Группа Н09

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Метол выявления и inIреле.Iсиня количества энтерококков

Food products. Method for detection and determination of count Enterococci

МКС 07.100.30 ОКСТУ 9109

Дата введения Q 1.07.91

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления и количественного определения энтерококков (Streptococcus faccalis. Streptococcus faecium. Streptococcus avium. Streptococcus gallinarum).

Метол основан на высеве определенного количества продукта или его разведении в жидкую селективную среду или на поверхность плотной селективной среды, аэробном культивировании посевов при (37 ± I) *С в течение 24—48 ч, подтверждении принадлежности выросших микроорганизмов к энтерококкам, пересчете их количества на 1,0 г (см³) продукта.

1. ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ

Огбор проб — по ГОСТ 26668, подготовка к испытанию — по ГОСТ 26669.

2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ

Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:

весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104*, с наибольшим пределом взвешивания до 200 г и пределом допускаемой погрешности ± 2 мг (для взвешивания реактивов);

весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104, с наибольшим пределом взвешивания до I кг и пределом допускаемой погрешности ± 10 мг (для взвешивания продукта);

микроскоп световой биологический с увеличением в 900—1000 раз; стерилизатор горячим воздухом;

термостат с диапазоном рабочих температур от 28 *С до 55 *С, позволяющий поддерживать заданную температуру с погрешностью ± 1 *С; холодильник бытовой; водорода пероксид по ГОСТ 10929; желчь крупного рогатого скота или сухая желчь; железо (III) — аммония гидроцитрат; ферментативный гидролизат казеина;

• С I июля 2002 г. в нелеп в действие ГОСТ 24104 2001 (здесь и далее).

Издание официальное

★

канамицин сульфат во флаконах по 0,5 г — 500 ООО ЕД и I г — I ООО ООО ЕД, в ампулах по 5 и 10 см³ 5 % раствора, содержащих 0,25 и 0,5 г препарата;

полимиксин М сульфат во флаконах по 500 000 ЕД;

эскулин;

натрии г идрокарбонат (NaHCOj) по ГОСТ 4201.

3. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ

3.1.    Приготовление растворов

3.1.1.    Раствор с объемной долей пероксида водорода 10 %:

33,3 см³ пероксида водорода с содержанием основного вещества 30 % (в случае если пероксид водорода имеет другое содержание основною вещества, то делается пересчет) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят обьем дистиллированной водой до метки.

3.1.2.    Раствор с массовой долей HCI 5 %:11,5 см концентрированной соляной кислоты переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят объем дистиллированной водой до метки.

3.1.3.    Раствор массовой концентрацией натрия гидроксида 50 г/дм³: 5 г натрия гидроксида переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доливают до метки.

3.1.4.    Раствор 2-, 3-, 5-грифе н ил тетразол и й хлорида (ТТХ) массовой концентрацией 10 г/дм³;1 г ТТХ переносят, смывая дистиллированной водой в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят объем дистиллированной водой до метки. Раствор стерилизуют методом мембранной фильтрации по ГОСТ 26670. В темной плотно закрытой посуде раствор хранят при (4 ± 2) *С не более 3 мес.

3.1.5.    Раствор массовой концентрацией теллурита калия 20 г/дм³: 2 г теллурита калия переносят, смывая дистиллированной водой в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят объем дистиллированной водой до метки. Раствор стерилизуют методом мембранной фильтрации по ГОСТ 26670.

3.1.6.    Спиртовой раствор массовой концентрацией бромтимолового синего 16 г/дм³:

1.6    г бромтимолового синего переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и растворяют в этиловом спирте с массовой долей 96 %. Раствор доливают этиловым спиртом до метки.

3.1.7.    Раствор массовой концентрацией кристаллического фиолетового 0,1 г/дм³: 0,01 г кристаллического фиолетового переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и растворяют в дистиллированной воде. Раствор доливают до метки.

3.1.8.    Спиртовой раствор массовой концентрацией бромкрезолового пурпурного 16 г/дм³:

1.6    г бромкрезолового пурпурного переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и растворяют в этиловом спирте с массовой долей 96 %. Раствор доливают этиловым спиртом до метки.

