Методические рекомендации
Клеточные культуры в диагностике вирусных инфекций, вызываемых вирусами группы герпеса

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНШРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

"УТВЕРЖДАЮ"

Заместитель Председателя Госкомсаиэпидиадзора РФ

Г.Г.Онищенко

" 28 " ноября 1994- г.

ШТОЧЕШЕ' КУЛЬТУРУ В ДИАГНОСТИКЕ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ, ШЗЫВАЕШК ВИРУСАМИ ГРУППЫ ГЕРПЕСА

Методические рекомендации

Екатеринбург, 1995 г,

Методические рекомендации разработаны в Екатеринбургском НИИ вирусных инфекций, рассмотрены и одобрены Ученым Советом института.

Авторы-составители: Г.Г.Колесникова, В.К.Саяуинсина, В.П.Устьянцев, А.А.Бахарев, Н.А.Шмелвиа, АЛЬПориваева,

11. П. Глинских

Настоящие методические рекомендации предназначены для вирусологических лабораторий центров госсанэпиднадзора и научно-исследовательских институтов.

Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций,

Чувствительность к ЦМВ лолуперевиваемшс штаммов клеточных культур

Таблица 4

Клеточная культура ■ ■ ........1 Время проявления ЦПД (чао) Титр ви- те#*,) Выявление гена в ИФ вирусного (чао) анти- J МЛ ) 12 24 48 11Э0-83 96 5,0 - + -н- ФЛЭЧ 24-48 5,0 + ++ +++ я я ц

3. Перевиваемые культуры клеток»

Культура клеток RB.

Получена из рабдосаркомы таза 7-летней девочки в 1968 г*

В ЕНИИВИ поступила из ВСКК (Институт цитологии РАН)* В лаборатории прошла более 20 пассажей. Культура состоит из веретено-видных, полигональных и крупных многоядерных клеток. Ядра овальные, ядрышки мелкие, многочисленные. Цитоплазма светлая, мелкозернистая, границы клеток выражены нечетко.

Доза посадки:

-    на пробирки - 100 тыс.кл./мл.;

-    на матрасы - 50-70 тыс.кл./мл.

Клетки снимают со стекла смесью версен-трипсин в соотношении 3:1,

Среда культивирования: омесь сред 199 и Игла в равных пропорциях с добавлением IC# эмбриональной сыворотки коров.

Культура чувствительна к ВПГ - инфекционные титры до 6,0 1$ ШД^о/мл и к ЦМВ - инфекционный титр до 5,0 lg ВД^д/мл.

Культура клеток RH,

Получена из ткани почки эмбриона человека, В ЕНИИВИ поступила в 1969 году из МКИИВП; в лаборатории прошла более 100 пассажей, Клетки однородные, полигональные, границы четко выражены. Монослой плотный.

Доза посадки:

-    на пробирки - 100 тыс.юг,/мл;

-    на матрасы - 40-50 тыс.кл./мл.

Среда культивирования: о ре да 199 о 7-1 (Й сыворотки КРС, беэ антибиотиков.

II

Кратность прироста 5-6 - на 4-е сутки.

Культура чувствительна к В1ГГ типа 2: титр - до 4,0 lg

мл.

Культура клеток Уего .

Получена из почечной ткани африканской зеленой мартышки. В ЕНИИВИ получена в 1983 году из ВСКК (Институт цитологии РАН); в лаборатории прошла Солее 20 пассажей. Фибробластоподобные клетки о мелкозернистой цитоплазмой. В ходе роста возможно образование трехмерных структур.

Доза посадки:

-на пробирки - 100 тыо.кл./мл;

-на матрасы - 50 тыо.кл./мл.

Кратность прироста 5-7 на пятые сутки.

Среда культивирования: среда 199 с Ь% КРС, без антибиотиков.

Культура чувствительна к ВПГ - титр 6,5-7,0 lg ТЦД^/мл, к IWB - титр до 2,0-3,0 lg TLUI^q/мл.

