госкгагассЕР. по швчвсш средства борьбы с вреде елям

БОЛЕЭНЯЯ РЛСТВНИ1 й СОРНЯКАМИ ПРВ ШШСЕЙЫС08Е СССР

Ы2Т0ДЗЧЕСШ Ш8АНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ШКРОКОЛИЧВСТВ ПЕСТИЦИДОВ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ, КОРНАХ И ВНЕШНЕЙ СРЕДЕ

часть т-я

Мооюва - 1984

Настоящие методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исслег^вательских учреж-дений Минздрава СССР, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза СССР и лабораторий других Министерств и ведомств, занимающихся анализом остаточных количеств пестицидов и биопрепаратов в продукт' х питания, кормах и внешней среде.

Срок действия временных методических укаАий устанавливается то утверждения гигиенических регламентов.

Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных группой экспертов при Госкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками при МСХ ХСР.

Методические указания согласованы и одобрены отделом перспективного планирования санэпидслужбы ИМПиТМ им. Марциновского Е.И.

1 лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом упраздним Минздрава СССР.

РЕДАКЦИОННАЯ КОЛЛЕГИЯ :

Л.Г. Александрова, Д.В. Гиренко, А.А.Калинина (секретарь), М.А. Клисенко (председатель), Г.И. Короткова, Г.А. Хбхоль-кова ( зам. председателя), В.Е. Кривенчук.

248.

стр.

Сумилекса......... 166

Томллона.................... 173

Триморфамида.................. 180

Фекама-трибуфона................ 136

Фталаиа.................... 192

Лропарата 242 и металлилхлорида (MX) ... .    200

Хоотаквкка ................... 206

Эдила..................... 210

П. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРВДЛШЮ нвслмшиюв в ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ,КОРМАХ И ВНЕШНЕЙ СРЕДЕ

Хлороргапическяе пестициды

Методические указания по определению остаточных

количеств гексахлорана (линдэка) в оушеном

картофеле полярографическим методом....... 213

Фосфоропганические пеотипиды

Методические указания по определению дифосв (абата) в продуктах животного происхождения методом тонкослойной хроматографии ....... 218

Методические указания по определению мотафоса, фосфамида и хлорофоса в сушеных овощах и плодах (картофель, морковь, петрушка, яблоки, груши, слива) методами тонкослойной и газо-жидкостной хроматографии .................. 223

Временные методические указания по определению метилпитрофоса.фенитрооксона и п-нитрокреэола в лесной растительности и почьо тонкослойной

хроматографией .................. 241

Методические указами." по определению трихлорметвфоса-3 и его метаболитов в биоматериале методом газожидкостной хроматографии ............ 252

331.

"ИВЕР ЩТ Заместитель Главного Государственного еапитпрного врача СССР Л. И.Зайченко

3798-83._

^и СЗ^М мая 19«Эг*

ВРЕМЕННОЕ 1гзтодичес;сие 7’хкзнт

по определению остаточных количеств биопрепарата вирин-ХИ на растительных объектах имиунофлпорес-цемтныи методом

Настоящие методические указания распространяются на определение содержания го внешней среде полиэдров вируса «верного полиэдроза кольчатого шелкопряда ^ ВЯТТ fOTJ, являющегося дейст-вуидим началом вирусного инсектииидного препарата пирин-КВ ггои разраоотке санитарных регламентов, при санитарном контроле, а также в научных исследованиях.

I. Основные положения

В основе имиуно^люоресцентного метода выявления микроорганизмов летит специфическая реакпия взаичодействкя г.пткгена с антителами, которая при условии окраски ингредиентов реакции, выявляется в виде специфического свечения комплекса антиген* антитело в люминесцентном микроскопе.

Для выявления микроколичеств препарата .вирин-КШ во внешней среде применяется непрямой вариант ИФ-мстода с использованием кроличьей специфической иммунной сыворотки и стандартной меченой флиюрохромои ослиной сыворотки против глооулимов кролика.

Остаточные количества иекуловирусиых инсектицидов во внешней среде проводят выявление»-* полпэдров (телец-в»алчений J этих вирусов, поскольку чепоср^ственно вирусиые частицы весь-!*'• лаокльнк, легко разрупаьтся под влиянием различных Факторов. Подточу для выявления лолкэгров (аитигепа; готовят специфическую антиполисдвинул иммунную сыворотку. Реакция выявляется Под

332.