3.1.9.    Раствор массовой концентрацией натрия азида 100 г/дм³: 10 г натрия азида переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют при легком подогревании в дистиллированной воде и раствор доливают до метки. Раствор готовят под вытяжкой, так как пары натрия азида ядовиты.

3.1.10.    Раствор массовой концентрацией канамицина сульфата 50 г/дм³ (50 000 000 ЕД) и 100 г/дм³ (100 000 000 ЕД): во флаконы с 0,5 г или I г препарата вносят 10 см³ стерильной дистиллированной воды, содержимое флаконов растворяют.

3.1.11.    Молоко обезжиренное готовят по ГОСТ 10444.1.

3.1.12.    Растворы для окраски по Граму готовят по ГОСТ 10444.1.

3.2. Приготовление питательных сред

3.2.1.    Азидно-глкжоэный бульон

Основа среды: к 1 дм³ мясопсптонного бульона, приготовленного по ГОСТ 10444.1, доба&л я ют 5,0 г пептона, 7,5 г глюкозы, 2,5 г натрия хлорида, составные части растворяют нагреванием. После этого охлаждают и устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации при 25 *С он составлял 7,2 ±0,1. Затем основу среды стерилизуют текучим паром (при 100 *С) в течение 30 мин. К основе среды, охлажденной до 50 "С, добавляют 2,0 см³ натрия азида, приготовленного по п. 3.1.9, и 2,0 см³ раствора бромкрезолового пурпурного, приготовленного но и. 3.1.8. Готовую среду нс стерилизуют. Среду хранят в защищенном от света и высыхания виде при (4 ± 2) *С не более 3 мес. Непосредственно перед использованием се разливают по 5 см³ в стерильные пробирки.

3.2.2.    Глюкозо-триптонный бульон с дрожжевым экстрактом с pH 7,2 и 9,6:5,0 г триптона или ферментативного казеинового гидролизата, 12,5 см³ дрожжевого экстракта, 1,0 г глюкозы добавляют

50

ГОСТ 28566-90 С. 3

дистиллированной водой до метки, нагревают до растворения компонентов. Охлаждают, устанавливают pH таким образом, чтобы посте стерилизации он составлял при 25 *С 7,2 ±0,1. Стерилизуют текучим паром (при 100 *С) в течение 30 мин, охлаждают до 50 *С. Добавляют 4,0 см³ раствора азида натрия, приготоатенного по п. 3.1.9, и 10,0 см³ раствора 2-, 3-, 5-трифснилтстразолий хлорида, приготоатенного по п. 3.1.4, хорошо перемешивают и разливают по чашкам Петри. Среду хранят при (4 ± 2) *С нс более 7 сут.

3.2.6.    Канамицин азидно-эскулиновый агар (КАЭ-агар):

20,0 г пептона из казеина, 25,0 см³ дрожжевого экстракта, 5,0 г натрия хлорида, 1,0 г натрия лимоннокислого, 0,5 г железа (III) —аммония гидрощгтрата, 1,0 г эскулина, (15,0 ± 3,0) гагара помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см³, доливают дистиллированной водой до метки. Растворяют составные части при на1рсвании, охлаждают, устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации при 25 *Сон составлял 7,1 ± 0,1. Стерилизуют при (121 ± 1) *С в течение 15 мин, охлаждают до 50 *С, добавляют 1,5 см³ раствора азида натрия, приготовленного по п. 3.1.9, и 0,4 см³ раствора канамицина сульфата массовой концентрацией 50 г/дм³ или 0,2 см³ раствора канамицин сульфата массовой концентрацией 100 г/дм³ и разливают по чашкам Петри. Среду хранят при (4 ± 2) *С нс более 7 сут.

3.2.7.    Глюкозо-гриптонный агар с дрожжевым экстрактом с pH 7,2 ± 0,1 готовят по п. 3.2.2, но при приготовлении добавляют на 1 дм³ среды (15,0 ± 3,0) г агара.

3.2.8.    Щелочная полимиксиновая среда:

Основа среды — к 400 см³ мясо-пеггтонного бульона по ГОСТ 10444.1 добавляют 5 г натрия хлорида, 10 г глюкозы, 10 см³ дрожжевого экстракта. Основу среды стерилизуют при (110 ± 1)'С в

более 7 сут. Непосредственно перед использованием среду разливают по 5 см³ в стерильные пробирки.