Культура клеток CPU.

Получена из тканей сердца обезьяны циномольгус. В ЕНИИВИ получена в 1970 году. К моменту исследования прошла более 100 пассажей. Клетки вытянутой формы с четкой структурой.

Доза поездки:

-    на пробирки - I00-120 тыс.кл./мл;

-    на матрасы - 50-70 тыс.кл./мл.

Кратность прироста - 4-5 на 5 сутки роста.

Среда культивирования: смесь сред 199 и Игла в ранних объемах с добавленном 102 сыворотки КРС и антибиотиков по общепринятой схеме. Культура чувствительна к ВПГ - инфекционный титр до 4,5 1 g ТиДп q/ мл .

Культуш клеток Toyрус-1.

Перевиваемый штамм гетероплоидных клеток почки теленка получен во ВНИИ гриппа РАШ в 1992 г. До начала опытов культура прошла в лаборатории ЕНИИВИ 8 пассажей.

Монослой полигональных клеток с четкой архитектоникой. Цитоплазма мелкозернистая, светлая. Ядра округлые, содержащие 2-4 ядрышка.

Доза поездки:

-    на пробирки - 45Q-5Q0 тыо.кл./мл;

-    на матрасы - 250-300 тыс.кл./мл.

Кратность прироста на 5-7 сутки - 2, митотический индекс

12

на 3 сутки - 23-25#о.

Среда культивирования* среда Игла МЕМ - 90#,сыворотка КРС -10#.Антибиотики - по общепринятой схеме.

Клетки снимают со отекла смесью раствора химопсина и 0,02# раотвора вврсена в соотношении I флакон химопсина на 0,4 литра вароена.

Клетки чувствительны к ВПГ - титр до 4,5-5,0 lg ТЦД^о/мл и к UMB - титр до 5,0-5,б ig ТЦД^о/мд.

В таблицах 5 и 6 представлены данные по исследованию чувот~ вательнооти перечисленных выше клеточных культур к Ш1Г и ЩАВ,

Таблица 5

Чувствительность к ВПГ перевиваемых культур клеток

—1....... ..........1 Клеточная культура Время проявления ЦПД (чао) ! " т Титр ви- 05) Выявление в ИФ (чао ^ярусного антигена 12 24 48 ш 48 3,5-4,0 ят *#~н- я я ц Vero 24 6,5-7,0 + Я я ц я ц соц 24-36 4,5 + ■*+ я я ц Я ц Тауруо-1 48 4,5-5,0 + ++ +++ я я ц я ц Таблица 6 Чувствительность к ЦМВ перевиваемых культур Клеточная Время Титр ви- Выявление вирусного антигена культура проявле- •туя fП7Я в иф (чао; иия ццд (чао) lLUkQ/ МЛ 12 24 48 RD 72 5,0 + *н* +++ я я ц Vsro 46-72 2,0-3,0 - + +++■ я я ц Тауруо-1 48 1-2 - + + + я я ц ЧЕр-2 72 1-2 - + ++ я я ц -41 96 2,0-2,5 + я

13

Проведенные исследования по анализу чувствительности клеточных культур низкотемпературного банка - тдузея ЕНИИВИ к ВИГ и ЦМЗ позволяют рекомендовать культуры клеток, описанные в настоящих рекомендациях, для лабораторной диагностики герпетической и цитомегаловирусной инфекций.

Шея отработанный в точение ряда лет опыт транспортировки клеточных культур на дальние расстояния, Екатеринбургский КИИВИ может обеспечить регулярное снабжение необходимыми культурами практических вирусологических лабораторий Госкомсаиэпиднадзора и Мицздравмедпрома Российской Федерации, что позволит в известной степени упростить и стандартизировать работу по дифференциальной диагностике заболеваний, вызываемых вирусами группы герпеса.

