточных вод, содержащих тяжелые металлы.

Методы применяют также для определения токсичности растворимых веществ, водных вытяжек морских донных отложений, отработанных буровых растворов и твердых промышленных отходов.

Методы позволяют определять токсичность исследуемых объектов и следующие токсикологические показатели (относительно контрольной пробы);

-    эффективную кратность разбавления (ЭКР₅₀) пробы, вызывающую замедление роста [снижение плотности (численности)] клеток водорослей на 50 %, и безвредную кратность разбавления пробы (ЭКР^о), вызывающую замедление роста [снижение плотности (численности)] клеток водорослей не более 10 % за 72 ч (96 ч) тестирования (метод А); за 72 ч тестирования (метод Б);

-    эффективную концентрацию (ЭК^ растворов веществ, вызывающую замедление роста [снижение плотности (численности)] клеток водорослей на 50 %, и безвредную концентрацию (ЭК₁₀) растворов веществ, вызывающую замедление роста [снижение плотности (численности)] клеток водорослей не более 10 % за 72 ч (методы А и Б).

Примечания

1    Продолжительность тестирования 96 ч, указанную для метода А, используют при определении токсичности и токсикологических показателей анализируемых проб отработанных буровых растворов, твердых промышленных отходов и донных отложений.

2    Полученные в лабораторных условиях значения ЭКР, ЭК являются токсикологическими показателями и говорят о потенциальной опасности исследуемых объектов, но не могут быть использованы непосредственно для прогнозирования их воздействия на природную окружающую среду. Однако определенные свойства водорослей, установленные на основе тестирования (например, замедление начала роста клеток; хороший начальный рост, который не сохраняется) могут помочь определить степень воздействия конкретного вещества.

3    Эффективную кратность разбавления (ЭКР₅₀) за 72 ч тестирования обозначают как 72 ч ЭКР^ за 96 ч тестирования - соответственно 96 ч ЭКР₅₀; эффективную концентрацию (ЭК^) за 72 ч тестирования - как 72 ч ЭК₅₀.

4    Тестирование выполняет обученный персонал.

5    Настоящий стандарт не предусматривает ознакомление персонала со всеми проблемами безопасности, связанными с его использованием. Пользователь стандарта несет ответственность за обеспечение соответствующих требований стандарта при проведении тестирования.

Издание официальное

В помещении лаборатории, где проводят тестирование:

-    окружающая среда не должна содержать пара или пыли, токсичной для водорослей;

-    температура окружающего воздуха должна быть (20 ± 2) °С (только для помещения с регулируемой температурой по методу Б);

-    относительная влажность воздуха должна быть не более 80 %;

-    атмосферное давление должно быть 84 - 106 кПа (630 - 800 мм pm. cm.);

-    должно быть обеспечено постоянное равномерное белое освещение в диапазоне от 6000 до 10000 лк (только для помещения с регулируемой температурой по методу Б).

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ ИСО/МЭК17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 17.1.5.05-85 Охрана природы. Гидросфера. Общие требования к отбору проб поверхностных и морских вод, льда и атмосферных осадков

ГОСТ 245-76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия

ГОСТ 612-75 Реактивы. Марганец (II) хлористый 4-водный. Технические условия ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия ГОСТ 4147-74 Реактивы. Железо (III) хлорид 6-водный. Технические условия ГОСТ 4165-78 Реактивы. Медь (II) сернокислая 5-водная. Технические условия ГОСТ 4166-76 Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия ГОСТ 4168-79 Реактивы. Натрий азотнокислый. Технические условия ГОСТ 4174-77 Реактивы. Цинк сернокислый 7-водный. Технические условия ГОСТ 4201-79 Реактивы. Натрий углекислый кислый. Технические условия ГОСТ 4209-77 Реактивы. Магний хлористый 6-водный. Технические условия ГОСТ 4217-77 Реактивы. Калий азотнокислый. Технические условия ГОСТ 4220-75 Реактивы. Калий двухромовокислый. Технические условия ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия ГОСТ 4234-77 Реактивы. Калий хлористый. Технические условия ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия ГОСТ 4461-77 Реактивы. Кислота азотная. Технические условия ГОСТ 4525-77 Реактивы. Кобальт хлористый 6-водный. Технические условия ГОСТ 4529-78 Реактивы. Цинк хлористый. Технические условия ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия ГОСТ 9656-75 Реактивы. Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 10652-73 Реактивы. Соль динатриевая этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты 2-водная (трилон Б). Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия ГОСТ 19126-2007 Инструменты медицинские металлические. Общие технические условия ГОСТ 24104-2001* Весы лабораторные. Общие технические требования ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 27065-86 Качество вод. Термины и определения

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 31861-2012 Вода. Общие требования к отбору проб ^{1 2}

ГОСТ 31960-2012

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3    Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ27065, а также следующие термины с соответствующими определениями:

3.1    плотность (численность) клеток (cell density): Количество клеток в единице объема питательной среды или в анализируемой пробе.

