ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ

•САНКТ-ПЕТЕРБУРГ-

-МОСКВА-

•КРАСНОДАР-

•2015-

26.    Результаты учета реакции регистрируют в специальных журналах, которые должны быть прошнурованы, пронумерованы и скреплены печатью.

IV. МЕРЫ ЛИЧНОЙ ПРОФИЛАКТИКИ

27.    При работе с препаратами, входящими в состав набора, следует соблюдать общие правила личной гигиены и техники безопасности, предусмотренные при работе с ветеринарными препаратами. При попадании на открытые участки тела или слизистые оболочки глаз, рта, носа и после окончания работы руки и другие открытые участки тела моют водой с мылом.

28.    Набор следует хранить в местах, не доступных для детей.

ПРИЛОЖЕНИЕ к инструкции по применению набора для диагностики инфекционной анемии лошадей в реакции диффузионной преципитации (РДП) (рис. 13...15).

О%0-_Гин

-_г

Условные обозначения: А — лунки с антигеном, С — лунки с контрольными антисыворотками, 1, 2, 3, 4, 5, 6 — лунки с испытуемыми сыворотками.

Лабораторная диагностика вирусных болезней животных

Инструкция разработана ФГУ «ВИЭВ» и ФГУП •Щелковский биокомбинат». 141142, Московская обл., Щелковский район, п. Биокомбината, ФГУП •Щелковский биокомбинат» .

Набор рекомендован к регистрации ФГУ •ВГНКИ*. Регистрационный номер ПВР-1-2.3/01289.

С утверждением настоящей инструкции прекращает действие на территории России наставление по применению набора для диагностики инфекционной анемии лошадей в реакции диффузионной преципитации за № 13-5-02/ 0894 от 27.01.2004, утвержденное Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ.

Адрес предприятия-изготовителя: 141142, Московская область, Щелковский район, п. Биокомбината. Коммерческая служба: (495)225-18-16, тел./факс МО (256) 3-23-48, регион (496-56) 3-23-48.

КРАТКИЙ СЛОВАРЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ВЕТЕРИНАРНЫХ ТЕРМИНОВ

Антигены (анти + греч. genes — порождающий) — чужеродные для организма высокомолекулярные органические вещества коллоидной структуры (белки, белково-липидные и белково-полисахаридные комплексы), способные при поступлении (введении парентерально) вызывать синтез особых глобулинов-антител и вступать в специфическое взаимодействие с ними.

Антитела (анти. + тело) — противотела — специфические белки (иммуноглобулины), образующиеся в организме под воздействием антигенов. Они накапливаются в сыворотке крови и тканях, вступают в специфическую связь с соответствующими антигенами и разрушают или обезвреживают их.

Биологическая проба (биопроба) — один из методов диагностики инфекционных болезней с помощью заражения патологическим материалом подопытных животных (куриных эмбрионов, культур клеток) и их исследования.

Вирион — полноценная внеклеточная вирусная частица.

Вирусовыделение — выделение возбудителей инфекции из организма больного животного или вирусоносителя.

Вирусоноситсльство — наличие возбудителя инфекции в определенных органах и тканях клинически здорового животного, не сопровождающееся иммунологической перестройкой организма.

Вирусы (лат. virus — яд) — облигатные внутриклеточные паразиты, отличающиеся от растительных и животных организмов малыми размерами, отсутствием клеточного строения и автономного метаболизма, наличием только одного типа нуклеиновой кислоты и дезъюнктивным способом размножения.

Краткий словарь использованных ветеринарных терминов

янтмпш 1шяишшм1м111№шш1ип^,;ю1»мм1аиш1м1пи|1и|ммив1»111мкмм1мы1

В. безоболочечные — вирусы, в структур© которых отсутствует липопротеидная оболочка.

В. оболочечные — вирусы, в структуре которых присутствует липопротеидная оболочка.

Вирусоскопия (вирусы + akopeo — смотрю, наблюдаю) — метод микроскопического изучения морфологии вирусов.

Гемагглютинация (греч. halma — кровь + agglutinatio — склеивание) — склеивание и выпадение в осадок эритроцитов под воздействием вирусов, бактерий, токсинов идр., способных адсорбироваться на поверхности эритроцитов, а также ге-магглютининов.