14

Отрывной лист учета эффективности использования методических рекомендаций

Направить в отделение планирования и внедрения Екатеринбургского НИИ вирусных инфекций (620030, г.Екатеринбург, ул.Летняя,23)

1.    Методические рекомендации: ^иКлеточные культуры в диагностике вирусных инфекций, вызываемых вирусами группы герпеса”

2.    Заместителем Председателя IK ОЭН РФ Онищенко Г»Г. 26Л1.94г.

{кем и когда утвержден)

(кем и когда получен)

4.    Количество центров госсанэпиднадзора в лечебно-профилактичес

ких учреждений, которые внедрили методы, предложенные документом __

5.    Формы внедрения (семинары, подготовка и переподготовка специалистов, сообщения и пр.) и результаты применения методов (количество наблюдений за 1 год и эффективность)

6. Замечания и пожелания

(должность,    лица,    заподаизшвго    карту)

КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ В ДИАПЮСТИКЕ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ВИРУСАМИ ГРЛШЫ ГЕРПЕСА

Методические рекомендации

Лицензия на издательскую деятельность ЛР № 020672 7 декабря 1992 г.

ПОДПИСАНО К ПЕЧАТИ 29.08.95 г. ФОРМАТ 60 X 84 I/I6 О БЬЕМ 0,94 ПЕЧ.Л. ТИРАЖ 150 экз. ЗАКАЗ ₈₁₁

Цех й 4 АО "Полиграфист", 620219 Екатеринбург.ул.Тургенева,20

ВВЕДЕНИЕ

Лабораторная диагностика герпесвирусных инфекций с использованием легочных культур - это один из основных методов в практической работе, так как морфологические изменения, выявляемые в зараженных культурах, являются специфическими.

Одни штаммы вирусов герпеса вызывают образование гигантских синцитиальных клеток, другие - округление и образование клеточных конгломератов. Очаги щттопатичеоксго действия вирусов проявляются в вило гладких округлых клеток, значительно увеличенных в размера. Спектр клеточных культур, используемых для изучения вирусов группы герпеса, по данным литературы, достаточно обширен. Широко применяются как первично-трипсйниаироьаннне культуры, подученные из различных органов и тканей человека и животных, так я перевиваемые линии клеток - СПЭБ, СОЦ, D-6, Не La и другие.

Для диагностики цитомегаловирусной инфекции (ЦМВ), в основном, используются первичные и диплоидные культуры клеток человеческого происхождения, а перевиваемые клеточные линей, по данным литературы, малочувствительны и для накопления вирусного антигена непригодны, что побуждает исследователей проводить постоянный поиск новых культур.

С целью отбора наиболее оптимальных клеточных культур для накопления герпесвируоов были изучены клеточные линии и штаммы коллекции низкотемпературного банка-музея Екатеринбургского НИИ вирусных инфекций.

Настоящие методические рекомендации обобщат данные литературы и собственный опыт по использованию клеточных культур в лабораторной диагностике инфекций, вызываемых вирусами группы герпеса. Описаны методы выделения вирусов простого герпеса и ци~ томегаловкруса, а также прямой и непрямой иммунофшфесцеитной микроскопии для их индикации в клеточной культуре.

3

I* Методы лабораторной диагностики о использованием клеточных культур

Для выделения вируса простого герпеса (ВГСГ) используют первичные культуры фиброблаотов эмбриона человека (ФЭЧ), диплоидные клетки легкого эмбриона человека (ЛЭЧ)_Р перевиваемые клетки почки зеленой мартышки ( Vero), Для изоляции цитомегаловнруоа пригодны культуры ФЭЧ, ЛЭЧ и перевиваемые клетки RD.

Для работы обычно используют 36-48-часовую клеточную культуру с полностью сформированным моноолоем. Конкротные сведения по культивированию и контролю качества клеток для вирусологических исследований изложены в "Методических рекомендациях по стандартизации работы о клеточными культурами для вирусологических исследований" (Свердловск, 1990 г.).