Примечание - Плотность (численность) клеток выражается количеством клеток на кубический сантиметр (клеток/смЗ).

3.2    скорость роста (specific growth rate): Пропорциональное увеличение плотности (численности) клеток в единицу времени.

Примечания

1    Для термина «скорость роста» в [1] приведена следующая формула:

1 dx(Mday)    ₍₁₎

^Ц х df

где х- плотность клеток, кпеток/см^{3 4} ;

t- время, выраженное в сутках.

2    Удельная скорость роста выражается в обратных сутках (сут^-1).

3.3    питательная среда (growth medium): Смесь морской воды и питательных веществ, которая используется для культивирования водорослей и приготовления контрольной пробы.

3.4    испытуемая проба (test specimen): Проба воды (например, сточной воды, поступающей в морские водоемы), проба вещества, донных отложений, отработанных буровых растворов, твердых промышленных отходов, для которой определяется ингибирующее действие на рост плотности (численности) клеток водорослей

3.5    анализируемая проба (sample analyzed): Смесь морской воды, питательной среды, испытуемой пробы и водорослей.

Примечание - В [1] термин приведен как «тестирование среды» («test medium»).

3.6    контрольная проба (control): Смесь питательной среды и клеток водорослей без испытуемой пробы.

3.7    эффективная концентрация, ЭК [effective concentration (ЕС(г)_х)]: Концентрация вещества в анализируемой пробе, которая приводит к х%-ному снижению плотности (численности) клеток водорослей (замедлению скорости роста клеток водорослей) относительно контрольной пробы.

3.8    эффективная кратность разбавления, ЭКР (effective multiplicity of dilution); Степень разбавления пробы (например, сточной воды) питательной средой при подготовке анализируемой пробы, которая приводит к х%-ному снижению плотности (численности) клеток водорослей (замедлению скорости роста клеток водорослей) относительно контрольной пробы.

4    Отбор проб

4.1 Отбор проб воды и донных отложений проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 17.1.5.05, ГОСТ 31861, [2]*, [3]* и [4]*. При этом объем пробы воды должен быть не менее 500 см⁴; масса пробы донных отложений - не менее 2 кг.

Примечание - Отбор проб сточных вод проводят до этапа хлорирования.

Рекомендуемый срок хранения проб природной морской воды, воды эстуариев, сточных вод и донных отложений при комнатной температуре - не более 12 ч после их отбора до проведения тестирования. Допускается хранение проб до проведения их тестирования:

-    не более 48 ч при температуре от О ° С до 4 °С;

-    не более 2 мес при температуре минус 18 °С.

Примечание - Если отобранную пробу воды перед тестированием требуется отстаивать или фильтровать, то отстаивание и фильтрование должны предшествовать ее замораживанию.

4.2    Отбор проб отработанных буровых растворов проводят в соответствии с требованиями технической документации предприятия, на котором образуются отработанные буровые растворы, массой не менее 5,0 кг, при этом под крышкой емкости, в которую отобрана проба, должен оставаться слой воздуха высотой 2 см.

Отобранные пробы отработанных буровых растворов хранят в емкостях - холодильниках при температуре от 0°С до 4°С не более 3 мес.

После вскрытия емкостей-холодильников для подготовки проб отработанных буровых растворов к тестированию срок хранения не должен превышать 14 сут.

4.3    Отбор проб твердых промышленных отходов проводят в соответствии с требованиями технической документации предприятия, на котором образуется отход, массой не менее 2 кг.

Срок хранения отобранных проб твердых промышленных отходов в емкостях с притертой или плотно закрытой крышкой при температуре от 0°С до 4°С - не более 7 сут.

4.4    Отбор проб веществ, условия и сроки их хранения должны соответствовать требованиям стандартов и другой документации на конкретную продукцию (группу однородной продукции).

4.5    Для отбора проб природной морской воды, воды эстуариев, отработанных буровых растворов, донных отложений используют емкости из полиэтилена, полиэтилентерефлата или политетрафторэтилена, а при наличии в воде нефтепродуктов, поверхностно-активных веществ и пестицидов - емкости из темного стекла.

