МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ ДИСПАНСЕРИЗАЦИИ РАБОЧИХ С ВРЕДНЫМИ УСЛОВИЯМИ ТРУДА

Методические рекомендации

ЛЕНИНГРАД

1980

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР

ЛЕНИНГРАДСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГИГИЕНЫ ТРУДА И ПРОФЕССИОНАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

«СОГЛАСОВАНО» Начальник Главного управления НИИ и координации научных исследований Б. Т. В е л и ч к о в с к и й 14 сентября 1979 г.

«УТВЕРЖДАЮ» Заместитель министра здравоохранения РСФСР Н. Т. Т р у б и л и н 20 февраля 1980 г.

---

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ ДИСПАНСЕРИЗАЦИИ РАБОЧИХ С ВРЕДНЫМИ УСЛОВИЯМИ ТРУДА

Методические рекомендации

ЛЕНИНГРАД

1980

тельца Гейнца при воздействии ряда веществ — метгемогло-бинобразователей. Исчезновение этих телец, вместе с содержащими их эритроцитами, происходит через несколько дней после прекращения контакта с токсическим агентом.

Окраска телец Гейнца

Реактивы. 1 г метилового фиолетового (или другого из перечисленных выше красителей) растворяют в 100 мл 0,6% раствора натрия хлорида.

Приготовление препарата. К нанесенной на предметное стекло капле крови из пальца добавляют каплю красителя. Соединенные капли перемешивают, покрывают покровным стеклом и помещают во влажную камеру на 1 — 3 часа при комнатной температуре. Микроскопируют с иммерсионным объективом.

Норма и оценка результатов. В эритроцитах здоровых людей тельца Гейнца не встречаются. При интоксикациях метгемоглобинобразователями почти в каждом поле зрения и в каждом эритроците обнаруживается 1—3 тельца диаметром от 0,5 до 1,5 мкм.

ГЕМОГЛОБИН И ЕГО ПРОИЗВОДНЫЕ

Гемоглобин (НЬ) —заключенный в эритроцитах дыхательный пигмент, обеспечивающий транспорт кислорода из легких в ткани и участвующий в переносе углекислоты из тканей в легкие. НЬ является белком из группы хромопротеи-дов (металлопротеидов). Непременным условием нормального функционирования НЬ является пребывание в его молекуле железа в двухвалентной форме (Fe⁺⁺). Все производные НЬ обладают характерными спектрами поглощения, измерение которых лежит в основе количественного определения их соотношений.

Основной особенностью НЬ является способность образовывать рыхлое, легко диссоциирующее соединение с кислородом, т. е. переходить в оксигенированное состояние — оксиге-моглобин (НЬОг).

Карбоксигемоглобин (СОНЬ). Помимо кислорода, гемоглобин способен связывать ряд других газов и соединений, из которых в клинической токсикологии наибольшее значение имеет окись углерода (угарный газ, СО). Образующееся при этом соединение — карбоксигемоглобин — подчиняется тем же закономерностям образования и диссоциации,

10

что и оксигемоглобин. Различие состоит в скоростях указанных процессов и, в первую очередь, в скорости диссоциации. Результатом этого различия является более высокое сродство гемоглобина к окиси углерода, чем к кислороду (в 200— 300 раз). Связанный с СО гемоглобин не может присоединять и транспортировать кислород, поэтому количество переносимого кровью кислорода уменьшается пропорционально карбоксигемоглобинемии. Развивается гипоксия. В присутствии СОНЬ затрудняется диссоциация и молекул оксигемо-глобина. Этим свойством СОНЬ в значительной степени объясняется токсичность окиси углерода и эффективность кислородной терапии при отравлениях ею.

Определение содержания карбоксигемоглобина в крови (Л. Э. Горн)

Метод основан на фотометрическом определении разницы светопоглощения растворов НЬ0₂ и СОНЬ после денатурации их щелочью.

Оборудование и реактивы. Универсальный фотометр ФМ (или горизонтальный). Раствор аммиака 0,04 % -Растворы едкого калия и натрия 0,2 н.

Определение. В две пробирки наливают по 4,9 и 5,9 мл 0,04% раствора аммиака, после чего в каждую из них вносят по 0,1 мл крови. В первую пробирку, предназначенную для определения светопоглощения исходной денатурированной крови, содержащей искомое количество СОНЬ и НЬ0₂, быстро добавляют 5 мл раствора щелочи, быстро перемешивают пробу двукратным опрокидыванием на пробку и фото-метрируют через минуту после внесения щелочи (50—70 сек, не более!) при светофильтре № 5 (М-55 или М-52, эффективная длина волны пропускаемого света 550 или 520 ммк). Содержимое второй пробирки, в которой определяют общее количество гемоглобина, прямо фотометрируют при светофильтре № 6 (М-50, 496 ммкм). Фотометрирование ведется по общепринятым правилам в кюветах 10 мм против дистиллированной воды.