Гемадсорбция (греч. halma — кровь + adsorbtlo — поверхностное поглощение) — способность культур клеток, зараженных вирусами, адсорбировать эритроциты различных животных, что объясняется включением в плазматическую мембрану синтезирующихся вирусных белков.

Диагностика (греч. diagnostlhoe — способный распознавать) — раздел клинической ветеринарии о методах исследования животных для распознавания их болезней и состояния органиома с целью назначения необходимого лечения и профилактических мероприятий.

Диагностический набор — набор стандартных препаратов, используемых для постановки диагноза (антиген, специфическая и контрольная сыворотки идр.).

ДНК-зондов метод — метод генодиагностики, основанный на способности меченой одноцепочечной молекулы ДНК взаимодействовать с комплементарной ей молекулой нуклеиновой кислоты определенного вируса с образованием двухцепочечной структуры.

ДНК>содержащие вирусы — вирусы, имеющие один тип нуклеиновой кислоты — ДНК, у большинства она представлена двухцепочечной структурой, у некоторых — одной цепью.

Идентификация (лат. tdentlflco — отождествляю) — признание тождественности, опознание-определение видовой (типовой) принадлежности микроорганизма на основании всестороннего изучения его свойств.

Иммуноферментный анализ —- группа методов, позволяющих выявлять комплекс антиген — антитело с помощью субстрата, который расщепляется ферментом (пероксидазой, щелочной фосфатазой идр.) с появлением окрашивания.

Инактивация вирусов (лат. inactivua — неактивный) — уничтожение инфекционной активности вирусов путем повреждения генома физическим или химическим воздействием.

Индикация возбудителя инфекции (лат. indicatio — указание) — выявление и идентификация патогенных микроорганизмов в различных объектах.

Инокуляция возбудителя (лат. Inoculatlo — прививка) — введение возбудителя путем инъекции (искусственное заражение или внесение его в организм животного членистоногими переносчиками при укусах).

Консервирование вирусов (лат. conservure — сохранять) — общее название методов воздействия физическими и (или) химическими факторами на какие-либо объекты с целью длительного сохранения в них вирусов.

Контаминация (лат. contaminatio — смешение) — обсеменение поверхности тела животного, предметов ухода, почвы, воды, кормов, биопрепаратов и других объектов патогенными микроорганизмами.

Культивирование вирусов — выращивание вирусов в искусственных условиях.

Культуры клеток (клеточные культуры) — клетки многоклеточного организма, живущие вне его в искусственно созданных условиях среды.

Куриный эмбрион — оплодотворенное куриное яйцо, выдержанное в инкубаторе.

Лабораторные животные — животные, используемые в лабораториях при проведении исследований (мыши, крысы, кролики, морские свинки, хомяки, голуби идр.).

Лиофилизация (греч. 1уо — растворяю + phileo — люблю) — высушивание предварительно замороженного материала в глубоком вакууме.

Моноклональные антитела —* строго специфические антитела, способные выявить минимальные различия в химическом составе и пространственной конфигурации молекул, являются продуктом отдельных клонов антителопродуцирующих клеток.

Парные сыворотки — сыворотки, взятые в самом начале заболевания и 2...3 недели спустя. Повышение титра антител в 4 раза и более считается основой положительной реакции.

Пассаж (фр. passage — переход) — последовательное заражение восприимчивых объектов (животные, куриные эмбрионы, культуры клеток) микроорганиомами.

Полимеразная цепная реакция (от англ. Polymerase Chain Reaction, ПЦР) — метод генодиагностики, основанный на многократном увеличении копий строго определенных фрагментов

молекулы ДНК вируса при помощи фермента термостобилыюй ДНК-полимеразы.

Реакция гемапл ютннацни (РГА) — метод обнаружения и идентификации вирусов, основанный на способности многих вирусов, обладающих тканевым тропизмом, агглютинировать эритроциты определенных видов животных.

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) (лат. fluorescens — светящийся) — серологическая реакция, основанная на взаи-модействии антиген — антитело, при этом один из компонентов, участвующий в реакции, связан с флуоресцирующим красителем.

Реакция нейтрализации (PH) — метод идентификации вируса, основанный на феномене потери им инфекционности в результате взаимодействия со специфическими антителами.