Для отбора проб сточных вод, твердых промышленных отходов используют емкости из темного стекла или нержавеющей стали, при этом не допускается использовать емкости с хромовым покрытием.

Для отбора проб веществ используют емкости из полиэтилена, полиэтилентерефлата, политетрафторэтилена или темного стекла.

4.6    Сроки и условия хранения отобранной пробы указывают в протоколе испытаний.

4.7    Консервацию отобранных проб не проводят.

5 Метод А

5.1    Сущность метода

Сущность метода заключается в регистрации снижения плотности (численности) клеток морских одноклеточных водорослей Phaeodactylum tricornutum Bohlin в анализируемой пробе исследуемого объекта относительно контрольной пробы, определении ее токсичности и токсикологических показателей при тестировании в течение 72 ч (96 ч) при переменном воздействии света и постоянной температуры.

Продолжительность тестирования 72 ч указана для определения токсичности и токсикологических показателей анализируемых проб природной морской воды, воды эстуариев и сточной воды, а также анализируемых проб веществ.

Примечание - Допускается проводить определение эффективной кратности разбавления проб сточной воды (концентрации вещества), вызывающей снижение плотности (численности) клеток водорослей на 50 %, при увеличенной продолжительности тестирования до 96 ч [96 ч ЭКР50 (96 ч ЭК50)].

Продолжительность тестирования 96 ч указана для определения токсичности и токсикологических показателей анализируемых проб отработанных буровых растворов, твердых промышленных отходов и донных отложений.

5.2    Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы, материалы

Климатостат, обеспечивающий поддержание температуры (20 ± 2) °С и освещенность 3000 -6000 лк.

4

ГОСТ 31960-2012

Весы лабораторные по ГОСТ 24104 высокого класса точности (II) с ценой деления (дискретностью отсчета) не более 0,01 г и наибольшим пределом взвешивания 220 г.

pH-метр любого типа, обеспечивающий измерения pH в диапазоне от 3 до 10 единиц pH с допускаемой погрешностью ± 0,05 единиц pH.

Термометр лабораторный с диапазоном измерения от 0°С до 50°С с ценой деления шкалы 0,5 °С.

Оксиметр любого типа, с допускаемой погрешностью измерения не более 0,5 мг О^дм³.

Прибор для измерения минерализации (солености) любого типа (например, карманный рефрактометр-солемер с автотермокомпенсацией) с допускаемой погрешностью измерения общей минерализации (солености) ±1,0 г/дм³ [± 1 ■ 1(Г³ (± 1 %о)].

Пипетки автоматические (дозаторы) любого типа вместимостью 0,1; 0,2 см³ с допускаемой погрешностью аттестованного значения ± 1,0%.

Пипетки по ГОСТ 29227, вместимостью 1, 2, 5, 10 см³ с ценой деления 0,1 см³.

Микропипетки по ГОСТ 29227, вместимостью 0,1; 0,2 см³ с ценой деления 0,01 см³.

Колбы мерные по ГОСТ 1770, 2-25-2, 2-50-2, 2-100-2.

Колбы стеклянные (конические) лабораторные по ГОСТ25336, вместимостью 0,25; 1 и 2 дм³.

Счетная камера (камера Горяева).

Микроскоп биологический типа МБР или МБИ, обеспечивающий увеличение в 100- 200 раз.

Примечание - Допускается определять состояние роста культур водорослей, используя фотоэлектроколориметр, спектрофотометр, флуориметр (далее - приборы), обеспечивающие возбуждение флуоресценции водорослей в диапазоне 400 - 500 нм; регистрацию флуоресценции в диапазоне 650 - 750 нм.

Мешалка магнитная.

Устройство для встряхивания любого типа (например, орбитальный шейкер, каналка-мешалка).

Центрифуга лабораторная медицинская.

Сушильный электрический шкаф общелабораторного назначения.

Аквариумный микрокомпрессор любого типа, например АЭН-4.

Шпатели металлические по ГОСТ 19126.

Холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры минус (20 ± 1)°С и от 2 °С до 4 °С.

Ступки и пестики фарфоровые по ГОСТ 9147.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Фильтры обезволенные «белая лента».

Фильтры мембранные с диаметром пор 0,45; 3,5 мкм.

Установка для фильтрования любого типа.

Пробирки стеклянные по ГОСТ 25336 вместимостью 10 см³.

Цилиндры по ГОСТ 1770, вместимостью 25, 50, 100, 1000 см³, второго класса точности.

Стаканы стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336 вместимостью 50, 100, 500, 1000 см³.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или деионизированная.

