ГОСКОМЙССИЯ ПО ХИМИЧЕСКИМ СРЕДСТВАМ БОРЬБЫ С ВРЕДИТЕЛЯМИ. БОЛЕЗНЯМИ РАСТЕНИЙ И СОРНЯКАМИ ПРИ МИНСЕЛЬХОЗЕ СССР

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ МЖРОКОЛИЧЕСТВ ПЕСТИЦИДОВ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ, КОРМАХ И ВНЕШНЕЙ СРЕДЕ

ЧАСТЬ Х1У-Я

Москва - 1984

250.

ферментным раствором. Далее поступает так, как описано в 2.2.3.

Щ метатиона и фенитрооксона на пластинках с силикагелем КСК составляет соответственно 0,60 - 0,05 и 0,17 * 0,02»

Rf- ^метатиона и фенитрооксона на пластинках "Силуфсл" соответственно равны 0,45 ± 0,03 и 0,32 ± 0,05.

Хроматографическое определение ^етатиона _f п-нитрокре-зола и фенитрооксона в тонком слое силикагеля с добавкой цинковой пыли.__

Объединенный экстракт пробы упаривает на ротационном испарителе до небольшого объема, аликвотную часть его наносят на хроматографические пластинки. Рядом наносят известное количество стандартного раствора каждого из препаратов. Хроматографирование производят в смеси гексана с ацетоном в объемном соотношении 2:1.

Проявление зон локализации препаратов на пластинке в виде желтых пятен на белом фоне производят по варианту 2.2.2.А.

R| метатиояа _# фенитрооксона к п-нитрокрезола соответственно составляет 0,Х4 - 0,02 ; 0,24 ~ 0,04; 0,43 ± 0,05.

Хроматографическое определение гьетатиока и п~яитрокрезола.

Аликвотную часть упаренного аликвотного экстракта наносят на хроматографические пластинки ^Силуфол¹¹, рядом наносят известное количество стандартных растворов*$гв*таяа    и    п-нитрокрезола.

Разделение производят в смеси гексана с ацетоном в объемном соотношении 2:1.

После выветривания растворителя хроштографсаческив пластинки проявляют по типу 2.2.2.Б. Зоны локализации препаратов обнаруживаются в виде лимонно-желтых пятен на белом фоне»

Rf мататиояа я п-нитрокрезола составляет соответственно 0,45 ? 0,03 * 0,17 + 0,02.

Для обнаружения катиона _н п-внтрокрезола возможно также использование хроматографических пластинок на основе окиси алгашшя о проявлением 20# раствором едкого натра при 170~Х80°Сф

2bl.

Хроматографическое определениец^хавиона ^в тонком слое стандартных пластинок ЛЗилуфэл¹¹.____

Аликвоту упаренного до небольшого объема (0,2-0,4 мл) экстракта (предварительно очищенного по 2*4.3) наносят на пластинку "Си-луфол", разделенную на зоны хроматографирования.вертикальными полосами* Рядом наносят стандартны? раствор метилнитрофоса (соответственно 0,25; 0,5 и 1,0 мкг препарата).

Хроматографическое разделение производят в смеси гексана с аието* ном в объемном соотношении 2:1.

Боны локализации препарата проявляет по типу 2.2,2 в виде ярких'фиолетово-синих пятен на желтом фоне с RJ 0,45 -0,03.

2.6. Обработка результатов.

Содержание препарата определяют путем сравнения площади пятен пробы и стандарта.

Окончательный расчет содержания препарата в анализируемом объекте производят по формуле

X —    мг/кг

йГ- Р

Ttae*а - количество препарата, обнаруженное в аликвотной части экстракта, взятой для хроматографирования (мкг);

(Г-объем аликвоты экстракта, нанесенной на хроматографическую пластинку (мл);

V- конечный объем экстракта (мл);

Р - масса анализируемой пробы (г).

2,7# Требования безопасности.

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями и токсическими веществами.

3. Методические указания разработаны: В_#Ф.Демченко, Е.И#Да*видюк, Всесоюзный научно-исследовательский институт гигиены и токсикологии пестицидов, полимерных и пластических масс, г.Киев.

242.

рим в большинстве органических растворителей (ацетоне, бензоле, хлороформе, даэтиловом эфире, этиловом спирте и др*}.

Препарат средней токсичности:    для различных эксперимен

тальных животных находится в пределах 142 - 1000 мг/кг.

Ыетатион* выпускается в виде '' г 50^ -ного концентрата эмульсии и препарата для ультрамалообьемного опрыскивания* Основные продукты метаболического превращения метаете®* во внешней среде: фенитрооксон

, ^отз

\=/ ^л°²

0    {^ Ц 261,2}

- бесцветная жидкость с неприятным запахом, трудно растворим в воде и хорошо растворим в большинстве органических растворителей*

пчннтр о крезол

СН

но

(м. м. 153,1)

- кристаллическое вещество с температурой плавления 12Э°С, трудно растворимое в воде, хорошо растворимо в органических растворителях.

