Изменение № 1 ГОСТ 25382-82 Крупный рогатый скот. Методы лабораторной диагностики лейкозов
Утверждено и введено в действие Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 23.06.89 № 1957
Дата введения 01.01.90
На обложке и первой странице стандарта после обозначения (СТ СЭВ 2702—80) дополнить обозначением: СТ СЭВ 6284—88.
Раздел 1 дополнить пунктом — 1.6: «1.6. Для иммуноферментного анализа используют свежие пробы крови, но не ранее, чем через сутки после взятия-Недостаточно просветленные сыворотки крови центрифугируют. При длительном хранении проб сыворотку крови отделяют от кровяного сгустка. При хранении проб при плюс 4 СС сыворотки годны к исследованию в течение 10 сут.
При хранении сыворотки при температуре минус 20 °С срок пригодности сыворотки для исследований — 1 год. Разложившиеся и сильно гемолизированные сыворотки для исследования не пригодны».
Раздел 2 дополнить пунктами — 2.5—2.5.3: «2.5. ИммуноФерментный метод
Сущность метода заключается в адсорбции антигеном противовирусных антител на поверхности пластины при инкубировании испытуемой сыворотки с антивидовымн антителами, меченными ферментом, с последующей модификацией субстрата.
2.5.1. Аппаратура, материалы, реактивы
Фотометр одно- или многоканальный с минимальным пределом показаний 1,5 экстинционных единиц и с автоматической регистрацией результатов.
Автоматическое или полуавтоматическое оборудование для промывания пластин.
Термостат, обеспечивающий температуру (ЗТ±0,5)СС.
Микропипетки одноканальные автоматические.
Микропипетки восьми- или двенадцатиканальные автоматические.
Микротитровальные пластмассовые пластины с 96 лунками.
Стаканы химические вместимостью 500 см3 по ГОСТ 1770-74.
Колбы мерные вместимостью 100 см3 по ГОСТ 1770-74.
К#лбы Эрленмейера вместимостью 100 см3 по ГОСТ 25336—S2.
Пробирки по ГОСТ 25336-82.
(Продолжение см. с. 224>
22S
(Продолжение изменения к ГОСТ 25382-82)
Пипетки градуированные вместимостью 1 и 10 см3 по ГОСТ 20292-71.
Буферный раствор карбонатный с pH 8.8—9.6.
Буферный раствор физиологический фосфатный с pH 7,2—7.4. содержащий твин 20 или 80 (промывающий раствор).
Растворитель — промывающий раствор, содержащий инертный белок.
Антиген ВЛКРС для иммуноферментного анализа (ИФА), изготовленный из культуральной жидкости инфицированной ВЛКРС культуры клеток селезенки ягнят-эмбрионов (FLS) или почки ягнят-эмбрионов (FLK), содержащий компоненты вируса GP 51 и р 24, разведенный в карбонатном буферном растворе.
Сыворотка контрольная положительная, разведенная в растворителе.
Сыворотка контрольная отрицательная, представляющая собой смесь не менее чем из 10 отрицательных сывороток крупного рогатого скота, разведенная в растворителе.
Конъюгат — антитела против иммуноглобулинов крупного рогатого скота, меченные пероксндазой или другим ферментом, разведенные в растворителе.
Испытуемая сыворотка из крови крупного рогатого скота.
Субстрат ферментативной реакции.
2.5.2. Проведение исследования
В лунки микротитровальной пластины (панели) вносят по 0.05 или 0.1 или 0,2 см3 раствора антигена. Пластину закрывают и инкубируют в течение 18 ч во влажной камере при температуре плюс 4 °С.
После этого пластину четыре раза промывают физиологическим фосфатным буферным раствором так, чтобы лунки заполнялись полностью, выдерживают в течение 3 мин и затем раствор из лунок тщательно удаляют.
Готовят исходные разведения испытуемых сывороток.
Испытуемые сыворотки в исходном разведении вносят параллельно в две соседние лунки микротитровальной пластины в количестве 0,05 или 0,1 или 0.2 см3. Таким же способом в каждую пластину вносят разведенные контрольные положительную и отрицательную сыворотки. На каждой пластине оставляют несколько лунок заполненных только растворителем (без сыворотки). Количество лунок с растворителем на пластине определяется конструкцией фотометра и используется для установки нулевого положения шкалы прибора.
Пластину закрывают и инкубируют при температуре от 20 до 37 °С во влажной камере в течение 60— 120 мин.
(Продолжение см. с. 225)
224
(Продолжение изменения к ГОСТ 25382-82)
Промывают пластику четыре раза промывающим раствором.
В лунки вносят по 0,05 или 0,1 или 0,2 см3 раствора конъюгата, пластины закрывают и инкубируют при температуре от 20 до 37 °С во влажной камере в течение 60—120 мин.
Промывают пластину четыре раза промывающим раствором.
В каждую лунку вносят по 0,05 или 0.1, или 0,2 см3 раствора субстрата и инкубируют при "температуре от 20 до 37 °С в течение 50—60 мин. При необходимости в лунки добавляют карбонатный буферный раствор, останавливающий
(Продолжение см. с. 226)
€ Зак. 1667
(Продолжение изменения к ГОСТ 25382-92$
реакцию, и измеряют оптическую плотность в каждой лунке на фотометре прв> длине волны, характерной для выбранного субстрата.
2.5.3. Обработка результатов
Результат считают положительным, если оптичесхая плотность исследуемой пробы в обеих лунках в два или более раза превышает среднюю арифметическую величину оптической плотности для отрицательной пробы в соответ~ ствующем разведении».
(ИУС Л? 10 1989 г.)
226