При использовании светофильтра № 5 (М-55) содержание СОНЬ вычисляют по формуле:

°/ СОНв— 132 Е денатурированного НвР₂ + СОНв '°    Е    общего    Нв    ’

Если светофильтр имеет марку М-52, а не М-55, то коэффициент 132 заменяется на 123.

11

Пр имер расчета. Среднее из пяти отсчетов значение величины Е денатурированного НЬ0₂ + С0НЬ равно 0,46: Е

общего НЬ = 0,70; %СОНЬ=     81    =    132X0,66—81    =

= 6%.

Методические замечания. Предлагаемый метод сравнительно прост, быстр и не нуждается в использовании дефицитных приборов. При хранении проб в темноте, в закрытых пробирках, фотометрирование без ущерба для точности результата может быть проведено через несколько часов после взятия крови. Приведенная формула применима только при фотометрировании на указанных приборах. Использование фотоэлектроколориметров из-за широкополосное™ находящихся в них светофильтров, не рекомендуется, т. к. чувствительность метода при этом падает в 2—3 раза, а ошибка определения соответственно возрастает. Определение СОНЬ может проводиться так же по одному из вариантов спектрофотометрического метода.

Норма и оценка результатов. В крови лиц, профессионально не соприкасающихся с окисью углерода, некоторое количество СОНЬ в крови присутствует и обусловлено практически постоянным загрязнением атмосферы продуктами неполного сгорания всех видов топлива. По данным ЛНИИ гигиены труда и профессиональных заболеваний, у городских жителей, не связанных с воздействием СО на производстве, в крови содержится 2—15%, а по указаниям П. А. Розенберг и Н. П. Бялко — 0—12% СОНЬ. Средняя концентрация СОНЬ в крови колеблется, по различным данным, от 2— 4 до 6—8%. Источником для образования СОНЬ является не только экзогенная окись углерода, но и, в какой-то степени, окись углерода, образующаяся в результате неполного окисления ряда продуктов обмена в организме, в частности, самого гемоглобина.

Установлено, что легкой форме острой интоксикации окисью углерода соответствует в среднем 20%, средней — 30% и тяжелой — 35—50% СОНЬ. Отравление, при котором содержание СОНЬ превышает 50%, заканчивается обычно смертью.

При вынесении пострадавшего в чистую атмосферу и при вдыхании кислорода диссоциация СОНЬ протекает сравнительно быстро (за первый час концентрация СОНЬ уменьшается вдвое), поэтому результаты лабораторного исследования крови, взятой после оказания пострадавшему первой

помощи, могут дать искаженное представление о начальной максимальной концентрации СОНЬ, и тем самым — клинической тяжести интоксикации. В связи с этим необходимо максимально сокращать интервал между оказанием первой помощи и взятием крови для определения СОНЬ.

При хронической интоксикации окисью углерода скорость диссоциации СОНЬ в крови значительно уменьшается.

Метгемоглобин (гемиглобин, MtHb). При воздействии на организм окислителей как неорганических (перекиси, нитриты, марганцевокислый калий, бертолетова соль и др.), так и некоторых органических веществ (нитро- и аминопроизводные бензола, анилин и его производные и др.) происходит истинное окисление входящих в молекулу гемоглобина атомов железа (Fe⁺⁺—Fe⁺⁺⁺). В результате образуется метгемоглобин, неспособный легко отщеплять кислород, т. е. участвовать в его транспорте. Помимо прямого выключения части гемоглобина из функционирования, метгемоглобин ведет к ухудшению отдачи кислорода остальной, не-блокированной частью гемоглобина. Следствием этого процесса является гипоксия, пропорциональная содержанию мет-гемоглобина. Тяжесть интоксикации тем выше, чем меньше исходное содержание общего гемоглобина в крови.

При отравлениях метгемоглобинобразователями, в связи с наличием в организме ряда ферментных и неферментных систем, происходит спонтанное восстановление гемоглобина. Оно осуществляется в присутствии глюкозы, глутатиона, молочной пировиноградной и аскорбиновой кислот, ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, метгемоглобинредуктазы и др. Непрерывное функционирование этой системы объясняется тем, что из кишечника и тканей в кровоток постоянно поступают различные продукты обмена, способные вызывать образование MtHb. Не менее существенно прямое окисляющее действие самого кислорода. При выпадении какого-либо из звеньев восставливающей системы (эссенциальная метгемо-гобинемия) в крови в остальном вполне здоровых людей может присутствовать MtHb в количестве до 40%- Другой, так же редко встречающесй причиной метгемоглобинемии является наличие в крови гемоглобина М.

Определение в крови содержания метгемоглобина (Л. Э. Горн)

Метод основан на фотометрическом определении разницы светопоглощения растворов окси- и метгемоглобина.

13

Оборудование и реактивы. Универсальный фотометр ФМ пли горизонтальный фотометр. Раствор аммиака 0,04%. Свежеприготовленный насыщенный раствор красной кровяной соли.

