Государственная Комисссия СМ СССР по продовольствию и закупкам

1ОТ139,М₀сква,БЛ39,

Орликов пер.,I/II.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

по лабораторной диагностике стрептококкоза животных

I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

IЛ. Стрептококков - инфекционная болезнь , вызываемая стрептококками различных серологических групп и поражающая животных всех видов и возрастов.

Стрептококки, патогенные для животных, вызывают у молодняка, как правило, острые инфекции со значительным охватом поголозья( мыт, цервикальный лимфаденит, менинго-энцефалит, артрозо-артрит и др.) Сом. Приложение I).

Тяжесть течения болезни и летальность зависят как от внешних факторов, так и от индивидуальных особенностей организма. У взрослых животных болезнь может протекать бессиптомно или проявляться в зиде абортов, метритов к маститов.

1.2.    Возбудители болезни относятся к роду ypfcepitwet, который включает более 20 серологических групп стрептококков. Различающихся антигенными свойствами и обозначаемых заглавными буквами латинского алфавита.

Кроме указанных в Приложении I, от животных выделяется стрептококки серогрупп A, (9,K,K,0,P,R,S, а также пневмококки.

1.3.    Микроорганизма, относящиеся к роду Stz£pfv&ece-u$ ,- сферические или озоидкне клетки, располагающиеся парами или цепочками различной длины, как правило, неподвижны, спор не образуют,каталазоотрицательные, аэробы или факультативные анаэробы,по Граму окрашиваются всегда положительно, при ферментации глюкозы никогда не выделяют газа.

I.A. Кроме стрептококков от животных часто выделяют другие грам-положителькые кокки, первичную дифферениацию которых проводят в соответствии с Приложением 2.

2.

1.5.    Диагноз на стрептококкоз устанавливают по результатам лабораторных исследований с учетом эпизоотологических клинических данных.

1.6.    Лабораторная диагностика стрептококкеза зключает микроскопию мазков-отпечатков, выделение культур стрептококков с последующей их идентификацией.

1.7.    Материалом для лабораторного исследования служат головной и костнвй мозг, кровь сердца, селезенка, печень, суставная жидкость, со держимое абсцессов павших или вынужденно убитых животных, головной мозг и кровь сердца абортированного плода, сперма, молоко, при метрите - истечения из шейки матки.

Взятие и доставку материала осуществляют в соответствии с действующими правилами взятия патологического материала, крови, кормов и пересылки их для лабораторного исследования.

Патологический материал должен быть взят и исследован в течение 6 часов, а при условии хранения его в охлажденном состоянии - 10-12 ч

2. ВЫДЕЛЕНИЕ КУЛЬТУРЫ СТРЕПТОКОККОВ

2.1. Высевы из патологического материала делают пастеровской пипет кой в кясо-пептонный бульон с 1% глюкозы и 10$ инактивированной нормал ной сыворотки лошади и на мясо-пептонный агар с 1$ глюкозы 5-10$ де-фибринированной крови барана или кролика. Посввы инкубируют з термоста те при 37-38°С в течение 18-24 часов.

2.2. На глюкозо-кровяном агаре стрептококки растут в виде мелких роеинчатых, прозрачных или слегка мутноватых колоний с ровными краями, окруженных, как правило, зоной гемолиза.

В препаратах из культуры с плотной питательной среды&стрептохокки располагаются парами, короткими цепочками, иногда образуют скопления.

3 мазках иа бульонных культур стрептококки располагаются в основном цепочками различной длины.

3. дЙФФЕРЕЩйАЦМ И иВЕаВагИТвлсиан ЙДЕИТМфИнАцуш СРВШТоЕОМОВ

3.1.    Для предварительной дифференциации стрептококков от других кокков пользуются данными Приложения 2.

3.2.    Для дифференциации стрептококков от стафилококков используют каталазную пробу.

