ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РОССИЙСКИЙ РЕСПУБЛИКАНСКИЙ ИНФОРМАЦИОННО-АНАЛИТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР

МЕТОДЫ АНАЛИЗА ЧУЖЕРОДНЫХ ВЕЩЕСТВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

(Сборник нормативных материалов)

Москва, 1994 г.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РОССИЙСКИЙ РЕСПУБЛИКАНСКИЙ ИНФОРМАЦИОННО-АНАЛИТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР

МЕТОДЫ АНАЛИЗА ЧУЖЕРОДНЫХ ВЕЩЕСТВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

(Сборник нормативных материалов)

Москва, 1994 г.

Брагина И. В., Орехова II. Л- — специалисты лаборатории физико-химических методов исследований Российского Республиканского информационно-аналитического центра.

Под редакцией: Подуповой JI. Г. — заместители Главного государственного санитарного врача РФ, заслуженного врача РФ.

Подписано к печати. 21.11.94.

Формат 60 х 88/16. Бумага офсетная. Уел. псч. л. 9,8. Уел. кр.-огг. 9,8. Тираж 1000 экз. Зак. 220.

Изготовлено в Московской типографии № 11 Комитета по печати РФ. 113105, Москва, ул. Нагатинская, 1,

ВВЕДЕНИЕ

Загрязнение пищевых продуктов токсичными чужеродными веществами является частью глобальной проблемы загрязнения окружающей среды, поэтому в настоящее время очень важным аспектом является определение микропримесей загрязняющих веществ в продуктах питания и снижение их содержания. В последние годы все больший приоритет приобретают исследования по определению таких токсикантов как различные микотоксины (афла-токсины, патулин, зеараленон, вомитоксин, трихотецены и др.), соли тяжелых металлов, нитриты, нитраты, N-нитрозамины и др.

Настоящий сборник включает в себя ранее изданные Методические указания по определению наиболее приоритетных загрязнителей пищевых продуктов, разработанные научно-исследовательскими институтами медицинского профиля и утвержденные Главным санитарно-эпидемиологическим управлением Минздрава СССР и ГКСЭН РФ.

В соответствии с Постановлением Госкомсанэп ид надзора Российской Федерации от 06.02.92 г. № 1 *0 порядке действия на территории Российской Федерации нормативных актов бывшего Союза ССР в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения» на всей территории Российской Федерации действуют общесоюзные санитарные правила и нормативные акты впредь до принятия соответствующих нормативных актов Российской Федерации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения.

Сборник предназначен для санитарно-гигиенических лабораторий центров Госсанэпиднадзора, НИИ и учреждений гигиенического профиля, кафедр гигиены питания медицинских институтов и институтов усовершенствования врачей, а также может быть использован лабораториями других организаций, занимающихся исследованиями пищевых продуктов.

Будем признательны за все критические замечания и пожелания, направленные на улучшение данного Сборника или составление аналогичных Сборников по другим разделам исследований пищевых продуктов.

Л. Г. Подунова

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНА ПАТУЛИИА¹

1. Аппаратура, материалы, реактивы

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания до 20 г и пределами допускаемой погрешности 0,1 мг.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределами допускаемой погрешности 38 мг.

Спектрофотометр с диапазоном измерения, позволяющим проводить исследования при длине волны 275 нм, с допустимой абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1%; кюветы кварцевые с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм.

Испаритель ротационный (ИР-1М2 или др.).

Насос водоструйный лабораторный по ГОСТ 25336.

Микрошприц МШ-10 вместимостью 10 мм.

Камера для тонкослойной хроматографии с притертой крышкой.

Облучатель ультрафиолетовый для обнаружения витаминов в растворе (модель 833) или люминоскоп ЛПК-1.

Термометр жидкостный стеклянный по ГОСТ 28498-90 с пределами измерения 0—100° С и ценой деления шкалы не более 1°С.

Стаканы по ГОСТ 25336 вместимостью 50 и 150 см³.

Колбы мерные по ГОСТ 1770 с взаимозаменяемым конусом вместимостью 100 и 250 см³.

Цилиндры по ГОСТ 1770 с пришлифованной пробкой вместимостью 50 и 100 см³.

Воронка делительная по ГОСТ 25336 с пришлифованной пробкой вместимостью 250 см³.

Колба плоскодонная по ГОСТ 25336 вместимостью 250 см³.

Воронка лабораторная по ГОСТ 25336 диаметром 56 мм высотой 80 мм.