Определение. В две пробирки наливают по 3,5 и 7,3 мл раствора аммиака и в каждую из них вносят по 0,2 мл крови. Во вторую пробирку, предназначенную для определения общего гемоглобина, добавляют одну каплю раствора красной кровяной соли (перевод всего гемоглобина в метгемоглобин), и оставляют пробу на 1 час для завершения реакции. Через час фотометрируют обе пробы в кюветах 10 мм против дистиллированной воды при светофильтре № 3 (М-61, эффективная длина волны 619 мкм). Содержание метгемоглобина вычисляют по формуле:

°/ МНр-59 ^{Е иссле}ДУ^ем°го Нв0₂+МШв jg,

⁰    Е    общего Нв    ’

Пример расчета: среднее из пяти отсчетов значение Е исследуемой пробы (Hb0₂ + MtHb) равно 0,30; Е общего НЬ =

= 0,70; отсюда °/₀МНв = 59—--18    =    7%.

Методические замечания. Предлагаемый метод прост, быстр, не требует дефицитных приборов и реактивов. Численные коэффициенты в расчетной формуле требуют периодической проверки и коррекции. Остальные указания см. «Карбоксигемоглобии».

Норма и оценка результатов. У здоровых людей содержание MtHb в крови не превышает 1—3%. Легкая форма острого отравления метгемоглобинобразователями сопровождается повышением содержания MtHb в крови до 20%; средняя — до 30—35%; тяжелая — до 50%. Перевод 50—60% общего гемоглобина в метгемоглобин ведет, как правило, к смертельному исходу.

УРОБИЛИН

Уробилин — продукт самоокисления бесцветного пигмента уробилиногена, содержащегося в свежевыпущенной моче, является вторично всосавшимся в кровоток билирубином. Уробилин обладает специфическим спектром поглощения и характерной зеленой флуоресценцией в ультрафиолетовом свете. Последнее лежит в основе методов его определения.

14

Оборудование. «Люминесцентная установка для оп-ределения витаминов в моче» или ЛЮМ-1, ЛЮМ-2, «Ультрасвет», или любой другой источник ультрафиолетового излучения.

Определение. Пробирку, содержащую 5—6 мл профильтрованной мочи, облучают ультрафиолетом в затемненном помещении. При нормальном содержании уробилина свечение мочи голубое (реакция отрицательная). При повышенном содержании уробилина появляется зеленая флуоресценция различной интенсивности. Различают слабоположительную реакцию при бледно-зеленой флуоресценции ( + ); положительную реакцию при хорошо выраженной флуоресценции (+ +) и резкоположительную реакцию при интенсивной флуоресценции зеленого цвета ( + + + ).

Методические замечания. Предлагаемый полуко-личественный метод прост и быстр. Как правило, другие компоненты мочи не мешают определению. Для ориентировочной оценки результаты полуколичественного определения вполне достаточны. Для точного количественного определения может быть использован спектрофотометрический метод.

Норма и оценка результатов. За сутки здоровый человек выводит с мочой 3—6 мг уробилина (уробилиногена). Выведение больших количеств свидетельствует о недостаточности печени (частичной потере способности печеночных клеток извлекать этот пигмент из крови воротной вены). При некоторых интоксикациях (ртутью, марганцем, мышьяком, фосфором, кадмием, фтором, галогенозамещенными углеводородами жирного ряда—-нафталинами, фенолом, хлоропре-ном) содержание уробилина в моче повышается, что при сопоставлении с результатами других функциональных проб печени позволяет судить о характере и степени ее поражения.

ГЕМАТОПОРФИРИН

Г е м а т о п о р ф и р и и — смесь пигментов, не содержащих железа предшественников гемоглобина в процессе его синтеза. Основным компонентом гематопорфирина является ко-пропорфирин II. Растворы гематопорфирина обладают специфическим спектром поглощения и характерной красной флуоресценцией в ультрафиолетовом свете, что лежит в основе методов его определения.

15

Полуколичественное определение гематопорфирина в моче (Г. Ф. Океанова, Г. М. Федоров)

Определение основано на визуальной оценке цвета и интенсивности флуоресценции при облучении гематопорфирина, содержащегося в моче, ультрафиолетовым светом.

Оборудование и реактивы. Любой источник ультрафиолетового излучения (см. «Уробилин»), снабженный фильтром Вуда (светофильтры УФС-2 пли УФС-3). Уксусная кислота, 6 н, раствор; перекись водорода, 3% раствор (не стоек); эфир наркозный.

Определение. К 10 мл свежесобраниой мочи (или хранившейся в темноте не более 8—10 часов) в обычной пробирке добавляют 0,5 мл уксусной кислоты, 1—2 капли перекиси водорода и 1,5 мл эфира. Пробирку закрывают пробкой и встряхивают. Образовавшуюся пену освещают 2—3 минуты ультрафиолетовым светом. При отсутствии гематопорфирина пена бесцветна или окрашена в голубой цвет. В присутствии гематопорфирина пена приобретает различной интенсивности красную окраску.

Методические замечания. Предлагаемый метод прост и быстр. Для ориентировочной оценки получаемые результаты вполне достаточны. Для точного количественного определения содержания копропорфирина в моче может быть рекомендован спектрофотометрический метод (П. А. Розенберг, Н. К. Бялко).