2* Методика хроматографического определения

метатиока , фенитрооксона и п-нитрокрезола в тонком слое сорбента*

Основные положения*

2*1* Принцип метода.

Методика основана на извлечении иегатиоаа и его метаболитов из пробы смесью органических растворителей и последующем эн-зимнохроматсмафическом определении препаратов, способных к угнетению холинэстеразы печени крупного рогатого скота( метатиод и фенитрооксон) , либо хроматографическом определении в тонком слое сорбента с применением разлИ*Дтых проявляющих реагентов*

243.

2.1.2.    Метрологическая характеристика метода.

Метрологическая характеристика метода представлена в таблице

2.1.

2.2.    Реактивы и растворы.

2.2.1.    Реактивы.

Ацетон, х.ч., ГОСТ 2603-79. н-Гексан, ч., ТУ 6-09-3375-78.

Эфир диэтиловый.

Этиловый спирт, осч., ТУ 09-4512-77.

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.

Алюминия окись безводная для хроматографии, ч., ТУ 6-09-3916-75. Бром, ч.д.а., ГОСТ 4109-79.

Бромфеноловый синий водорастворимый индикатор, ч.д.а.,

ТУ 6-09-1053-76.

п-Диметилашнобензальдегид, х.ч., ТУ 6-09-3272-77. Индоксилацетат, ч.д.а., ТУ 711-57-69.

Кальций сернокислый безводный, ч.д.а., ГОСТ 3210-66 (хранят в банке с притертой пробкой).

Калий железосинеродистый, х.ч., ГОСТ 4206-75.

Калий железистосинеродистый, х.ч., ГОСТ 4207-75,

Кислота лимонная, ч,, ГОСТ 3652-69.

Кислота борная, ч.д.а., ГОСТ 9656-75.

Кислота уксусная ледяная, х.ч., ГОСТ 61-75.

Кислота ортобюфорная, ч.д.а., ГОСТ 6552-80.

Натрий сернокислый б/в, ч., ГОСТ 4166-76.

Натр едкий, х.ч., ГОСТ 4328-77.

Серебро азотнокислое, ч.д.а,, ГОСТ 1277-75,

Силикагель КСК.

Силикагель АСК.

Цинк металлический в порошке (марка ТЩГ), ГОСТ 12601-67,

2.2.2.    Проявляющие реагенты, для хроматографии в тонном слое сорбента.

А. 0,25 /S-ный раствор п-диметиламинобензалъдегида в этаноле. Хроматографические пластинки обрабатывают смесью раствора А

Таблица I

Метрологическая характеристика метода определния мв*а*иона ₉ фенитрооксона и п-китрокрезола тонкослойной хроматографией в объектах леса*

Наименование: Анализи-: вещества груемый ; :объект	:Среднее:Стандарт-: :значение:ное от- : : определ ^ клонение,: : (%) : {%) :		Относит. стадд. отклон.; (*)	:Доверит. :интервал	: Размах :варьиро-:вания/ : (%)	:Пределы ■:ойнаруж. :(мг/кг)	: Примечание
Метатиок. ~ хвоя	Gb,00	5,00	0,08	7,09	10,00	0,01	тех
	72,50	2,50	0,03	3,55	5,00	0,0001	энзимно-хромат,
лесная	90,00	5,00	0,05	7,09	10,00	0,02	тех
подстилка 85,00		5,00	0,06	7,09	10,00	0,0002	энзимно-хремат,
почва	57,50	2,50	0,04	3,55	5,00	0,02	тех
	77,5	2,50	0,03	3,55	5,00	0,0001	энзимно-хромат,
Фенитрооксон хвоя лесная	88,75	1,25	0,01	1,77	2,50	0,0001	энзимно-хромат.
подстилка 82,50		2,50	0,0з	3,5з	5,00	0,0002
почва	65,00	5,00	0,04	3;55	10,00	0,0001	U
п-нитрокре-
зол хвоя	73,50	1,50	0,02	2,13	3,00	0,01	тех
почва	68,7Ь	6,2b	0,09	9,2*	2,50	0,02	м

24b.

с ледяной уксусной кислотой в соотношении 10:1 (готовят перед употреблением)*

Б. 5 %~тй водный раствор едкого натра.

Хроматографические пластинки обраоатывают раствором Б и термо-статируют в сушильном шкафу при температуре 100°С в течение 3-5 минут.

В. I. 2 #-ный водный раствор азотнокислого серебра.

II. 0,4 #-ный водный раствор броыфенолового синего,

^ТП. 4 #-ный водный раствор лимонной кислоты.