Реакция связывания компемеита (РСК) — метод серологического исследования, основанный на способности образующегося комплекса антиген — антитело связывать комплемент, что выявляется по отсутствию гемолиза при добавлении гемолизина и эритроцитов.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) — метод идентификации вируса или выявления противовирусных антител в сыворотке крови, основанный на феномене отсутствия агглютинации эритроцитов вирусом, в присутствии специфических к нему антител.

РНК-содержащие вирусы — вирусы, имеющие один тип нуклеиновой кислоты — РНК, у большинства она представлена одной цепью, у некоторых — двухцепочечной структурой.

Серовариант — самостоятельная группа внутри определенного вида и серогруппы (серотипа) микроорганизмов, обусловленная наличием антигенов, отличающихся от антигенов других микроорганизмов этого вида и серогруппы (серотипа), что выявляется с помощью серологических реакций.

Серогруппа (серотип) — самостоятельная группа внутри определенного вида микроорганизмов, обусловленная наличием антигенов, отличающихся от антигенов других микроорганизмов этого вида, что выявляется с помощью серологических реакций.

Серологические реакции — реакции, широко используемые при постановке диагноза инфекционных болезней, методы обнаружения антител и антигенов в крови и других тканях.

Сыворотка крови (лат. serum, — сыворотка + sanguis — кровь) — составная часть крови, представляющая собой плазму, из которой удалены форменные элементы и фибрин в процессе свертывания крови.

Тельца включения — своеобразные морфологические образования, обнаруживаемые в цитоплазме или ядрах клеток определенных тканей при некоторых вирусных инфекциях и состоящие из скопления вирионов и вирусных белков.

Термолабильность (греч. thermos — теплый + лат. labilis —■ нестойкий) — неустойчивый к тепловому воздействию, изменяющийся при нагревапии.

Термостабильность (греч. thermos — теплый + лат. stabilis — неизменный) — сохраняющий свои свойства при нагревании.

Титр вируса — концентрация инфекционных единиц вируса в определенном объеме материала.

Цитонатогенное действие вирусов (ЦПД, цитонатический эффект) — специфическая морфологическая деструкция (разрушение) и функциональная патология зараженных вирусами клеток в культурах.

Штамм (нем. stamm — род, корень) — культура микроорганизмов одного вида с одинаковыми морфологическими и биологическими свойствами.

Элементарные тельца — см. Вирион (2, 8).

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ

СПИСОК

1.    Лабораторные исследования в ветеринарии. Вирусные, риккетсиозные и паразитарные болезни : справочник / под ред. Б. И. Антонова. — М.: Агропромиздат, 1987. — 240 с.

2.    Баку лов, И. А, Элизоотологический словарь-справочник / И. А. Бакулов, Г. Г. Юрков, В. А. Ведерников [и др.]. — М.: Россе льхозиз дат, 1986.

3.    Нымм, Э. М. Словарь ветеринарных микробиологических и вирусологических терминов / Э. М. Нымм, К. А. Петерсон, Э. А. Аавер [и др.]. — М.: Росагропромиздат, 1989.

ПРЕДМЕТНЫЙ

УКАЗАТЕЛЬ

Агар мясо-пептонный (МПА) 101, 109, 126, 326, 387, 444, 466, 476, 483, 542, 688 Альбумин бычий 7, 226, 618 Аппарат Киппа 126, 480 Бульон мясо-пептонный (МПБ) 78, 101, 109, 126, 326, 444, 466, 476, 483, 496, 542, 688 —    триптозо-фосфатный 519 Буфер вероналовый 36, 376 —    боратный 148 —    фосфатно-солевой 174, 315, 328, 661, 604 —    калий-фосфатный 231, 236, 407 —    карбонатно-бикарбонатный 336, 561,604,618 Гемолизин 25, 114, 300, 369.    507 Гемолитическая система (гемсистема) 25, 116, 216 Жидкость Руге 106, 446 —    Карнуа 108 Иммуноасцнтическая жидкость (ИАЖ) 84 Комплемент 27, 116, 216, 300, 370,    507