Норма и оценка результатов. В норме за сутки с мочой выводится около 120 мкг гематопорфирина. Оценка его количества по цвету флуоресценции производится следующим образом: бледное розовое или фиолетово-розовое окрашивание пены говорит об отсутствии гематопорфирина или содержании его в пределах нормы. Развитие розовой, яркорозовой, бледно-красной или ярко-красной флуоресценции свидетельствует о повышенном выведении гематопорфирина и выражается в системе баллов (соответственно: —, +, + + , + + +, + + + +) или словесно (реакция отрицательная, слабо положительная, положительная, резкоположительная).

При некоторых интоксикациях (ртутью, мышьяком, сульфаниламидами и, главным образом, свинцом) гематопор-фирин выводится мочой в значительных количествах. Ценность определения гематопорфирина при диагностике сатурнизма и носительстве свинца весьма велика, так как повышение его количества встречается чаще, чем увеличение цир-

куляции свинца в крови и экскреции его с мочой. Однако прямого параллелизма между уровнем экскреции порфиринов п тяжестью интоксикации свинцом нет. При дифференциальной диагностике сатурнизма необходимо учитывать, что повышение количества порфиринов в моче может наблюдаться при тяжелых анемиях различной этиологии, при некоторых заболеваниях печени, авитаминозах и, в особенности, при эссенциальной порфпрнп — врожденном или приобретенном хроническом заболевании, одним из ведущих симптомов которого является нарушение синтеза гема.

ДЕЛЬТА-АМИНОЛЕВУЛИНОВАЯ КИСЛОТА

Дельта-аминолевулиновая кислота (АЛК)—один из промежуточных продуктов синтеза гема в эритроцитах, в норме практически не экскретируется с мочой. Особенностью токсического воздействия свинца является специфическое торможение образования гема на стадии АЛК, накопление и усиленное выведение ее с мочой.

Определение АЛК в моче

Метод основан на хроматографическом выделении АЛК из мочи на ионообменной смоле, последующей элюции и колориметрии образовавшегося после прибавления ацетил-ацетона и парадиметиламинобензальдегида окрашенного соединения.

Оборудование и реактивы. Хроматографические стеклянные колонки диаметром 7 и высотой 300 мм. Ионообменная смола ДАУЭКС 50X8 или КУ-2 (240—400 меш). Ацетат натрия, 0,5 М раствор. Едкий натр, 2 н. раствор. Соляная кислота 4,2 н. и 1 и. растворы. Уксусная кислота ледяная. Хлорная кислота 70% раствор. Ацетил-ацетон. Ацетатный буфер с pH 4,6: в литровую колбу вносят 136 мл натрия ацетата — CH₃COONa • ЗН₂0, 57 мл ледяной уксусной кислоты и доводят объем дистиллированной водой до метки. Реактив Эрлиха II: 0,3 г парадиметиламинобензальдегида растворяют в 9 мл ледяной уксусной кислоты, добавляют 2,4 мл 70% хлорной кислоты и доводят объем ледяной уксусной кислотой до 15 мл. Реактив неустойчив и годен к употреблению в течение 6 часов.

Подготовка хроматографической колонки. На дно колонок помещают небольшие ватные пробки. Зали-

17

вают в колонки взвесь ионообменной смолы через слой воды так, чтобы над ватной пробкой образовался слой смолы вы сотой 2—3 см. Поверхность смолы накрывают кружком фильтровальной бумаги и промывают колонку 25 мл дистиллированной воды.

Подготовка смолы. Смолу многократно взмучивают в дистиллированной воде. После осаждения крупных частиц надосадочную жидкость отсасывают пли декантируют. Затем смолу заливают на 20 ч двойным объемом 2 н. раствора едкого натра, периодически встряхивая. Далее, смолу промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции и обрабатывают последовательно одним объемом 4 н. и шестью объемами 2 н. раствора соляной кислоты. Хранят смолу в закрытом сосуде в 1 н. растворе соляной кислоты, при комнатной температуре.

Определение. Рекомендуется анализировать свежесобранную мочу. 1 мл мочи с pH 4—7 вносят в хроматографическую колонку и пропускают через нее со скоростью 5—6 капель в мин. Затем колонку отмывают от мочевины, пропуская через нее 40 мл дистиллированной воды и 3 мл 0,5 М раствора ацетата натрия с той же скоростью. Промыв-ную жидкость выбрасывают. Далее под колонку подставляют центрифужную пробирку емкостью 10 мл и пропускают через колонку еще 7 мл раствора ацетата натрия и 1 мл ацетатного буфера с pH 4,6. В полученный элюат вносят 0,2 мл ацетил-ацетона и доводят объем до 10 мл ацетатным буфером. Параллельно готовят контрольную пробу, для чего в такую же пробирку вносят 7 мл ацетата натрия, 0,2 мл ацетил-ацетона и доводят объем смеси до 10 мл ацетатным буфером. Обе пробирки закрывают притертыми пробками, кипятят в водяной бане 10 мин и охлаждают под струей воды до комнатной температуры. По 2 мл жидкости из обеих пробирок переносят в другие пробирки и в каждую из них добавляют по 2 мл реактива Эрлиха II. В зависимости от концентрации АЛК в пробе раствор в пробирке, содержащей исследуемую мочу (элюат), приобретает желтую, желтовато-розовую, красную или темно-красную окраску.