Хроматографические пластинки обрабатывают смесью растворов I и II в объемном соотношении I ; I (готовят перед употреблением), термостатируют в сушильном шкафу при Ю0°С в течение 2-3 минут, а затем опрыскивают раствором III.

2.2.3. Рабочие растворы и проявляющие реагенты для тонкослойнохроматографического анализа с энзимным проявлением.

Универсальная буферная смесь: в мерной колбе на I л растворяют в дистиллированной воде 2,47 г борной кислоты, 2,3 мл уксусной кислоты и 2,1 мл орто-фосфорной кислоты, затем объем раствора доводят до I л.

0,2 Н водный раствор едкого натра: в мерной колбе емкостью 100 мл растворяют в дистиллированной воде 0,800 г едкого натра, объем раствора доводят дистиллированной водой до 100 мл.

Фосфатный бущор(рН 8,69): 100 мл универсальной буферной смеси смешивают с 65 мл 0,2 Н раствора едкого натра.

Ферментный раствор: I г свежей или однократно замороженной (годна в течение 6 месяцев) печени крупного рогатого скота растирают в фарфоровой ступке с 9 мл буферного раствора (pH 8,69); гомогенат\ фильтруют нерез слой обезжиренной ваты, полученную сыворотку смешивают с буферным раствором (pH 8,69) в объемном соотно^-шении 1:4.

Раствор калия железосинероднотого: 1,645 г калия железосинеродистого растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

Раствор калия железистосинеродистого: 2,II г калия железисто-оинеродистого раотворяют в 100 ir^r дистиллированной воды.

Проявляющий реагент: 10 мг индоксил ацетата /на кончике скальпеля/ непосредственно перед употреблением растворяют вЗш этанола, после чего добавляют I мл раствора калия железосинеродистого и I мл раствора калия железистоси. еродястого.

Хроматографические пластинки опрыскивают свежеприготовленным ферментным раствором и инкубируют при 38°С в термостате, насыщенном водными парами, для чего на дно термостата помещают чашки Петри с водой* Длительность инкубации определяется выбором пластинок для хроматографии: 60 мин* .для пластинок с силикагелем КСК и 30 мин. для пластинок "Силу^ал".

После инкубации хроматографические пластинки опрыскивают проявляющим реагентом и снова помещают в термостат до четкого проявления зон локализации пр епаратов в виде белых пятен на синем фоне.

Примечание: па одну пластинку "Силуфюл” расходуется 1,5-С мл, а с силикагелем КСК 3-4 мл пролвляэдегс реагента.

Стандартные раствор: препаратов в этиловом спирте, содержащие 1000, 100, 10 и I мкг/мл /хранят в посуде темного стекла с пришлифованными пробками в холодильнике/.

2.3; Приборы и посуда.

Аппарат для встряхивания, ТУ 64-4-2451-78'.

Баня водяная, ТУ 64-1-2850 -76

Бесы технические, разновесы, ТУ 64-I-I065-73.

Испаритель ротационный, ГОСТ IOPC0-77

Микрошрицьт емкостью 10 мкл.

Пульверизаторы стеклянные для опрыскивания пластинок.

Шкаф сушильный, МРТУ 42-I4II-6I.

Воронки химические, ГОСТ 8613-75*

Воронки делительные, ГОСТ 8613-75.

Камера для ‘фоматографирования, ГОСТ 10565-63.

Катлера для опрыскивания хроматографических пластинок,

ГОСТ 10565-63.

Колбы конические, емкостью 250 £л, ГОСТ 10394-72.

Колбы кругл о донные, ГОСТ 10394-7 2,

ьикропипетки емкостью 0,1 мл, ГОСТ 20292-74.

247.

Пластинки стеклянные хроматографические размером 9 х 12 см. Пипетки мерные, ГОСТ 20292-74,

Сито капроновое /100 меш/.

Ступки фарфоровые с пестиками.

Цилиндры мерные, емкостью 25,50 и 100 мл, ГОСТ 1770-74, Эксикаторы.

Пластинки хроматографические.

Стандартные хроматографические пластинки "СиЛуфш" или "Силу-фал^н УФ-254 /вариант проявления зон локализации препаратов на пластинках 2,2,2 Б и В, 2,2,3/.

Хроматографические пластинки с тонким слоем силикагеля КСК, скрепленным гипсом ¹ /вариант проявления зон локализации препаратов на хроматограммах 2.2,3/,

Хроматографические пластинки с тонким слоем силикагеля о добавлением цинковой пыли /скрепляющий агент - гипс/: 14 г силикагеля в фарфоровой ступке тщательно растирают с I г цинковой пили и 1,5 г кальция сернокислого, смешивают о 40 мл дистиллированной воды; полученную сорбционную массу равномерно распределяют по поверхности 7-8 стеклянных пластинок размером 9 х 12 см /вариант проявления зон локализации препаратов на хроматограммах 2,2,2.А/,

2,4. Подготовка к определению.