Метод вирусоскопии 99, 443, 648 —    Кербера 66 —    иммуноферментного анализа (ИФА) 88, 169, 173, 228, 233, 244, 314, 328, 336, 349, 406, 409, 436, 561, 603,609, 617 —    кофал-теста 514 —    перекрестного иммунитета 64 —    полимеразной цепной реакции (ПЦР) 180, 253, 307, 342, 416, 426, 625 —    Рида и Мекча 66, 242, 297, 324, 380, 394, 600, 523, 562, 556 —    влектрониой микроскопии 327, 593 Окраска гистопрепаратов по Ленцу 80 —    Турбиной 584 —    Туревичу 81,584 —    мазков по Борману — Гайнуллиной 74 —    Михину 74 —    Морозову 100, 446 —    Муромцеву 73 —    Пашену 100, 447 —    Селлерсу 74 Перевиваемая линия почки свиньи (СПЭВ) 70, 386, 392

---

—    культура клеток ВНК-2/ 18,110 —    культура клеток почки поросенка (РК-25) 289, 392 Первично-трилсинизировян-пая культура клеток почки свиньи (ПЭС) 70, 141» 386 —    почки эмбриона коров (ПЭК) 141, 218, 239 —    селезенки эмбриона коров (СЭК) 218 —    легкие эмбриона коров (ЛЭК )218 —    тестикулов бычка (ТВ) 218, 239 •— почка ягненка 110 Раствор 30-60% -ного стерильного глицерина 21, 72,100, 108, 386, 482, 688, 616 *— азида натрия 600 —    азотнокислого серебра 106, 446 —    Альсевера 55, 271, 361 —    бис-диаэобенэидина 56 —    борно-боратный буферный 676 —    бромистого этидия 180, 253, 306, 342, 416, 625 —    версена 17, 69, 296 —    гексаметафосфата натрия 215 —    зябуференый физиологический (ЗФР) 7, 298, 325, 353, 386, 399, 563, 596 —    лимоннокислого натрия 127,135, 402, 448, 458, 469, 476, 535 —    мединал-вероналовый 83, 569 —    мертиолята 376,600 —    натрия хлористого 7, 171, 215, 269, 276, 287, 352, 376, 392, 571,611 —    трипсина 18, 69, 295 —    физиологический 21, 54, 78, 83, 101,110, 127, 134, 212, 236, 257, 263, 265, 303,

364, 367, 419, 428, 444, 448, 455, 469,475,482,507, 535, 542, 547, 554, 616, 630 —    фосфатно-буферный 7,21, 54, 77,109, 215,229, 234, 271,294, 322, 363,358, 362, 367, 386, 448, 502, 507, 591, 620 —    формалина 86, 100, 108, 482, 60S, 537, 617 —    Хонкса 18, 70, 87? 141, 211, 240, 296, 323, 377, 387, 486, 492,    535, 589, 616 * —    хромоген-субстратный 318, 332, 338, 353, 564, 606 —    Эванса 299 —    Эдингтона 108 —    Эрла 18, 296, 589 Реакция гемагглютинации (РГА) 127, 135, 221, 270, 359, 403, 449, 459, 472, 477, 548, 597 —    гемадсорбции (РГАд) 142, 220 —    диффузионной преципитации (РДП) 4, 75,118, 145, 214, 268, 280, 376, 483, 488, 493,    500,536, 545, 552, 599 —    длительного связывания комплемента (РДСК) 113 —    иммунодиффузии (РИД) 154, 170, 276 —    иммунофлуоресценции (РИФ) 77,112,142, 212, 242, 262, 268, 298, 322, 378, 885, 516, 562, 591 —    иммуноосмофореза 84 —    иммунозлектроосмофореза (РИЭОФ) 569, 573 —    нейтрализации (PH) 69, 86, 143, 227, 241, 324, 379, 389, 393, 395, 464, 493, 497, 522, 543, 548 —    нейтрализации вирусных гемагглютининов (РНВГ) 226 —    непрямой гемагглютинации (РИГА) 83, 227, 325, 494, 501,516

---

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ

Составители:

П. И. Барышников,

В. В. Разумовская

Издание второе, исправленное

ДОПУЩЕНО

Министерством сельского хозяйства РФ в качестве учебного пособия для студентов вузов, обучающихся по направлению подготовки (специальности) ¹Ветеринария»

ДОПУЩЕНО

УМО вузов РФ по образованию в области зоотехнии и ветеринарии в качестве учебного пособия для студентов вузов, обучающихся по направлению подготовки (специальности) «Ветеринария» (Квалификация (степень) «Ветеринарный врач»)

662    Лабораторная    диагностика    вирусных    болезней    животных

ББК 48.7я73 Л 12

Л12 Лабораторная диагностика вирусных болезней животных / Сост. П. И. Барышников, В. В. Разумовская: Учебное пособие. — 2-е изд., иснр. — СПб.: Издательство «Лань», 2015.*— 672с.: ил. — (Учебники для вузов. Специальная литература).