Перед заражением лмвают среду роста, монослой клеток промывают подогретым до 37°С раствором Хенкса или средой поддержания. В каждую пробирку вносят по 0,1 мл исследуемого материала в разведении 1:10 и оставляют его на 60 мин при 37°С для контакта с клетками, после чего сливают, а в пробирки вносят среду поддержания и помещают их в термостат. Наблюдение за клетками ведут ежесуточно, до наступления дегенерации в контрольной культуре. Наибольший интерес представляют клетки, в которых цитопатичео-кое действие (ЦПД) проявляется на 3-5 сутки с момента заражения.

Для приготовления антигена вирус вносят с множественностью заражения 0,01-1,0 TIU^qAui* Через 4-6 часов поело заряжения происходит набухание ядер и ядрышек клеток, а через 24 часа отмечается нарушение структуры монослоя и перераспределение хроматина ядер. В отдельных клетках образуются включения. ЦПД проявляется через 24-48 часов о момента заражения, монослой разрушается, Клетки в процессе дегенерации располагаются отдельными группами, формируя небольшие симлласты. Вирус простого герпеса вызывает маргиналию хроматина ядер и фрагментацию ядрышек, разрежение и лизис цитоплазмы клеток. Через 72 часа на стекле остаются лишь отдельные клетки с поздней стадией дегенерации.

Репликативный цикл ЩШ длительнее, чем ВПГ. При внесении вируссодержащего материала изменения монослоя наблюдаются через 72-96 часов и выражаются в появлении гигантских клеток шарооб-

4

разной формы с типичными эозинофильными включениями, занимающими значительную часть ядра. Ядерные включения окружены светлым ободком, что придает клетке вид "птичьего глаза". Формы таких ^иш1томогадов" различны: округлые, овально-вытянутые, яйцеобразные, что связано со скоростью размножения вируса. Через 96 часов внутриядерные включения вакуолизируются и распадаются, начинается клеточная деструкция.

Ясродко для выделения инфекционного вируса необходимо проведение хотя бы одного-двух "слепых" пассажей вируса в культуре, прежде чем инфекционная активность порсистирующего вируса проявится в виде типичного цигопатического действия.

2. Метод тллунофлюоресиетт! П4Ф).

Этот метод является одним из экспрессных методов лабораторной диагностики, обладающий рядом преимуществ: достаточно прост, позволяет сократить сроки исследования в 3-5 раз, пс сравнению с общепринятым. По чувствительности и специфичности не уступает другим.

Иглмунофлюоресцентный метод используется в следующих основных вариантах: прямой, непрямой, непрямой метод с добавлением комплемента и "интенсивный" метод флюоресцирующих антител (вариант непрямого метода). Чаще всего применяют первые два варианта.

Прямой метод ш^/тюиЧкюоресценпии. Реакцию иммунофлюоресценции ставят по методу Кунса. Приготовление "клеточных" тест-препаратов осуществляют следующим образом: культуру клеток разливают по I мл в пробирки с покровными стеклам1! и инкубируют при 37°0. После формирования монослоя клетки промываю? дважды стерильным раствором Хенкоа и заражают вируссодэржащш материалом в объеме ОД мл в разведении 1:10 или вирусами БПГ и ЦМВ в дозе 0,01-1,0 ТЦД^о/кл. Через 24 часа инкубирования при 37°С стекла извлекают, ополаскивают в физиологическом растворе, подсушивают, фиксируют охлажденным ацетоном в течение 10 минут и монтируют на предметном отекло с помощью лейкопластыря*

Приготовленные таким образом тост-препараты используют как для прямого, так и непрямого вариантов ИФ. В первом случае непосредственно на тест-препараты наносят люминооцирущие иммуноглобулины к БПГ,или ЦМВ в рабочем разведении, указанном на этикетке, помотают и>: во влажную камеру л выдергивают при 37^сС

30 кинут, затек дважды по 10 кинут промывают охлажденным забу~ фореиным физиологическим раотвором (pH 7,2-7,4), ополаскивают дистиллированной водой и подсушивают.