3.2.9. Молочно-ингибиторная среда (МИС):

К 850 см³ расплавленного и охлажденного до 50 *С мясо-псптонного агара, приготовленного по ГОСТ 10444.1, добавляют 150 см³ обезжиренного молока, приготовленного по ГОСТ 10444.1, 12,5 см³ раствора кристаллического фиолетового, приготовленного по п. 3.1.7, 10,0 см³ раствора калия теллурита, массовой концентрацией 20 г/дм³, 200 000 ЕД полимиксина М сульфата. Среду не

51

стерилизуют, разливают в стерильные чашки Петри и хранит при (4 ± 2) *С нс более 10 сут. Допускается взамен раствора калия теллур ига добавлять в среду 5,0 см³ раствора 2-, 3-, 5-трифснилтстра-золий хлорида, приготовленного по п. 3.1.4.

4. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ

4.1.    Из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений по ГОСТ 26669 так, чтобы можно было определить ожидаемое количество энтерококков в 1,0 г (см³) продукта или определить допустимое количество энтерококков, указанное в нормативно-технической документации на конкретный вид пищевою продукта.

При выявлении энтерококков из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений так, чтобы можно было опрсдслкть минимальное количество продукта, содержащее энтерококки, или высевают навеску продукта, которая указана в нормативно-технической документации на этот продукт.

4.2.    Для определения количества энтерококков 0,1 или 0,2 см³ продукта или сю разведения высевают по ГОСТ 26670 на поверхность предварительно подсушенной атаризованной питательной среды, приготовленной по и. 3.2.5 или 3.2.6, или 3.2.9.

4.3.    Если необходимо выявить энтерококки в навеске продукта определенной массы или объема, то навеску продукта или ею разведение высевают непосредственно в жидкую питательную среду по п. 3.2.1 или 3.2.8.

4.4.    Посевы инкубируют при (37 ± 1) *С в течение 24—48 ч, через 24 ч проводят предварительный учет результатов, через 48 ч — окончательный.

4.5.    После инкубирования посевов, проведенных по п. 4.3, учитывают пробирки с признаками роста микроорганизмов: помутнением среды и изменением се окраски в желтый цвет. Из пробирок с признаками роста, предположительно энтерококков, делают пересевы на поверхность агаризован-ной среды п. 3.2.5 или 3.2.6, или 3.2.9 таким образом, чтобы получить рост изолированных колоний, посевы на этих средах инкубируют при (37 ± 1) 'С в течение 24—48 ч.

4.6.    После инкубирования посевов, проведенных по п. 4.2, учитывают чашки Петри, на которых выросло от 15 до 150 характерных для энтерококков колоний:

на питательной среде по п. 3.2.5 колонии энтерококков красно-розовые или карминовые с коричневым оттенком диаметром до 2 мм;

на питательной среде по п. 3.2.6 колонии энтерококков оливково-зеленые до темно-коричнево-черных с равномерной окраской поля;

на питательной среде по п. 3.2.9:

1)    с 2-, 3-, 5-ТТХ—колонии вишнево-красные с зоной протеолиза или бесцветные с розовым центром;

2)    с теллур иг ом калия — колонии окрашены в черный цвет.

4.7.    Посевы по п. 4.5 через 24—48 ч инкубирования просматривают и отмечают рост колоний, характерных для энтерококков по п. 4.6.

4.8.    Для дальнейшего подтверждения принадлежности характерных колоний к эшерококкам отбирают нс менее пяти колоний из посевов по пп. 4.6 и 4.7 и пересевают их на чашки Петри с агаризованной средой по п. 3.2.7 таким образом, чтобы получить рост изолированных колоний. Посевы инкубируют при (37 ± 1)*С в течение 24—48 ч.

4.9.    Подтверждение принадлежности характерных колоний к энтерококкам

4.9.1.    Из колоний, выросших по п. 4.8, готовят препараты, окрашивают по Граму по ГОСТ 30425.

Энтерококки — 1рамположнгсльныс кокки, расположенные парами, короткими или длинными цепочками.