ISBN 978-5-8114-1882-4

Учебное издание содержит действующие методические указания, наставления и инструкции по лабораторной диагностике вирусных болезней животных, утвержденные Министерством сельского хозяйства СССР, РФ и Россельхозиадзором РФ. Документы систематизированы по видам животных, в большинстве прошли многолетнюю аппробацию в Алтайской краевой ветеринарной лаборатории и включены в «Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения» (по состоянию на июль 2011 г.). Приводятся предметный указатель и библиографический список.

Предназначено для студентов, обучающихся по специальности «Ветеринария* и направлению «Ветеринарно-санитарная экспертиза», ветеринарных врачей и лаборантов ветеринарных лабораторий.

ББК 48.7я73

Рецензенты:

И. И. ГУСЛАВСКИЙ — доктор ветеринарных наук, профессор кафедры микробиологии, эпизоотологии, паразитологии и ВСЭ Алтайского государственного аграрного университета;

В. И. ПЛЕШАКОВА — доктор ветеринарных наук, профессор, зав. кафедрой ветеринарной микробиологии, вирусологии и иммунологии Омского государственного аграрного университета им. П. А. Столыпина;

В. А. СИНИЦЫН — доктор ветеринарных наук, зав. отделом ФГБУ «Новосибирская межрегиональная ветеринарная лаборатория».

Обложка © Издательство «Лань», 2015 Е. А. ВЛАСОВА © Коллектив авторов, 2016 © Издательство «Лань»,

художественное оформление, 2016

ИНФЕКЦИОННАЯ АНЕМИЯ

2.4.

ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАПОРА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОЙ АНЕМИИ ЛОШАДЕЙ В РЕАКЦИИ ДИФФУЗИОННОЙ ПРЕЦИПИТАЦИИ (РДП)

(утверждена 24 марта 2009 г.)

I. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

1.    Набор для диагностики инфекционной анемии лошадей в реакции диффузионной преципитации (РДП).

2.    Набор рассчитан на исследование 90... 120 проб сывороток крови.

Набор содержит:

Наименование препарата	Основные характеристики препарата	Содержание препарата в единице упаковки	Количество единиц фасовки в одном наборе
1. Антиген вируса ИНАН специфический прецилити-рующий (антиген)	Антиген представляет собой стерильный, лиофилизиро-ванный экстракт гомогената селезенки лошади, больной инфекционной анемией. Антиген имеет вид сухой однородной но цвету и структуре аморфной массы темно- или светло-коричневого цвета	2 см8	1 фл.
2. Сыворотка специфическая прецилити-рующая (а нтисыворотка)	Инактивированная лиофи-лизированная сыворотка лошади с хроническим течением инфекционной анемии. По внешнему виду сухая пористая масса розоватосерого цвета	2 см8	3 фл.
3. Кислота борная	Сыпучий порошок белого цвета	1,66 г	1 фл.
4. Раствор натрия гидроокиси 3%-ный	Бесцветная прозрачная жидкость	10 см5	1 фл.
б. Агар «Дифко» (BACTO-AGAR)	Сыпучий порошок светло-бежевого цвета	1,6 г	1 фл.

Лабораторная диагностика еирисных болезней животных

ншта«мншмм1ЯМИШМ1МШЯМимтшМММШ1ШИяиммм

3.    Препараты, входящие в состав набора (антиген, антисыворотка, кислота борная, раствор натрия гидроокиси, агар «Дифко») расфасованы во флаконы вместимостью 10 см⁸, укупорены пробками, укрепленными алюминиевыми колпачками.

4.    На каждый флакон с препаратами наклеена этикетка с указанием наименования препарата, его количества в объемных единицах, количества доз антигена и антисыворотки, объема растворителя, вносимого во флакон с антигеном и антисывороткой, необходимого для приготовления рабочего разведения, номера серии и срока годности.

5.    Флаконы с препаратами, входящими в состав набора, уложены в картонные коробки с разделительными перегородками. В каждую коробку вложена инструкция по применению набора.