При непрямом варианте вначале наносят и соле дуемую сыворотку, а на втором этапе используют ФИТЦ - конъюгаты против иммуноглобулинов человека или животных, выпускаемые Институтом эпидемиологии и микробиологии мм.Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Окрашенные препараты просматривают в люминесцентном микроокопе "Люмам" (фильтры ФС-2, СЗС-7, BB-I5, запирающий №2, объектив Мйх90, окуляр х4), используя масляную (диметилфталат) или водную иммерсию - объектив ВИх70. Интенсивность флюоресценции в препаратах оценивают по общепринятой четырехкреотовой шкале:

4 - (++++) - сияющая флюоресценция включений;

3 - (+++) - яркая флюоресценция включений;

2 - (++)    -    отчетливая    флюоресценция включений меньшой яркости;

I - (+)    -    слабая,    неотчетливая    флюоресценция.

При оценке результатов учитывают лишь клетки с сохраненной структурой (ясно различимыми ядром и цитоплазмой) и отчетливой желтовато-зеленой специфической флуоресценцией в виде гранулярных включений в ядре или диффузным свечением цитоплазмы на 2+-. При отрицательном результате наблюдается слабое желтоватое (фоновое) свечение на 1+ и менее.

П. Характеристика клеточных культур, рекошндуемых для использования

I, Певвично-трипсинизированные культуры.

Первично-трипсинизированные культуры являются доступным суб-отратом для выделения и накопления ВПГ и ПМВ,

В таблице I и 2 представлены результаты оценки чувствительности этих культур к указанным вирусам с помощью метода имкуно-флюоресценции.

6

Чувствительность к ЦМВ лервично-тридсшкзирсванных культур

Таблица 2

Клеточная культура Время прояв ления & Титр вируса мл) Выявление вш антигена в т эусного Кратность Кчас) лассиро- 12 24 43 ФЭЧ-фи бробласты мышечной ткани вибриона человека 48 5,0 + я ++ я ц I пассаж ЛЭЧ-клетки легкого эмбриона человека 20-22 4,5-5,0 + ы я -*++■ 2-3 пао-я ц сажа

2. Характеристика диплоидных клеточных штаммов, рекомендуемых для работы с HUT и ИМВ.

Штамм 1130-83 (а.с. 1304403 от 15,12.86).

Штамм лодулеревиваемых клеток почки эмбриона овца (13ЭО-83) подучен в лаборатории клеточных культур ЕНШШ1,ко времени проведения опытов прошел более 50 пассажей. Цитопатяческях агентов в клетках не выявлено. Культура представлена полигональными клетками крупного размера, с выраженными границами и мелкозернистой цитоплазмой. Кратность прироста на 4-5 сутки роста - 5-6 раз, митотический индекс на 3 сутки роста - ЗСМС

Доза посадки:

-    на пробирки - 90—100 тыс*кл./мл;

-    на матрасы - 50-60 тыс.кл./мл.

Среда культивирования: смесь сред 199 и Игла в равных количествах, с добавлением 7% сыворотки крови КРС, Антибиотики: пе-ншцшгш, стрептомицин в дозе соответственно ТОО и 50 £д/мл. (Снятие клеток со стекла проводят 0,02# раствором вероеиа.

При заражении клеток 1130-33 в дозе P,0I-£,0 TUH^q/ios. специфические включения выявлялись в ядре и цитоплазме через 72 часа. Тите вируса составляет до 5,0 lg ^гн1^г^г/м?.

Штамм Гн{К-8€ (о.с, &4459837,^3 О-13 от Ol.Ofi.6K) .

Штамм полу порогиььэмнх клоток новорожденного кролика иоду-

чон в лаборатории клеточных культур ЕНИИВИ. Культура представляет собой плотный монослой полигональных клеток о выраженной структурой. Цитоплазма клеток светлая, с мелкой эернитостью. Яд-ра округлой формы, содержит 2-6 ядрышек* Кратность прироста на 3-4 сутки - 4,5-5,0 раз. Митотическая активность на третьи сутки роста - 30-34*#.