4.9.2.    У колоний определяют наличие каталазы по ГОСТ 30425. Энтерококки каталазу не образуют.

4.10.    При более углубленном анализе и в целях эпидемиологического обследования проводят дальнейшее подтверждение характерных колоний.

4.10.1. Для определения возможности роста при температуре (45 ± 1)*С культуры высеивают в глюкозо-триптонный бульон с дрожжевым экстрактом с pH 7,2 ±0,1 по п. 3.2.2. Посевы инкубируют при (45 ± 1) *С 48—72 ч. Энтерококки вызывают помутнение среды.

52

ГОСТ 28566-90 С. 5

4.10.2.    Для определения возможности роста в среде с массовой концентрацией NaCl 65 г/дм³ культуры высевают в солевой бульон по п. 3.2.3 и инкубируют при (37 ± 1) *С в течение 24—48 ч. Энтерококки вызывают помутнение среды и выпадение осадка. S. avium в среде с массовой концентрацией NaCl 65 г/дм³ не растет или растет очень медленно.

4.10.3.    Для определения возможности роста в питательной среде с pH 9,6 культуры высевают в глюкозо-триптонный бульон с дрожжевым экстрактом и pH 9,6 по п. 3.2.2 и инкубируют в течение 24—48 ч при (37 ± 1) *С. Энтерококки вызывают помутнение среды.

4.10.4.    Для постановки теста на терморезистентность культуры высевают в глюкозо-триитон-ный бульон с дрожжевым экстрактом с pH 7,2 ±0,1. пробирки выдерживают при (60 ±1) *С в течение 30 мин и инкубируют в течение 24—48 ч при (37 ± 1) *С. Энтерококки вызывают помутнение среды.

4.10.5.    Для определения возможности роста в среде с 40 % желчи культуры высевают в 40 %-ный желчный бульон но и. 3.2.4 и инкубируют в течение 24—48 ч при (37 ± 1) *С. Энтерококки вызывают помутнение среды.

5. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1.    Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

5.2.    Если при изучении культуральных и морфологических свойств микроорганизмов обнаружены грамположитсльныс, нс образующие каталазу кокки, то дают заключение о том, что обнаруженные микроорганизмы относят к энтерококкам.

5.3.    Если при подтверждении характерных колоний в 80 % случаев, т. е. не менее чем в 4 из 5 колоний, подтвержден рост энтерококков, то считают, что все колонии, выросшие на чашке по п. 4.6, принадлежат к энтерококкам.

В остальных случаях количество энтерококков определяют исходя из процентного отношения подтвержденных колоний, к общему количеству колоний, взятых для подтверждения.

При посеве навески продукта или разведения продукта на жидкие среды, пробирки считают положительными, если при последующем пересеве на агаризованные среды и подтверждении характерных колоний хоты бы в одной характерной колонии обнаружены э>ггсрококки.

5.4.    Результаты записывают следующим образом

5.4.1.    Результаты определения количества энтерококков пересчитывают на 1 г/см³ продукта и записывают в соответствии с требованиями ГОСТ 26670.

5.4.2.    Результаты выяаления энтерококков в определенной навеске записывают: энтерококки обнаружены или не обнаружены (при этом указывается навеска продукта).

53

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

1.    РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Всесоюзным научно-исследовательским институтом консервной и

овощесушильней промышленности

2.    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по управлению качеством продукции и стандартам от 29.05.90 № 1332

3.    Стандарт соответствует стандарту СЭВ 6646—89

4.    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5.    ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

Обозначение М ГД. на который дана ссылка	Номер раздела, пункта, подпункта
ГОСТ 4201-79	2
ГОСТ 10444.1 84	2; 3.1.11; 3.1.12; 3.2.1; 3.2.8; 3.2.9
ГОСТ 10929-76	2
ГОСТ 24104 88	2
ГОСТ 26668 85	1
ГОСТ 26669 85	1; 4.1
ГОСТ 26670-91	3.1.4; 3.1.5; 4.2; 5.4
ГОСТ 30425-97	4.9.1; 4.9.2

6.    Ограничение срока действия снято по протоколу № 5—94 Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 11-12—94)

7.    ПЕРЕИЗДАНИЕ

54