Колба грушевидная по ГОСТ 25366 с взаимозаменяемым конусом 14/23 вместимостью 100 см³.

Колба остродонная по ГОСТ 25336 с взаимозаменяемым конусом 14/23 вместимостью 25 см³.

Пипетка с делениями по ГОСТ 20292 исполнения 6 или 7 вместимостью 10 см³.

Пипетка с делениями по ГОСТ 20292 исполнения 4 или 5 1-го класса точности вместимостью 1 см³.

Эксикатор по ГОСТ 25336 с краном, с диаметром корпуса 250 мм.

Вставка для эксикатора по ГОСТ 9147 диаметром 230 мм исполнения 2.

Воронка капельная по ГОСТ 25336 вместимостью 50 см³.

Распылитель стеклянный с грушей.

Бумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ.

Вата по ГОСТ 5556.

Силикагель Л, 100—160 или 100—250 мкм, фирма Лахема, ЧССР.

Пластинки для тонкослойной хроматографии «Силуфол* 15 х 15 см, фирма Кавалиер, ЧССР.

Патулин кристаллический.

Хлороформ технический по ГОСТ 20015 высшего сорта свеже-перегнанный.

Спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч.

Калий железистосинеродистый 3-водный по ГОСТ 4207, х.ч., раствор концентрацией 150 г/дм³ (раствор Карреза 1).

Цинк уксуснокислый 2-водный по ГОСТ 5823, ч.д.а., раствор концентрацией 300 г/дм³ (раствор Карреза П).

Эфир этиловый уксусной кислоты по ГОСТ 22300, ч. д. а. (этила-цетат).

Ацетон по ГОСТ 2603, х. ч.

Толуол по ГОСТ 5789, ч.д.а.

Кислота муравьиная по ГОСТ 5848, ч.д.а.

Бензидин, ч.д.а., раствор в муравьиной кислоте концентрацией 5 г/дм³.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233, х.ч.

Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166 прокаленный, х.ч.

Калий марганцовокислый по ГОСТ 20490, х.ч., раствор концентрацией 15 г/дм³.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

2. Подготовка к испытанию

2.1. Требования безопасности при проведении испытания

Помещение, в котором проводится определение патулина, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.

Работу с хлором следует проводить в вытяжном шкафу лаборатории с использованием индивидуальных средств защиты (резиновые перчатки, защитные очки, фильтрующие респираторы РПГ-67-В или РУ-60 МВ), а также с соблюдением правил личной гигиены.

2.2. Приготовление первого стандартного раствора

1 мг кристаллического патулина количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят до метки хлороформом. Содержимое колбы тщательно перемешивают. Полученный первый стандартный раствор хранят в закрытой мерной колбе, плотно завернутой в алюминиевую фольгу, в холодильнике при температуре не выше 5° С. Срок годности стандартного раствора патулина — 6 месяцев.

Концентрацию патулина в стандартном растворе определяют спектрофотометрическим методом. Для этого пипеткой берут 6,0 см³ стандартного раствора и количественно переносят в отгонную колбу. Раствор упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 35—40° С. Сухой остаток растворяют в 9,0 см³ этилового спирта и определяют оптическую плотность слоя раствора толщиной 1 см по отношению к контрольному раствору на спектрофотометре при длине волны 275 нм. В качестве контрольного раствора используют этиловый спирт.

Массовую концентрацию в стандартном растворе (С), мкг/см³, вычисляют по формуле:

где:

М — молярная масса патулина, М = 154 г/моль;

D — оптическая плотность раствора;

К — коэффициент разведения, К = 1,5;

е — молярный показатель поглощения раствора патулина в этиловом спирте при длине волны 275 нм, е = 1,46 х 10⁴ дм³ моль"^,см“¹;

1    —    толщина слоя раствора, см.

3-220

2.3. Ilpiironmiciiiie второй» стандартного раствора

Второй стандартный раствор патулина готовят разведением первого стандартного раствора хлороформом точно в 2 раза.

3. Проведение испытания

3.1. Приготовление водной вытяжки из образца

Навеску соков, пюре, напитков массой 50,0 г или повидла, джема, варенья, фруктового порошка массой 25,0 г помещают в стеклянный стакан, смешивают с небольшим количеством дистиллированной воды и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 см³. В мерную колбу вносят 15 см³ раствора Карреза 1 и 15 см³ раствора Карреза II. Содержимое колбы доводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают и фильтруют в мерный цилиндр через бумажный складчатый фильтр. Собирают 50 см³ фильтрата.