Для постановки ааталазной пробы на предметное стекло накосят каплю свежеприготовленного 3$-ного раствора перекиси водорода, бактериологической петлей снимают одну или несколько колоний тестируемы микроорганизмов и растирают их в капле перекиси водорода. Стафилокск ки ,в отличие от стрептококков, образуют каталазу и вызывают пенообр .зование.

3.

3.3. Для предварительной идентификации стрептококков,пневмококков и энтерококков С стрептококки группы Д) используют признаки указанные в таблице.

Серологи ческая группа стрепто кокков	Ге мо лиз	Рост на среде с 10$ желчи	Рост на среде сЧ0$ желчи	Рост на среде с 6,5? хлорист. натра	Характер роста в жидкой питательной среде	-щ раффи- " нозы	рментация ббр- мак= бита вита
А		+	-	-	диффузный	-	-	-
В		+	-	-	придонный	-	-	-
С	Р		-	-	придонный	-	-	-
д	«С	+	+	+	диффузный	-	-	+
Е	J3	+	-	-	диффузный	-	+/-	+
F	Р	+	-	-	диффузный	-	+/-	-
G	3	+	-	-	диффузный	-	-	-
К	р	+	-	-	диффузный	-	-	-
ь	р	+	-	-	придонный	-	-	-
If	X	+	-	-	диффузный	-	-	-
0	Р	+	-	-	диффузный	+	-	-
р	Р	+	-	-	диффузный	-	+	+
в	X	+	-	-	диффузный	+	-	-
	X	+	-	-	диффузный	+	-	-
3	X		-	-	диффузный	+	-	-
Рпеимос.	X	-	-	-	диффузный		-	-

Обозначения: "+" - рост (ферментация) имеется

- рост(ферментация) отсутствует ”+/-^п - признак не постоянный

3.3.1.    Гемолиз. По характеру гемолиза стрептококки делят на три группы:

X- гемолитические стрептококки - вызывают неполный гемолиз эритроцитов, характеризующийся образованием вокруг колоний зеленоватой зоны гемометаморфоза;

- гемолитические стрептококки - вызывают полный гемолиз эритроцитов, характеризующийся образованием вокруг колоний зоны полного просветления;

стрептококки - не вызывают гемолиза эритроцитов.

3.3.2.    Рост на среде с 10% желчи.

3 2 пробирки с глюкозо-сывороточным бульономС в одну из которых добавлено 10$ желчи крупного рогатого скота, вторая - контрольная, без желчи) вносят по 0,5-0,7 см^ суточной бульонной культуры и виде):

живают при 37-38°С в течение одного часа.

В случае лизиса культуры содержимое опытной пробирки просве

4.

3.3.3.    Рост на среде с 40$ желчи. Чистую культуру стрептококков засевают в глюкозо-сывороточный бульон, содержащий 40% желчи крупного рогатого скота, и инкубируют при 37-38°С в течение 18-24 часов, после чего учитввают наличие или отсутствие роста.

3.3.4.    Рост на среде с 6,5$ хлористого натрия. Чистую культуру стрептококков засевают в глюкозо-сывороточный бульон, содержащий 6,5$ хлористого натрия. Учет результатов проводят через 18-24 ч инкубирован при 37-38°С по наличию или отсутствию роста.

3.3.5.    Ферментативные свойства. Для определения ферментативный свойств выделенных культур стрептококков используют: среда Гисса с раффинозой, сорбитом, маннитом. Посевы инкубируют при 37-38°С 18-24 ч, после чего проводят учет результатов.

3.4. При выделении культуры стрептококков серологической группы Д следует определить разновидность энтерококков, поскольку кроме пато-reHHBxjfe    эту    группу    входит и    являющийся    облигатным

обитателем кишечника человека и животных. Для этого используют среду с теллуритом калия или энтерококковую дифференциально-диагностическую среду. Кудьтуры5^/ад##5 устойчивы к телдуриту калия(0,07$) и хорошо растут на плотной среде в его присутствии, образуя колонии черного цвета. Культурыiiifaz&utv на этой среде не растут.