Норма и оценка результатов. Наиболее простой способ оценки концентрации АЛК — визуальный. Два первых оттенка указывают па отсутствие АЛК в исследуемой моче или наличие ее в количествах, не превышающих норму. Наличие других окрасок указывает на повышенное выведение АЛК. Результат может быть выражен в системе баллов (0,

18

1, 2, 3 и 4) или словесно (содержание АЛК: «в пределах нормы», «незначительно повышено», «повышено», «значительно повышено»). Для точного количественного определения может быть рекомендован спектрофотометрический метод.

Повышенная экскреция АЛК является одним из наиболее ранних и достоверных лабораторных признаков сатурнизма. Частота обнаружения этого признака при токсическом воздействии свинца выше, чем частота повышенной экскреции гематопорфирина, свинца, циркуляции свинца в крови,а так же базофильной зернистости эритроцитов. Особенно ценно определение АЛК в качестве экспозиционного теста при массовых медицинских осмотрах рабочих и при гигиенических исследованиях.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СВИНЦА В МОЧЕ (Л. Э. Горн)

Метод основан на концентрировании свинца в результате его соосаждения с образующимся в анализируемой пробе мочи углекислым кальцием и нефело-колориметрическом определении в форме окрашенной коллоидной мути сульфида свинца.

Оборудование и реактивы. Вытяжной шкаф. Центрифуга на 3000 об/мин. Водоструйный насос. Песчаная баня. Электроплитки. Соляная кислота, разведенная 1:1. Азотная кислота концентрированная. Едкий натр, 30% раствор. Бумага лакмусовая. Хлорида кальция 1 н. раствор, очищенный частичным соосаждением (219 г СаС1₂-6Н₂0 или 111 г СаС1₂ растворяют в 700 мл воды; отдельно растворяют 143 г Na₂C0₃ • ЮН₂0 или 53 г Na₂C0₃ в 300 мл воды; оба раствора сливают при постоянном помешивании и после отстаивания декантируют прозрачный надосадочный слой жидкости в специальную бутыль). Карбоната натрия 0,5 н. раствор, очищенный частичным соосаждением (143 г Na₂CO₃*10H₂O пли 53 г Na₂C0₃ растворяют в 700 мл воды; отдельно растворяют 30 г СаС1₂*76Н₂0 или 15 г СаС1₂ в 300 мл воды; оба раствора сливают при постоянном помешивании и после отстаивания декантируют прозрачный надосадочный слой жидкости в специальную бутыль). Пергидроль (30% раствор перекиси водорода), Цитрата натрия трехзамещенного 50% раствор Лимонной кислоты х. ч. 60% раствор. Тиосульфата натрия 40% раствор. Раствор Селена (смесь равных количеств насыщенных растворов буры и борной кислоты). Глицерин-

19

В рекомендациях собраны хорошо зарекомендовавшие себя в практике методы гематологического и биохимического исследования с данными для оценки их результатов, необходимые при проведении предварительных, при поступлении на работу и периодических медицинских осмотров рабочих с вредными условиями труда.

Методические рекомендации разработаны Я. В. Ревновой и Л. Э. Горном

© Ленинградский научно-исследовательский институт гигиены труда и профессиональных заболеваний

сульфидный реактив (5 г сульфида натрия N₂S-9H₂0 растворяют в смеси 30 мл глицерина и 10 мл воды; оставляют на сутки и при необходимости фильтруют, хранят в темноте в плотно закрытой склянке). Основной стандартный раствор свинца (1,6 г РЬ(МОз)₂ растворяют в 1 л 0,01 н. НС1; раствор стоек). Из основного стандартного раствора свинца, каждый раз заново, готовят рабочие растворы путем разведения в 100 или 10 раз (соответственно содержащие 10 или 100 мкг свинца в 1 мл).