6.    На коробке с флаконами наклеена этикетка, на которой должны быть указаны наименование предприятия-изготовителя, его товарный знак, полное наименование набора, номер серии и номер контроля, количество флаконов каждого препарата в коробке, количество препарата в объемных единицах и количество доз препарата во флаконе (для антигена и антисыворотки), дата изготовления, срок годности, условия хранения, обозначение нормативного документа и надпись «Для животных».

7.    Флаконы с препаратами без этикеток, с трещинами, нарушенной укупоркой, содержащие посторонние примеси, хлопья, с истекшим сроком годности выбраковывают и обезвреживают кипячением в течение 15 мин.

8.    Срок годности набора — 2 года с даты изготовления при хранении в сухом темном месте при температуре от 4°С до 8°С.

II. ПРИНЦИП МЕТОДА

9. Антиген (экстракт гомогената селезенки) содержит внутренний структурный белок вируса с молекулярной массой g 26. Он относится к так называемым растворимым антигенам, способным диффундировать в агаровом геле. Является общим (группоспецифическим антигеном) для всех штаммов вируса ИНАН.

10.    Принцип метода основан на встречной диффузии антител (иммунной сыворотки) и растворимого антигена в агаровом геле. При наличии в исследуемой сыворотке антител, гомологичных антигену, образуется полоса преципитации.

11.    Набор применяют для лабораторной диагностики инфекционной анемии лошадей с целью обнаружения специфических антител в сыворотках крови лошадей,-больных инфекционной анемией.

12.    Специфические антитела появляются в крови животных через 2...6 недель после инфицирования и сохраняются на протяжении длительного времени (более 7 лет).

III. ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ НАБОРА

13.    Набор применяют для исследования сывороток крови лошадей на выявление антител к вирусу инфекционной анемии при остром, хроническом и латентном течении болезни. Набор рассчитан на исследование 90... 120 проб сывороток крови.

14.    Антиген и антисыворотка, имеющиеся в наборе, используются в качестве тест-системы ♦ антиген — антитело* при постановке реакции.

16. Перед постановкой реакции сухие антиген и антисыворотку растворяют дистиллированной водой в объеме, указанном на этикетке (приготовленные разведения являются рабочими разведениями). Антиген и сыворотка должны полностью раствориться в течение 3...5 мин без образования не разбивающихся при встряхивании хлопьев.

Антиген и антисыворотку, неиспользованные в день растворения, сохраняют в замороженном состоянии при температуре -10°С до повторного исследования. Повторное замораживании сыворотки не допускается.

16. Испытуемые сыворотки в количестве не менее 5...6 см³ получают от исследуемых лошадей. Их консервируют путем добавления антибиотиков: пенициллина и стрептомицина — по 1000 ЕД/мл и хранят при температуре 4...8°С в течение Юсут. Сыворотки без консерванта сохраняют в замороженном состоянии.

17.    Для приготовления 1% геля агара «Дифко» в стеклянную колбу вместимостью 250...300 см⁸ отмеряют 140 см³ дистиллированной воды, затем в нее последовательно вносят борную кислоту и раствор гидроокиси натрия 3%. Содержимое колбы перемешивают до полного растворения борной кислоты. Проверяют pH буфера. Буфер должен иметь pH в пределах 8,6±0,1.

В приготовленный боратный буфер вносят агар «Диф-ко* — 1,5 г. Колбу ставят на баню с водой, воду доводят до кипения и выдерживают на бане до полного расплавления агара. В чашки Петри диаметром 15 см вносят 15 см⁸ расплавленного агара, предварительно охладив его до 60°С. Чашки оставляют на один час с приоткрытыми крышками и дают агару застыть.

18.    Контроль качества агара проводят визуально, после его застывания. Слой агара должен быть ровным по всей поверхности чашки, без пузырьков газа. Толщина слоя 3 мм.

После застывания агара приступают к вырезанию лунок. Для этого используют специально подготовленные пробойники из 7 жестко закрепленных трубочек диаметром 7 мм — одна в центре и б по окружности на расстоянии 3 мм от центральной и друг от друга (см. приложение, рис. 13). Агаровые пробки удаляют иглой, пинцетом или канюлей, соединенной с вакуумной установкой. Если в лунках накапливается влага, то ее перед внесением реагентов отсасывают пипеткой.

19.    Постановка реакции.