На энтерококковой дифференциально-диагностической среде через 14-18 ч роста колонииобретают вишнево-красный цвет, а колонии Sib.faemt«остаются бесцветными или белыми.

4. СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ СТРЕПТОКОККОВ к Л. Для установления серогрупповой принадлежности стрептококков используют стрептококковые групповые преципитирующие сыворотки.^ж

Данные таблицы 3, а также характеристика наиболее широко распространенных стрептококке зов ( Приложение 2) служат отправными точками при выборе необходимой сыворотки.

4.2. Серогрупповую принадлежность стрептококков определяют в реакции преципитации в капиллярах.

^Стрептококковые групповые преципитирующие сыворотки изготавливает и высылает по заявкам ЗГНКИ ветпрепаратов.

5

4.3. Приготовление антигена для постановки реакции преципитации.

4.3.1.    Испытуемые культуры стрептококков выращивают в мясо-пептон-ком бульоне или бульоне Хоттингера с I% глюкозы при температуре 37-38°С в течение 18-20 часов.

4.3.2.    Выращенные культуры в объеме 7-9 см переносят в стеклянные центрифужные пробирки вместимостью 12-15 см и центрифугируют при 3500-4000 об/мин в течение 25-30 минут.

4.3.3.    После окончания центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 0,3-0,4 е** 0,2jf раствора соляной кислоты, тщательно взбалтывают и помещают эту суспензию в кипящую водяную баню на 10 минут.

4.3.4.    После охлаждения пробирки под струей водопроводной воды к ее содержимому добавляют одну каплю 0,04^-ного спиртового раствора фенолфталеина Синдикатор) и нейтрализуют 0,2$. раствором едкого натра, добавляя этот раствор по одной капле и доводя окраску смеси до бледно-розовой.

4.3.5.    Затем смесь вновь центрифугируют при 3500-4000 об/мин. в течение 25-30 мин до получения прозрачной надосадочной жидкости,которую используют в качестве антигена для постановки реакции преципитации

4.4. Постановка реакции преципитации.

4.4.1. Для постановки реакции преципитации используют стеклянные капилляры или тонко оттянутые кончики пастеровских пипеток диаметром О,5-1,0 мм.

6.

4.4.6. При постановке реакции необходимо обратить внимание на еле дующие положения:

-    антиген,сыворотка, растворы соляной кислоты и едкого натра долж ны быть абсолютно прорачными;

-    растворы соляной кислоты и едкого натра готовят не реже одного раза в два месяца;

~ если в результате перетитровки едким натром окраска антигена стала малиновой, следует добавить 1-2 капли 0,25 раствора соляной кислоты;

-    сыворотка и антиген в капилляре должны слиться. 3 случае, если между ними образовался пузырек воздуха, следует взять другой капилля и повторить реакцию.

5. ДИАГНОЗ

5.    Лабораторный диагноз на стрептококкез считают установленным в случае выделения из исследуемого материала культуры стрептококков соответствующей группы.

6.    Одновременно с результатами идентификации стрептококков в хозя£ ство сообщают также данные о чувствительности выделенных культур к антибиотикам.

7.    Все культуры, не идентифицирующиеся входящими з набор сыворотками, следует направлять зо Всесоюзный государственный научно-контрол ный институт ветеринарных препаратов по адресу: 123022,г.Москва, Звенигородское шоссе, 5.

ж ж ж

С утверждением настоящих Методических указаний утрачивают силу Методические указания по лабораторной диагностике стрептококкоза животных и лабораторным исследованиям на пневмококковую инфекцию животных, утвержденные Главным управлением ветеринарии соответственно 30 августа 1983 г. и 5 янзаря 1904 г.

Приложение I.