Определение неорганических соединений свинца. Не менее 500 мл безбелковой или предварительно освобожденной от белка мочи из суточного количества с помощью 1 н, раствора соляной кислоты или едкого натра доводят по лакмусу до нейтральной реакции. Несвежая моча для исследования не пригодна. Присутствующие иногда в моче кристаллы мочевой кислоты в большом количестве, следует растворить реактивом Селена. Нейтрализованную мочу переносят в высокую узкую склянку, приливают 4 мл раствора хлорида кальция и при постоянном помешивании, в несколько приемов, на протяжении 5 мин прибавляют по каплям раствор карбоната натрия до появления легкой мути. Резкого помутнения следует избегать, так как в присутствии избытка карбоната натрия выпадает осадок карбоната цинка, который мешает дальнейшему определению. Исследуемую пробу оставляют для отстаивания осадка карбоната кальция и увлекаемого с ним карбоната свинца до следующего дня. Затем отсасывают водоструйным насосом или декантируют прозрачную надосадочную жидкость. Осадок количественно переносят в центрифужные пробирки, смывая со стенок посуды остатком мочи, центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают. Соединенные осадки растворяют в 2—3 мл концентрированной азотной кислоты, количественно, с помощью нескольких мл воды переносят в маленькую колбу Кьельдаля и выпаривают досуха на песчаной бане или электроплитке. К, остывшему осадку добавляют 1— 2 мл концентрированной азотной кислоты и несколько капель пергидроля, и вторично минерализуют пробу при нагревании до образования белого остатка нитрата кальция. Охлажденный сухой остаток растворяют в 5 мл соляной кислоты 1:1, количественно с помощью 5 мл цитрата натрия переносят в колориметрическую пробирку с плоским дном и притертой пробкой диаметром 15 и длиной 250 мм, подщелачивают30% раствором едкого натра до отчетливо щелочной реакции, но

20

ВВЕДЕНИЕ

Описание методов лабораторных исследований лиц, подлежащих периодическим медицинским осмотрам и наблюдению лрофпатологов, рассеяны по ряду руководств, монографий, журналов и поэтому пользование ими в практике лабо раторных работников периферических поликлиник и медсанчастей затруднено. Вместе с тем, нужда хотя бы в краткой сводке таких методов велика. В методических рекомендациях приводится описание наиболее употребительных, опробиро-ванных методик, часть из которых разработаны или модифицированы в лаборатории Ленинградского НИИ гигиены труда и профессиональных заболеваний, другие заимствованы из различных источников и хорошо зарекомендовали себя в практике пашей и других лабораторий. Опыт показал, что чувствительность, точность, и воспроизводимость рекомендуемых методов достаточна для решения большинства вопросов, возникающих в повседневной практике проф-патологов.

*

При решении вопросов диагностики профессиональных болезней, помимо общих, применяется ряд специальных гематологических и биохимических анализов.

Поскольку признаки поражения системы крови встречаются в практике весьма часто, а при хронических отравлениях бензолом, веществами бензольного ряда, свинцом, геми-ческими ядами и при воздействии ряда факторов физической природы могут являться ведущими симптомами заболевания, гематологическое исследование имеет важное значение.

Проявления токсических поражений системы крови имеют ряд особенностей, связанных с характером, структурой и степенью воздействия этиологического фактора. Однако в ряде случаев можно наблюдать однотипные изменения при воздействии различных токсических веществ и, наоборот, значи-

3

тельную вариабельность их при действии одного и того же фактора.

В связи с большой лабильностью и реактивностью системы крови при проведении исследований необходимо учитывать условия, которые могут повлиять на результаты. Рекомендуется проводить все исследования утром натощак, т. к. известно, что в течение суток возможны колебания показателей морфологического и биохимического состава крови, часть из которых связана с приемами пищи.

При оценке результатов исследования крови следует использовать сопоставление с «нормой», выработанной на основании обследования контингентов здоровых людей. Оценку степени отклонений показателей отдельных лиц проводят в сопоставлении с величинами, ограниченными интервалом х±1,5 сигмы контрольной группы («Нормы»). Для выяснения общей направленности изменений крови в группе обследуемых рабочих следует сопоставлять средние величины изучаемых показателей обследуемой и контрольной группы.

Важным условием совершенствования практики лабораторных исследований, обеспечивающими возможность сопоставления результатов повторных осмотров и данных, полученных разными лабораториями, является использование унифицированных методик.

Обследование больших контингентов рабочих требует повышения производительности труда работников лабораторий за счет внедрения автоматических и полуавтоматических приборов и устройств. Для ускорения подсчета форменных элементов крови хорошо зарекомендовали себя ФЭК.-М или ФЭКН-57, целлоскопы и другие счетчики. При систематической торировке (не реже 1 раза в 2—3 месяца) хорошо воспроизводимые результаты дают и эритрогемометры. Пробирочный метод счета форменных элементов крови, по Н .М. Николаеву, также значительно сокращает затраты времени на исследования.

ТРОМБОЦИТЫ

Тромбоциты принимают непосредственное участие во всех звеньях процесса свертывания крови от механической защиты и образования первичного тромба на месте повреждения сосудистой стенки до выделения при их распаде прокоагулянтов, ретрактильных веществ и участия в процессах регулирования тонуса и проницаемости сосудов. Значительное

4

снижение количества тромбоцитов имеет самостоятельное значение в происхождении некоторых форм геморрагических диатезов. Однако, явления кровоточивости могут возникать и при нормальном или повышенном количестве тромбоцитов, вследствие нарушения их функционального состояния.

Среди известных методов подсчета тромбоцитов принципиально различаются две группы: подсчет в мазках (метод Фонио) и подсчет в камере Горяева, В связи с распространением автоматических счетчиков форменных элементов крови определенное значение приобрел метод подсчета тромбоцитов при помощи приборов типа «Целлоскоп» и других. Величина погрешности при использовании большинства общепринятых методов велика и составляет 20—30% (О. И. Пикса-нов и В. П. Щенникова). Более точными и воспроизводимыми являются «камерные» методы; при автоматическом подсчете эритроцитов более удобным является метод Фонио.