микроскопом в виде ярко-зеленого стечения полиэдров, особенно их ооодка.

1.Т. Характеристика анализируеиого инсектицида

ьирйп—H3D - вирусный эятомопатогенный (иьсектипидныЯ.) препарат. Предназначается для оорьбы с гусеницами кольчатого шелкопряда. Действующий началои препарате является вирус ядерного полиэдроза из сеиейства Оакуловирусов, содержащийся в препарате в виде полиэдров. Полиэдры - вирусные тсльца-вклячения, образуется в клетках тканей оольных гусениц, представляют соооЯ многогранники из кря&тализованыого белка, содержащие от десятка до нескольких сотен вирусных частиц. Размеры полиэдров 1-Змк. Препарат представляет соо^ю суспензию полиэдров в 905*» глицерине с титром пе менее 1*10 полиэдроь/мл. Применяется путем опрыскивания плодовых деревьев против гусениц разных возрастов. Норма расхода препарата 1и0-^ии мл на 1 г_в сада с добавлением поверхпосного алтиввого вещества ОП-7 из расчета 0,6-4,0 г на 10 д воды.

1.2.    Метрологичсолам характеристика метода

Данным методом миино определить количество полиэдров в суо-страте в препаратах от 0,5*10² и более в мл.

1.3.    Избирательность метода

При условии применения качественной гипериммунной антипо-лжэдренноя сыворотки и устранения неспвцифического свечения в исследуемых препаратах метод расценивается как специфичный и высокочувствительный, а также как экспресс-метод. Метод можно использовать для выявления полиэдро* ВЯЛ КШ на растительных объектах окружающей среды при разраоотке гигиенических регламентов, а также в паучных исследованиях для целей идентификации этого вида вируса.

2, Отбор н об

Проводят согласно "Унифицированным правилам отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и ооъектов

333.

окружающей среды для определения иикроколичеств пестицидов", утвержденным U3 СССР 21.03.1979 JG205T-79, приложение 3 (3.4.1.7.2 - 3.4.7.2.5 способ отбора проб "ОШ" (отбор штук.) и "ПД" (отбор по диагонали) различных видоя древесной и травяной растительности). Для дальнейией работы пробы хранят при температуре бытового холодильника ♦4°С.

С целью выярления полиэдров на поверхности объектов проводят смывы с них. Пинцетом берут из заранее приготовленных стерильных пакетов марлевую салфетку (5x5 см), смачивают ее в физиологическом растворе (0,15У ЯаСГ) с pH 7,4-7,6, отнимают и тщательно протирают ею исследуемую площадь в 100 см ,( т.е. смыв с поверхности плодов, листьев, коры деревьев и проу.), переносят салфетку в колОу со ГОО мл физиологического раствора, энергично встряхивают 5 мин, откипают салфетку пинцетом и удаляют ее. Chub фильтруют через 3 слоя марли для удаления груоих частиц, после чего центрифугируют при 5 ООО об/мин X минут. Осадок рссуспендируют в I ил дистиллзфоэанноя поды. Если проса состоит из мелких объектов (трава, листья, ягод» и др.), и тыном случае готовят навеску 200-300г, делают нарезку из мелких листьев, помешают в колоу или пирокогорлые банки, добавляют 200-300 мл физиологического раствора с pH 7,6, ставят на магнитную мешалку или энергично встряхивают 10-15 мин, отстаивают 10 мин. надосадок центрифугируют при 5 ООО об/мин X нИп. Осадок ресуспендируют в I мл дистиллированной воды.

Для дальнеЛоих раоот пробы хранят при ♦4°С до 3-х суток.

Площадь поверхности круглых плодов, например яблок, определяют по формуле «/«ПД , предварительно измерив диаметр яблок. Площадь поверхности листьев определяют следующим образом: обводят на оумаге контур листка, по крайним точкам контура строят прямоугольник и измеряют его площадь. Определяют вес прямоугольника и вырезанного контура. Из полученной пропорции вычисляют площадь листка.

3. Реактивы и материалы

1.    Лючинеспируищая ослиная сыворотка против глобулинов кролика. изготовленная-институтом им.Гамалея г.Москва.

2.    Имунная специфическая кроличья сыворотка против полиэдров

ВЯЛ кв.

334.

3.    Нефлооресаируыщее иммерсионное масло или димет\-дфталат.

4.    Дистиллированная вода.

5.    Физиологический раствор (0,15U tfaCI) pH ^у,4-7,6;.