3.2. Экстракция

Фильтрат из цилиндра переносят в делительную воронку. Этим же цилиндром отмеряют 50 см³ этилацетата, переносят его в делительную воронку и в течение 1 мин. интенсивно перемешивают содержимое. Смеси дают отстояться, и после полного разделения водный нижний слой сливают обратно в цилиндр, а этилацетатный экстракт переносят в сухую плоскодонную колбу. Экстрагирование остатков патулина из водной фазы проводят еще раз в аналогичных условиях свежей порцией этилацетата. При этом после одноминутного перемешивания в делительную воронку вносят 10 г хлористого натрия и продолжают перемешивать еще в течение 0,5 мин. После разделения слоев водную фазу отбрасывают, а объединенные этила-цетатные экстракты высушивают в плоскодонной колбе при добавлении 15—20 г сернокислого натрия. После высушивания экстракт фильтруют через ватный тампон в отгонную грушевидную колбу. Оставшийся сернокислый натрий ополаскивают 10 см³ этилацетата, которые затем также фильтруют в отгонную колбу. Экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре 35—40° С досуха.

3.3. Очистка экстракта

Остаток в отгонной колбе растворяют в 2 см³ хлороформа. Для очистки полученного экстракта готовят слой силикагеля и сернокислого натрия. Для этого в горло стеклянной воронки вставляют

— очистку экстракта допускается не поводить при анализе напитков и |1еконце1ггрироваш1ых соков из яблок

34

ватный тампон, на который помещают суспензию, состоящую из 3 см³ (1,8 г) силикагеля в 15 см³ хлороформа. Хлороформу дают стечь и, не позволяя просохнуть слою силикагеля, сверху ровным слоем насыпают 3—4 г сернокислого натрия. Экстракт переносят на слой силикагеля и сернокислого натрия сразу после того, как хлороформ перестанет вытекать из воронки. С этого момента отбирают выходящий элюат в мерный цилиндр вместимостью 50 см³. Экстракту дают полностью впитаться в фильтрующий слой. Отгонную колбу ополаскивают еще двумя порциями по 2 см³ хлороформа, каждый раз давая жидкости полностью впитаться в фильтрующий слой. (Наливать экстракт следует аккуратно, так, чтобы слой сернокислого натрия не взмучивался). Элюирование продолжают, наливая на слой сернокислого натрия небольшие порции хлороформа. Первые 15 см³ элюата отбрасывают, следующие 45 см³ элюата собирают в другой цилиндр такой же вместимости, затем элюат количественно переносят в остродонную отгонную колбу и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 35—40° С.

3.4. Хроматографическое разделение

Остаток в отгонной колбе растворяют в 0,2 см³ хлороформа. Пластину «Силуфол» на расстоянии 2 см от краев размечают тонкими карандашными линиями. В точку пересечения линий в правом нижнем углу наносят с помощью микрошприца 0,02 см³ исследуемого раствора. В правом верхнем и левом нижнем углах на стартовых линиях отмечают по три точки, в которые микрошприцем наносят различные объемы первого стандартного раствора патул ина. Количество патул и на в пятнах должно быть от 10 до 80 нг. Пластинку одной их стартовых линий вниз помещают в камеру для тонкослойной хроматографии, предварительно заполненную смесью хлороформ — ацетон (4:1) на высоту около 1 см. Развитие хроматограммы проводят в первом направлении до достижении фронтом растворителя карандашной линии. Пластинку извлекают из камеры и сушат до исчезновения запаха растворителя. Высушенную пластинку помещают второй стартовой линией вниз в камеру для тонкослойной хроматографии, предварительно за- полненную смесью толуол — этилацетат— муравьиная кислота (5:4:1) на высоту около 1 см. Проводят развитие хроматограммы во втором направлении до достижения фронтом растворителя карандашной линии. Пластинку извлекают из камеры и сушат до исчезновения запаха растворителя.