Подсчет тромбоцитов по Фонио

Реактивы. Стерильный раствор сульфата магния 14%. Фиксаторы Лейшмана или Май-Грюнвальд; краситель Рома-новского-Гимза.

Приготовление препарата. На проколотую и насухо вытертую кожу пальца наносят каплю раствора сульфата магния, смешивают с ней каплю крови из пальца, из смеси готовят мазки, высушивают и окрашивают по Паппен-гейму.

Подсчет тромбоцитов. В окрашенном мазке сосчитывают 1000 эритроцитов и все встретившиеся при этом тромбоциты. Таким образом получают относительное число, выражаемое %о (промилле). Для вычисления абсолютного количества тромбоцитов эту величину следует умножить на количество эритроцитов в 1 мкл и разделить на 1000. Пример: в мазках найдено 64%₀ тромбоцитов; количество эритроцитов у пациента составляет 3,5-10⁶ в 1 мкл; отсюда число тром-

34У 3 3 . 1П⁶

боцитов в 1 мкл будет равно-- =224*    10³    в    1    мкл.

Подсчет тромбоцитов в камере

(модификация И. И. Данилина)

Реактивы. 3,5% раствор цитрата натрия. Фурациллин. Разводящая жидкость готовится из расчета 0,025 г фурацил-

5

лина на 100 мл 3,5% раствора цитрата натрия. Введение фур ацил лин а позволяет готовить разводящую жидкость на длительное время: 1—2 месяца, при условии хранения в холодильнике.

Подсчет тромбоцитов. Кровь из пальца набирают в эритроцитарный меланжер до метки 0,5, разводящую жидкость — цитратно-фурациллиновую смесь — до метки 101. Подсчет ведется в 5 или 10 средних квадратах камеры Горяева, аналогично подсчету эритроцитов. Результат в абсолютных цифрах получают умножением числа тромбоцитов, найденных в камере, на 10 000 или 5000.

Норма. Количество тромбоцитов у здоровых людей колеблется от 180* 10³ до 320* 10³ в 1 мкл.

РЕТИКУЛОЦИТЫ

Ретикулоциты, молодые эритроциты, в которых при су-правитальной окраске выявляется базофильное сетчато-нитчатое вещество. Повышенное количество ретикулоцитов свидетельствует, как правило, о повышенной активности эрит-ропоэза и ускорении его темпов. Ретикулоцитоз является симптомом большинства анемий (железодефицитной, острой постгеморрагической, гемолитической). Снижение числа ретикулоцитов может указывать на недостаточную регенераторную способность кровотворения. Это относится к гипо-апла-стическим состояниям различного, в том числе, профессионального происхождения (бензольная интоксикация, хроническая лучевая болезнь), а также к анемиям, связанным с дефицитом фактора «B_i2 — фолиевая кислота», до начала патогенетического лечения. Клиническая оценка количества ретикулоцитов должна быть сугубо индивидуальной. В случаях, когда преходящий ретикулоцитоз предшествует повышению количества эритроцитов, он является положительным прогностическим признаком. Нарастание числа ретикулоци-тов при гемолитической анемии свидетельствует об усилении гемолиза и тем самым отражает нарастание тяжести основного заболевания.

Ретикулоцитоз является одним из постоянных признаков хронической интоксикации свинцом.

Подсчет ретикулоцитов

Реактивы. Насыщенный раствор красителя блестящего крезилового синего или Азур-П на 0,9% растворе хлорида

0

натрия (1 г красителя на 100 мл раствора NaCl). Растворение идет медленно, в тепле; к употреблению краситель готов не ранее, чем через сутки после приготовления.

Приготовление препарата. Капилляром Панчен-кова в небольшую пробирку вносят 15 мм красителя и 20— 25 мм крови из пальца, перемешивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре (время инкубации можно увеличить до 2-х часов). Из смеси готовят мазки на обезжиренных предметных стеклах.

Подсчет р е т и к у л о ц и т о в. Рекомендуется использовать суженное поле зрения, для чего в окуляр микроскопа вкладывают диафрагму из черной бумаги с окном 4X4 мм. Дополнительной окраски препараты не требуют. После обнаружения первого ретикулоцита в мазке сосчитывают 1000 эритроцитов и все встретившиеся при этом ретикулоциты. Результат выражает в процентах или промилле.

Норма. У здоровых людей количество ретикулоцитов колеблется от 4 до 12°/₀₀.