Наиболее распространенные стрептококкозы и их возбудители

Наименование болезни	Серологическая группа
Мастит животных	В, С, Е
Артрозо-артрит поросят, полиартрит ягнят,мы® лошадей, стрептококкоз кур, пушных зверей, морских свинок	G
Знтерококковая инфекция телят, ягнят, поросят, стрептококкоз кур Цервикальный лимфаденит свиней Сепсис свиней	Д Е I
Менинго-энцефалит поросят отъемного возраста	а
Менинго-знцефалит поросят подсосного возраста	S

Приложение 2.

Отличительные особенности родов семейства

Si* a pioc&ccci еео е.

Наименование рода	Характерные признаки
$£ъерЪшссг5	Клетки делятся в одной плоскости. Глюкозу ферментируют до образования молочной кислоты без выделения углекислого газа.
/лмюяо%Ь&.	Клетки делятся в одной плоскости. Глюко-зу ферментируют с образованием углекислого газа.
Pedtocoecus	Клетки делятся в двух плоскостях, образуя тетрады. Глюкозу ферментируют до образования молочкой кислоты без выделения углекислого газа.
Ае^о teems	Клетки делятся в двух плоскостях, образуя тетрады. Глюкозу ферментируют до образования молочной кислоты без выделения углекислого газа.
	Клетки делятся 'в одн'ой плоскости. раму окрашиваются негативно.

о

Приложение 3.

РЕЦЕПТЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

I. Глюкозо-сывороточный бульон.В свежеприготовленный мясо-пептанный бульон, содержащий 1% глюкозы (pH 7 Л-7,6),соблюдая правила стерильности, добавляют 10$ нормальной инактивированной сыворотки крови лошади и асептично разливают в стерильные пробирки по 5-7 см .

Сыворотку инактивируют прогреванием в течение 30 мин в -водяной бане при 56°С.

2.    Глюкозо-кровяной агар. К расплавленному и стерильному 2$-ному мясо-пептонному агару, охлажденному до 45°С ( не выше), содержащему

I% глюкозы, прибавляют 5-10$ дефибринированной, стерильно взятой крови кролика или барана. Кровь добавляют в среду, соблюдая правила стерильности. Приготовленную среду разливают в стерильные чашки Петри (предварительно нагретые в термостате), дают застыть и подсушивают в термостате. Слой агара должен быть равномерно окрашен в красный цвет.

3.    Желчный бульон. К мясо-пептонному бульону добавляют нативную желчь крупного рогатого скота и устанавливают pH среды 7,4-7,6. Для получения Ю$-нсго желчного бульона к 90см^ МПБ прибавляют 10 см^ желчи, для получения 40$~ного - к 60 см"* МПБ прибавляют 40 см^ желчи.

Приготовленный желчный бульон разливают в пробирки по 5-7 см^ и стерилизуют в автоклаве 20-30 мин при ПЗ-П5°С ( 0,6-0,7 атм).

4.    Среда с 6,5$ хлорида натрия. В 100 см'⁵ МПЕ в количестве 6,0

хлорида натрия, после его растворения разливает в пробирки по 5-7 см'* и стерилизуют в течение 20-30 мин при I атм.

5.    бреда с тол у д.о- к.-. ;я. 2. мясо-пептонному агару, охлажденному до 45-50°С, добавляют из расчета на IG0G' ем^ - 50см инактивированной нормальной сыворотки крови лошади, 0,1 г налидиксовой кислоты ( неграм или невиграмон) к 0,7 г(35 ем'* 2$-ного водного раствора) теллурита калия. Среду перемешивают и разливают в чашки.

6.    Знтерскохксвая дифференциально-диагностическая среда.

К мясо-пептонному агару, охлажденному до 45-50°С, перед употреблением

кроме глюкозы и 5$ дефибринированной крови добавляют из расчета на

IC00 см гТТХ(2,3,5—тркфенилтетразолий хлорид) 0,1 г , 0,01С-ный водный

раствор кристаллического фиолетового- 12,5 см^, налидиксовей кислоты-

-0Д г, стерильного обезжиренного молока - 200 см^:

ТТХ и налидикссвую кислоту предварительно растворяют в небольшом

количестве стерильного бульона.