6.    Апетон^ГОСТ 2633-71

7.    Уертиолят натрия или оорная кислота,ГОСТ 9656-61.

8.    Сипька Эванса.

9.    Лдъивант Фрей ада.

ТО. Антибиотики (пенициллин, стрептоиицин, 5-пИгрооксихинолин).

4.    Приборы и посуда

Т. Люминесцентный микроскоп марки Ш1-2 или МЛ-3.

2.    Центрифуга ЦЛС-i или ЦЛн-I и др..

3.    Пипетки градуированные на I,0 и 5,0 мл_fГОСТ 1770-51.

4.    Чашки Петри.

5* Предметные стекла.

6.    Пробирки бактериологические.

7.    Химические стаканы на 250 мл,Г0СТ 6236-52.

8.    Пакеты марлевых салфеток 5x5 си.

9.    Камера Горяева.

5.    Подготовка к определении

Как указывалось выше основными реагентами, пеооходммыын для выявлепия антигена испрямим вариалтом ИФ-могода, являитси игшуныые сыворотки, а именно - меченая ФИТЦ сыворотка против глобулином кролика (изготопЛснлыя в Институте им.Гамалея г.Москва) и специфическая иммунная сыворотка против полиэдров в даппОм случае ВЯЛ КИ, В настояний момент антипо диэдре., аые сыворотки «е изготовляется пока цептрализованно. Для производства аналива их можно получить у авторов методик, у автором препарата, а также Минздрав можь. заказать ее изготовление в институте им.ГамаЛся.

Дли других лабораторий, работающих с бануловирусами, рс-комеддуе/гся самостоятельно изготовить антисыворотку к полиэдрам из препарат* вирин-КШ по следующей схеие.

Получение «штигепов для иммунизации ЖИВОТНЫХ ПрОнОДИЛИ непосредственно из препарата инсектицида вирин-КИ, во лучше получать его из больных гуч,- лиц соответствующего вида. Очистку и

335.

концентрацию вели по В.М.Барановскому и С.А.Бахвалову, 197¹.²

За сутки до введения животным взвесь полиэдров обрабатывают антибиотиками из расчета 500-1000 ЕД стрептомицина и пенициллина, 20 икг/кл 5-нитрооксихинол::ка. Перед имиунизадней взвесь стерильно отмь-аст от антибиотиков, полиэдры ресуспен-дируют в стерильном физиологическом растворе. Титр инокулята обычно 1.10^ пдр/VJL.

Наличие специ«' ической гипериммунной сыворотки ягляется главным условием хорошего воспроизведения ИФ-метсда.

Приготовленным антигеном иммунизируют беспородных кроликов массой 2,5-3 кг. Высокотитровакные сыворотки получают по следующей схеме иммунизации: трехкратные с интервалом в три дня подкожние обкалывания с введением соответственно 2,0,

А,0, 6,0 мл антигена ь смеси 1:1 с адъювантом Фрейнда. Через две недели реиммунизация 6,0 мл смеси подкожно. Забор kdobh через неделю после реиммунизации.

Сыворотку хранили с коксергантом(мертиолят 1:10000) пои -20°С, либо лиофилкзкровали. Высушенная сыворотка сохраняет активность до 5 лет при хранении ²ч°с.

6. Проведение определения

Хорошо обезжиренное предметное стекло помещают на миллиметровую бумагу, на которой отмечен прямоугольник площадью 4 cn^. Затем на стекло микропипеткой наносят 0,02 мл исследуемой суспензии, равномерно распределяют ее по отмеченной площади, Препарат подсушивают на воздухе и фиксируют в ацетоне 15 мин. Для гашения неспецкфического сЕеченил используют синьку Эванса в разведении 1:10000 дистиллированной водой. Время обработки препарата синькой 10 мин, Затем препарат промывают проточной водой и подсушивают, после чего препарат должен иметь слабо голубую окраску. Затем на препарат наносят иммунную сыворотку против полиэдров ВЯП КШ, прсварительно разведенную.1:10 физиологическим раствором, помещают во влажную камеру на 20 мин при 37°С, затем смываю? проточной водой, подсушивают на воздухе,

336.

после чего наносят ослиную .    сыворотку в рабочем

разведении, указанном на ампуле. Выдерживает ъ термостате при 37°С 20 мин. во влажной камере с поел едущей промывкой в проточной воде. Подсушенный препарат' готов к просмотру в люминесцентном микроскопе. Препарат просматривают под иммерсией, используя нефлюоресцирующее масло, объектив 50, окуляр 8.