Природная или искусственная морская вода, минерализацией 33 г/дм³ (соленостью 33 %о) (далее-вода для разбавления).

Примечание - Если в качестве воды для разбавления используют природную морскую воду, то ее отбирают вдали от берега с глубины 3-5м и транспортируют в лабораторию в стеклянных или полиэтиленовых емкостях. При этом допускается для приготовления питательной среды и водных вытяжек использовать природную морскую воду, отобранную в условно чистом месте района исследования.

В лаборатории природную морскую воду фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм, чтобы удалить взвешенные вещества и организмы, и хранят в темном месте при комнатной температуре не боле одного года.

Питательная среда (среда Гольдберга), приготовленная в соответствии с требованиями приложения А.

Прим ечан и я

1    Емкости, используемые для приготовления питательной среды, должны быть изготовлены из стекла.

2    Питательную среду используют для культивирования водорослей, приготовления контрольной пробы и анализируемых проб разбавлением.

Тест-организмы: морские одноклеточные водоросли Phaeodactylum tricomutum Bohlin.

5

Примечания

1    Методы культивирования водорослей Phaeodactylum tricornutum Bohlin приведены в приложении ДА.

2    Допускается хранение водорослей Phaeodactylum tncornutum Bohlin на агаризованной питательной среде Гольдберга при температуре от 2°С до 4 °С не более 12 мес без потери их жизнеспособности.

Модельный токсикант: калий двухромовокислый по ГОСТ 4220, ч. д. а.

Калий хлористый по ГОСТ 4234, х. ч.

Калий азотнокислый по ГОСТ 4217, х. ч.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233, х. ч.

Натрий сернокислый по ГОСТ 4166, х. ч.

Натрий углекислый кислый по ГОСТ 4201, х. ч.

Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный по ГОСТ 245, х. ч.

Кобальт хлористый 6-водный по ГОСТ 4525, х. ч.

Кальций хлористый, безводный, х. ч.

Магний хлористый 6-водный, по ГОСТ 4209, х. ч.

Марганец (II) хлористый 4-водный по ГОСТ 612, х. ч.

Натрий кремниевокислый 5-водный, х. ч.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х. ч.

Натрий азотнокислый по ГОСТ 4168, х. ч.

Железо (III) хлорид 6-водный по ГОСТ 4147, х. ч.

Цинк сернокислый 7-водный по ГОСТ 4174, х. ч.

Медь (II) сернокислая 5-водная по ГОСТ 4165, х. ч.

Кислота азотная по ГОСТ 4461, х. ч.

Кислота борная по ГОСТ 9656, х. ч.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, х. ч.

Тиамин гидрохлорид.

Биотин.

Витамин В₁₂ (цианокобаламин).

5.3 Подготовка к тестированию

5.3.1    Подготовка посуды

5.3.1.1    Емкости, используемые для тестирования, должны быть химически чистыми.

Для проведения тестирования используют только стеклянную посуду.

5.3.1.2    Стеклянную посуду для тестирования осторожно промывают 10%-ным раствором азотной кислоты и выдерживают 2-3 ч при комнатной температуре, затем тщательно промывают водопроводной водой, обрабатывают раствором натрия углекислого кислого, промывают водопроводной водой, после чего не менее трех раз ополаскивают дистиллированной водой.

При сильном загрязнении посуды, а также новую посуду промывают водопроводной водой, заполняют 10%-ным раствором азотной кислоты и выдерживают в течение суток, после чего обрабатывают раствором натрия углекислого кислого, затем тщательно промывают водопроводной водой и не менее трех - четырех раз ополаскивают дистиллированной водой.

5.3.1.3    Емкости и посуду для тестирования сушат на воздухе при комнатной температуре, затем стеклянную посуду, за исключением мерной, помещают в сушильный шкаф и выдерживают в течение одного часа при температуре 150° С.

Чистую посуду (емкости) закрывают стеклянными притертыми пробками или крышками и хранят в шкафах или на полках.

5.3.2 Приготовление искусственной морской воды

Искусственную морскую воду готовят на дистиллированной воде из реактивов, вносимых в количествах, приведенных в таблице 1.

Таблица 1

Наименование реактива Масса реактива, вносимая на 1 дм3 дистиллированной воды, г Натрий хлористый по ГОСТ 4233 (NaCI) 22,00 Магний хлористый 6-водный по ГОСТ 4209 (МдС12 ■ 6Н20) 9,70

1

В Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008 «Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».

2

3

Действуют для Российской Федерации.

4