2,4.1, Отбое и хранение проб¹

Отбор и хранение проб производят в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб...", утвержденными заместителем Главного Государственного Санитарного врача СССР А.И.8аиченко за $ 2051"79 от 2L августа 1979 г.

248.

2.4*2. Приготовление хроматографической колонки для очистки экстракта.

Стеклянную колонку длиной 200 мм и дпа стром IG мм промывают хромовой смесью, дистиллированной водой, затем диэтиловым эфиром, после чего высушивают досуха. В нижнюю часть колонки помещают подложку из обезжиренной ваты, затем слой натрия сернокислого безводного шестой 0,5 см (2 г) и слой окиси алюминия безводной для хроматографии высотой 0,5 см (1,5 г), после чего колонку заполняют 30 мл (15 г) силикагеля АСК, над которым помещают слой натрия сернокислого безводного высотой I см (4 г). Содержимое колонки непосредственно перед хроматографированием промывают 30 мл апетоиа и 25 мл н-гексана.

2.4.3. Очистка экстракта.

Перераспределение метазиона из гексана в ацетонитрил.

5 мл гексанового экстракта пробы переносят в делительную воронку, добавляют 1,5 мл ацетонитрила и встряхивают в течение 3 мин. После разделения фаз ацетонитрильный (нижний) слой вносят в хроматографическую колонку сразу же после промывки ее содержимого гексаном.

Хроматографирование- на колонке.

После впитывания экстракта в верхний слой натрия сернокислого безводного немедленно (!) начинают элюировать ЫФгамон. ... - гексаном (90 мл), а затем смесью гексана с ацетоном в объемном соотношении 9:1. Общий объем элгоата 360 мл (первые 20 мл отбрасывают).

2.5. Проведение определения.

2.5.1. Экстракция препарата из анализируемой пробы.

Почва.

50 г воз.г/шосухой пробы растирают в фарфоровой ступке и экстрагируют на аппарате для встряхивания смесью н-гексана с диэтиловым эфиром в объемном соотношении 7:3 (50 мд). Экстракт декантируют_гэкстракцию повторяют. Объединенный экстракт фильтруют через натрий сернокислый безводный, замеряют объем.

249.

Растительность»

Л) хвоя, лесная подстилка,

10 г тщательно измельченной пробы экстрагируют на аппарате доя встряхивания смео-.ю н-гексана с диэтиловнм эфиром в объемном соотношении 7:3 (40 мл). Экстракт декантируют, экстракцию повторяют. Обьсдпяешшй экстракт фильтруют чсрее слой натрия сернокислого безводного.

б) ягода, грибы.

10 г дроби растирают с натрием сернокислым безводным (20-25 г) в фарфоровой ступке. Экстрактно производят на аппарате для встряхивания смесью н-гсксзна с дизтиловтл эфиром в объемном соотношении 7:3 (30 мл). Экстракт декантируют, экстракцию повторяют. Объединенный экстракт дополнительно фильтруют через слой натрия сернокислого безводного.

2.5.2. Количественное определение и идентификация

мехатиона , п-нитрокрезола и фенитрооксона.

Энзимно-хроматографическое определение метатиона _ч и фенитрооксона._

Аликвотную часть объединенного экстракта пробы и стандартные раствори метилнптрофюса и фекитрооксопа (по 2 п 10 нг каждого препарата) наносят при помощи микрошприпа на хроматографические пластинки с силикагелем КСК или "Силуфол", которые для устранения краевого эффекта предварительно разделяют стеклянной палочкой на вертикальные полосы.

Развитие хроматограммы производят в смеси к-гексана с ацетоном в объемном соотношении 2:1. После поднятия фронта растворителя на 1C см пластинки проветривают на воздухе.

Для одновременного обнаружения не**»гиона ^п фенитрооксона, обладающих различной способностью к угнетению холинэстеразы, хроматографические пластинки подвергают активации в течение I мин. парами брома, доя чего помещают их в эксикатор, насыщенный парам;: брома ( за 30 мин до начала активашш на дне эксикатора размещают чашку Петри, содержащую 1-1,5 мл жидкого брома). Фенитро-оксон, как более сильный ингибитор холинэстеразы, может быть обнаружен на хроматографах и без активации.

После активаши хроматографические пластинки проветривают на воздухе в течение I часа, а затем опрыскивают свежепрпготовдсшшм

1

Приготовление хроматографических пластинок производят в соответствии с инструкцией, изложенной в кн. М.А.Клисенко, Т.А.Лебедева, З.Ф.Юркова, "Химический анализ микроколичеств ядохимикатов", М., изд,"Ме. .ицина", 197 2, с.293.