Полиэдры в препарате выявляются по специфическому яркому, желто-зеленому свечению их ободков на общем красноватом фоне препарата.

Контроли: а) препараты, приготовленные по той же схеме, но без обработки специфической иммунной сывороткой; б) препараты, обработанные обеими сыворотками, но заведомо не содержащие выявляемых полиэдров. В контрольных препаратах свечение полиэдров не выявляется,

7. Обработка результатов анализа

Кроме визуального определения полиэдров (качественный анализ), можно произвести количественный анализ, т.е. определение числа полиэдров на единицу изучаемой площади. Для этого необходимо преварительно определите площадь поля зрения при данном увеличении или площадь квадрата окулярной сетки (» случае использования окуляра с сеткой). Эти измерения проводят с помощью объект-микрометра.

Подсчет числа полиэдров ведется по формуле ^йш ^

где

М - количество полиэдров в I мл исследуемой суспензии (концентрат смыва со 100 см^ поверхиост.:); а - среднее число полиэдров в одном квадрате окулярной сетки;

%Г - площадь исследуемого мазкв в мм^; у - объем нанесенной суспензии в мл;

- площадь квадрата окулярной сетки в мм^. и

Подсчет полэд^ов проводят в 100 и более квадрашх оку-дярцой сетки.

Пример: для анализа взяли листья с обработанного препаратом дерева, определили среднюю площадь их поверхности - 100с»г,

337.

Сделали смыв с листьев и обработали его способом, описанным в ц.З. Приготовленным препарат покрасили по непрямому методу Кунса, как описано в п.7.

Цри просмотре пре пара ига в люминесцентном микроскопе подсчитали общее количество полиэдров в 150 квадратах окулярной сетки ₅ 150*320, отсода _а .    320    . _{2 1Э}

150

Площадь мазка известна^- 20мм х 20ми» 400мм². Сторона квадрата окулярной сетки равна 0,0062 мы (определили с помощью обьект-мнкроыетра), т.о, площадь квадрата окулярной сетки*£«»(0,0062)²-0,00004 ыьг. Обьеы нанесенной на стекло суспензии у» 0,02 мд.

Таким образом й » а * S    «*    2.13    *    400    • 1,Х    *10^

У *~£    0,02    •    0.00004

2    9

т.е, на 100 см обследованной площади приходится 1,1*10 полиэдров, а на I см² площади - 1,1*10 .

9. Требования безопасности

Соблюдаются требования безопасности, обычно рекомендуемые для работы с микроорганизмами 17 группы (условно патогенные).

9. Разработчик.

Васильева В,Л», Трусов В.И. - Киевский ШШ эпидемиология

и инфекционных болезней им. Д.В.Громашевского

347.

СОДЕРЖАНИЕ*

X. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ИЗМЕРЕНИЮ КОНЦЕНТРАЦИИ В ВОЗШЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ:

отр.

Агелояа и ситрина.................. 3

Актеллика и пришпида............'. . . .    8

Алвпа........................13

Бен8оилпгюпэтпла и этилового эфипа N-3,4- дяхлор-

фенилаланина........ 17

Беномила и ЕМК.......... 22

Беятаэона......................30

Биопесметрина.....................35

Болстапа.......................40

Боояокота......................48

Бутилкаптакса .......... 52

Бутокагбоксима....................59

Гидрела . '.......................63

ГМК-Na....................... 66

Даконкля...................... 70

Диавиноня, эптама, гамма-изомера ГХЦГ.фенмедедифама,

лекапила.фосфашда и пиразояа..........77

Дигид ~ела...................... 69

Диквата........................93

Зоокука-чпа.....................37

Карбофурана.....................100

Кречетояа......................ХО**

Мепида и 3-хлор-4-метил8тгилина....... X0Q

Метазина и компонентов гярбишщной смеси "карагард" . ИЗ

Митака....................... 118

Офунака............. 124

Пликтрана..................... ^т28

Ратпяданэ..................... Х32

Раунда на..................... Х38

Ровряля ...................... 143

Розалина..................... Х43

Синтетических пиретроидов (амбуп.депис.рипкорд,

сут/;пп'Д':н). *. ......... 154

С томна....................... XGI

1

"Наука", Новосибирск, 1974, 6-1I

2

Барановский В.М., Бахвалов С.А. в кн.:"Вирусы насекомых",