Доза посадки: на матрасы - 60-80 тыс.кл./мл; на пробирки -I00-120 тыо.кл./мл.

Среда культивирования! смесь равных объемов сред 199 и Игла с добавлением сыворотки КРС - I0SJ. Антибиотики: пенициллин, стрептомицин в дозе соответственно 100 а 50 Ед/мл.

ВПГ штамм Л-2 размножается в клетках, вызывая дегенерацию при первичном заражении через 48 часов, а при пассировании-через 24 часа после заражения. Титр инфекционной активности вируса составляет до 3,0-4,0 lg ТЦД^о/мл*

При иммунофшоорвецентном анализе клеток ПНК-86 через 24 часа после заражения антиген вируса определяется в 5C# клеток*

Штамм ПВО-88 - полупорэвиваемые клетки почки взрослой зеленой мартипки*

Подучен в лаборатории клеточных культур ЕНИИВИ и прошел болев 50 пассажей* Культура формирует монослой полигональных клеток с четкой структурой и мелкозернистой цитоплазмой* Ядра овальные, содержат 3-5 ядрышек.

Доза посадки:

-    на пробирки - I0O-IIQ тыо.кл./мл;

-    на матрасы - 50-60 тыо.кл./мл*

Кратность рассева 1:5-1:6. Монослой формируется на 3-4 сутки роста. Клетки снимают со стекла смесью вербен-трипсин в соотношении 1:1.

Среда культивирования: смесь равных объемов сред 199 и Игла с добавлением сыворотки КРС - Ъ%_щ Антибиотики - по общепринятой схеме.

Культура чувствительна к НПГ:тзтр вируса 4,5-5,0 lg BU^q/w».

Штамм ФЛЭЧ - клетки Фибробластов легкого эмбриона человека,

Подучен в лабораторий клеточных культур ЕКИИВй из ткачи легкого 16-ти недельного эмбриона человека. Клеточная культура представляет собой молослой однородн'ых фибробласте л сдобных клеток, обладающих ориентированным ростом. Цитоплазма светлая, с легкой зернистостью. Ядра содержат от I дс 4 ядрышек.

2

Кариотип клеток соответствует клеткам человеческого происхождения, &?% клеток на 25 пассаже оохраняют диплоидный набор хромосом, относительное количество клеток о аберрациями не превышало 3,5-4#. Клоткп свободны от контаминирующих агентов, не обладают туморогенной активностью.

Доза посадки:

-    на пробирки-400 тыс.кл./мл.;

-    на матрасн-150-200 тыо.кл./мл.

Кратность прироста - 2,0-2,5 раза на 4-5 сутки роста. Митотическая активность на 4 сутки роста 18-20#*,

Среда культивирования: среда Игла с добавлением 10* сыворотки КРС. Антибиотики - пенициллин, стрептомицин по общепринятой схеме. Клетки снимают со стекла смесью растворов версена и трипсина в соотношении 1:1,

Культура чувствительна к ВПГ - титр до 6,0 ig ТПД^мл и ЦМВ - титр до 5,0 lg ниЦ^/мл,

В таблицах 3 и 4 представлены данные по чувствительности к ВПГ и ЦМВ полулеревиваемых клеточных культур.

Таблица 3

Чувствительность к ВПГ полуперевиваемых штаммов клеточных культур

Клеточная культура	Время проявления ЦПД (чао)	Титр ви- Я®Ь>-	Выявление вирусного на в ИФ (час;		антиге-
			12	24	48
ПЭО-83	48	5,0	-	4	4+
				Я	я Ц
ПИК-86	20-22	4,0	+	4+	44*4
				Я	Я Ц
ПВО-88	36-48	4,5-5,0	+	44	444
				Я	Я Ц
ФЛЭЧ	20-22	4,5-6,0	+	4+	44-+
			я	Я Ц	Я ц