Используют 2 схемы заполнения лунок. Первая — в центральную лунку вносят микропипеткой 0,05...0,06 мл антигена, в три периферические лунки, через одну, закапывают по 0,05...0,Об мл антисыворотку в рабочих разведениях (п. 3.2). Оставшиеся 3 свободные лунки заполняют с помощью тонко оттянутой пастеровской пипетки исследуемыми сыворотками. При этом в одной чашке исследуются 12 проб сыворотки (см. приложение, рис. 14).

20.    В случае проведения массовых исследований может быть использована вторая схема заполнения лунок, которая позволяет в одной чашке одновременно исследовать 16 проб. В центральную лунку вносят антиген; в две пери-

ферические, диаметрально противоположные лунки вносят антисыворотку и в оставшиеся 4 — испытуемые сыворотки (см. приложение, рис. 15). Для каждой пробы сыворотки используют отдельную пастеровскую пипетку.

После заполнения лунок чашки Петри закрывают крышками и помещают во влажную камеру при температуре 18...25°С.

21.    Учет реакции.

Реакцию учитывают через 48...72 ч. Чашки просматривают на темном фоне в косо направленном пучке света. Для этой цели используют осветитель ОИ-19 или другой аналогичный прибор.

Оценку реакции делают по контрольной линии преципитации — линии преципитации между контрольными антигеном и антисывороткой. Если она отсутствует или слабо выражена, то исследование необходимо повторить. Контрольные линии преципитации должны быть четкими, располагаться посередине между лунками с антигеном и сывороткой.

22.    Существенный сдвиг контрольных линий преципитации в сторону антигена или сыворотки, а также слабо выраженные контрольные линии являются показателем слабой активности одного или обоих компонентов набора. В этом случае проводят подтитровку антигена и антисыворотки. Для этого сухой препарат, антиген или антисыворотку, растворяют в два раза меньшем объеме дистиллированной воды, затем готовят разведения 1:1,25; 1:1,5,1:1,75 и проверяют в РДП. За рабочее разведение принимают то разведение диагностикума, которое дает четкие линии преципитации, расположенные посередине между лунками с антигеном и антисывороткой.

23.    Оценка результатов реакции.

Отрицательная — контрольные линии продолжаются

в сторону лунки с испытуемой сывороткой без изгибов или с небольшим изгибом в сторону контрольной сыворотки (см. приложение, рис. 15, лунка 3).

Положительная:

а) между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном образуется полоса преципитации, которая соединяет-

ся с контрольной линией (см. приложение, рис. 14 и 15, лунка 1);

б)    линия преципитации отсутствует, но контрольные линии образуют вблизи с испытуемой сывороткой изгиб, направленный в сторону антигена, — слабоположительная сыворотка (см. приложение, рис. 14 и 15, лунка 2);

в)    контрольные линии укорачиваются со стороны лунки с испытуемой сывороткой, в отдельных случаях контрольные линии полностью растворяются, что свидетельствует о высоком титре антител (см. приложение, рис. 14 и 15, лунка 6).

Более различимые линии преципитации будут образовываться, если эти пробы развести 1:4 или 1:8 и повторить реакцию.

Сомнительная реакция — слабый изгиб контрольной линии плохо просматривается; образуются интенсивные неспецифические линии или ореол вокруг лунок, что затрудняет учет реакции.

От животных, давших сомнительную реакцию, через 2...3 недели берут кровь и исследование повторяют.

Пробы сыворотки, давшие при повторном исследовании отрицательный результат, считают отрицательными.

При получении повторной сомнительной реакции результат считают положительным.

Неспецифическая преципитация образуется с некоторыми пробами сыворотки, особенно полученными от старых лошадей. Признаком неспецифической реакции является перекрещивание линий преципитации с контрольными линиями (см. приложение, рис. 14 и 15, лунки 5 и 4).

В одной и той же пробе сыворотки могут быть специфические и неспецифические антитела.

24.    При образовании вокруг лунок интенсивного ореола, затрудняющего учет реакции, эти пробы сыворотки исследуют повторно, добавив к агару 5% хлористого натрия. Для этого к 150 мл боратного буфера добавляют 7,5 г химически чистого хлористого натрия.

25.    Жеребят, полученных от положительно реагирующих в реакции РДП кобыл, исследуют после отъема в возрасте 6...8 мес.

1

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ • МОСКВА • КРАСНОДАР •