ЭРИТРОЦИТЫ С БАЗОФИЛЬНОЙ зернистостью

В отличие от включений, окрашиваемых суправитально в ретикулоцитах, в отдельных эритроцитах может обнаруживаться зернистость, выявляемая после фиксации мазка крови. Считают, что эта зернистость так же свойственна молодым эритроцитам, но в условиях патологии, поскольку она встречается при различных формах анемии. Большое количество базофилыю-зернистых эритроцитов находят при хронической интоксикации свинцом и его неорганическими соединениями. При этом профессиональном заболевании оценка количества базофильно-зернистых эритроцитов имеет диагностическое значение. Однако н при некоторых других интоксикациях (гемические яды, бензол, сероуглерод) базофильно-зернистые эритроциты могут обнаруживаться, хотя и реже, чем при сатурнизме.

Окраска эритроцитов с базофильной зернистостью

Реактивы. Этанол 96°. Основной раствор красителя: 1% водный раствор метиленового синего. Рабочий раствор готовят перед употреблением из основного (2 капли на 1 мл воды с нейтральной реакцией).

7

Подсчет эритроцитов с базофильной зернистостью в «темном поле»

Подсчет эритроцитов с базофильной зернистостью в проходящем свете (обычная микроскопия), широко используемый в практике, имеет ряд существенных недостатков, главные из которых его трудоемкость и связанная с ней низкая воспроизводимость и сходимость результатов. Значительные преимущества метода темного поля позволяют рекомендовать последний для использования в лабораториях, проводящих исследования крови у лиц, контактирующих со свинцом. Эффект темного поля достигается путем замены обычного конденсора на «темнопольный» (выпускается ЛОМО, ОИ-13); при этом необходимо иметь осветитель с ирисной диафрагмой (типа ОИ-19 или ОИ-31) и отдельный микроскоп. В иммерсионный объектив вкладывают конусную диафрагму, имеющуюуся в комплекте ОИ-13. При работе с современными микроскопами (МБИ, БИОЛАМ) для достижения эффекта темного поля следует удалить винт-ограничитель, расположенный на кремальере конденсора (под предметным столиком). Необходимы тонкие предметные стекла для мазков (не более 1 мм в толщину).

Установку освещения следует производить по методу Келлера, который сводится к следующему:

1.    Выбирают окуляр 7^х или 10^х и наименьший объектив 8^х.

2.    На верхнюю линзу конденсора (или на оборотную сторону предметного стекла с мазком) наносят каплю иммерсионного масла. Устанавливают предметное стекло на столик микроскопа.

3.    Поднимают конденсор (ОИ-13) до соприкосновения с каплей масла.

4.    При закрытой диафрагме осветителя, поставленного на 15—20 см от микроскопа, направляют пучок света на плоскую сторону зеркала так, чтобы на нем появилось изображение нити накала лампы осветителя. Передвигая патрон лампы по продольной оси, добиваются максимальной резкости этого изображения. Для контроля можно положить на зеркало белую или папиросную бумагу.

5.    Под визуальным контролем движениями зеркала направляют изображение нити лампы на нижнее отверстие конденсора (наблюдать при помощи простого зеркала, положенного на подставку микроскопа).

8

6.    Приоткрывают диафрагму осветителя. При этом в поле зрения появляется светлое кольцо.

7.    Фокусируют тубус микроскопа на препарат; устанавливают освещенное кольцо в центр поля зрения (при помощи центрировочных винтов конденсора); движениями конденсора вверх — вниз добиваются появления в центре поля зрения светящегося пятна на месте кольца.

8.    Наносят каплю иммерсионного масла на лицевую сторону препарата и переходят к наблюдению с иммерсионным объективом. При этом в поле зрения должны быть хорошо видны светящиеся контуры эритроцитов. Базофильная зернистость выглядит в виде светящихся зерен, покрывающих весь эритроцит и не выходящих за его пределы. Характер зерен от пылевидных до грубых оскольчатых.

Подсчет. После того как найден первый базофильно-зернистый эритроцит, просматривают 40 полей зрения и подсчитывают все встретившиеся эритроциты с базофильной зернистостью (считать все эритроциты не нужно). Ответ дается в количестве базофильно-зернистых эритроцитов на 10 ООО (40 полей зрения по 250 эритроцитов в среднем) или в пересчете на миллион эритроцитов, для чего полученную цифру следует умножить на 100.

Норма и оценка результатов. У здоровых людей, не подвергающихся воздействию свинца и других токсических веществ, количество базофильно-зернистых эритроцитов не превышает 1000 на миллион. Для интоксикации свинцом характерны цифры 2000 и выше. При обнаружении базофильно-зернистых эритроцитов в количестве от 1000 до 1900 рекомендуется привлекать результаты повторных исследований и данные других лабораторных и клинических исследований.

ТЕЛЬЦА ГЕЙНЦА

Тельца Гейнца — округлые глыбкообразные образования в эритроцитах, расположенные обычно по краю и обнаруживаемые при суправитальной окраске интактных клеток или мазков крови метиловым фиолетовым, сульфатом нильского синего или блестящим крезиловым синим. Образование телец Гейнца связано с глубокими дегенеративными изменениями в цитоплазме эритроцитов, повреждением молекул гемоглобина и, в частности, денатурацией отщепившегося от них глобина; их наличие свидетельствует о глубоких функциональных нарушениях этих клеток. Обнаруживаются