3.5. Обнаружение патулина

На вставку эксикатора ставят стеклянный стакан вместимостью 150 см³ с 25 см³ раствора марганцовокислого калия, рядом поме-

35

щают хроматографическую пластинку. Эксикатор плотно закрывают крышкой и к раствору марганцовокислого калия по каплям приливают 25 см³ соляной кислоты из капельной воронки, вставленной в отверстие крышки эксикатора. По истечении 15 мин пластинку извлекают из эксикатора, оставляют еще на 10 мин в вытяжном шкафу, а затем опрыскивают из распылителя раствором бензидина. Хроматографическую пластинку сушат в токе холодного воздуха под тягой в течение 15—20 мин. Хроматограмму рассматривают в ультрафиолетовом свете. Патулин обнаруживается в виде желтых флуоресцирующих пятен. Обнаружение на пластинке пятна, соответствующего по цвету флуоресценции и хроматографической подвижности пятнам стандартного раствора патулина, свидетельствует о его наличии в анализируемом продукте. Количество патулина в пятне анализируемой пробы определяют, сравнивая размер и интенсивность флуоресценции пятен стандартного патулина и пятен патулина в анализируемой пробе.

4. Обработка результатов

Массовую долю патулина (X) в процентах вычисляют по формуле:

X *

mi — количество патулина, обнаруженное в пятне, нг;

Vi — общий объем, до которого доведена навеска при прибавлении к ней воды, см³;

V3 — общий объем хлороформного экстракта, см³; m — масса навески продукта, г;

V2 — объем фильтрата, отобранный на анализ, см³;

V4 — объем хлороформного экстракта, наносимый на пластинку, см³.

За результат анализа принимают среднее арифметическое значение двух параллельных определений, расхождение между которыми не должно превышать 20*10"⁷%.

Если найденное значение массовой доли патулина в анализируемой пробе отличается от установленной нормы более, чем на 10 х 10~⁷%, его принимают за окончательный результат. Если равно или менее 10 х 10“⁷%, то следует провести повторное хроматографическое разделение на пластинке. При этом в точки на стартовых линиях необходимо наносить такие объемы второго стандартного раствора патулина, чтобы количество в них патулина максимально приближалось к количеству патулина в пятне анализируемой пробы при ее нанесении в том же количестве, что и в предыдущем случае.

СОДЕРЖАНИЕ

I    МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ    *

1.    Методика определения афлатоксинов в пищевых продуктах методом тех.................................... 3

2.    Методика определения афлатоксинов в пищевых продуктах с

помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии    ...    11

3.    Методика определения афлатоксинов в продуктах животного

происхождения ................................. 19

4.    Методика определения содержания патулииа в фруктовых и

овощных соках и пюре............................ 26

5.    Методика определения мпкотоксина патулииа в продуктах

переработки плодов и овощей ....................... 31

6.    Методика определения зсарпленопл в пищевых продуктах    ....    37

7.    Методика определения дсзоксинивалспола (вомитокспна) в    зерне

и зернопродуктах................................ 41

8.    Методика определения дсзоксинниллснола и зсараленона в зерне

и зернопродуктах ............................... 45

9.    Методика определения Т-2 токсина в пищевых продуктах и

продовольственном сырье.......................... 53

10.    Методика определения охратоксина А в пищевых продуктах ...    57

11.    Методики определения мпкотокеппои: Т-2 токсина, зсараленона

(Ф-2) и охратоксина А............................ 63

II. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУЖЕРОДНЫХ ВЕЩЕСТВ 77

12.    Атомно-абсорбционные методы определения токсинных элементов в пищевых продуктах и пищевом сырье.............. 77

13.    Методика определения мстил-этилмсркурхлорида в пищевых

продуктах, кулннарно обработанных ................... 93

14.    Методика определения содержания общей ртути в пищевых

продуктах методом беспламенной атомной абсорбции....... 97

15.    Методика по определению хрома в овощных консервах...... 103

16.    Методика определения содержания гистамина в рыбопродуктах

(флуоромстричсский метод)......................... 105

17.    Метод выделения, идентификации и количественного определения

гистамина в рыбопродуктах (колориметрический метод)...... ПО

18.    Методика определения нитратов и нитритов в молоке и молочных

продуктах..................................... 114

19.    Методика определения жиратов и нитритов в плодовоощной

консервированной продукции........................ 124

биологических жидкостях .......................... 133

21.    Методика определения остаточных количеств

Эстрадиола-17/? в продуктах животноводства ............. 138

22.    Методика определения антибиотиков тстрациклинового ряда методом тонкослойной хромато<рафии (качественный анализ) ...    142

23.    Методика определения антибиотиков тетрацикл и нового ряда

<]»луоримстричсским методом (количественный анализ) ...... 143

24.    Определение летучих N-нитрозаминов в продовольственном сырье

и пищевых продуктах........................ .    .    .    ]4<з

1

   —    из ГОСТ 28038-89 «Продукты переработки плодов и овощей. Метод

определения микотокенна патулииа»

31