ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ

ВЕТЕРИНАРНАЯ

МЕДИЦИНА

•САНКТ-ПЕТЕРБУРГ*

•МОСКВА»

•КРАСНОДАР-

•2010-

штт ни: urn    i№ii4iinirii«iUFi ттп шя ттт if    ттт

КРАТКИЙ СЛОВАРЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ВЕТЕРИНАРНЫХ ТЕРМИНОВ

Антигены (анти + греч. genes — порождающий) — чужеродные для организма высокомолекулярные органические вещества коллоидной структуры (белки, белково-липидные и белково-полисахаридные комплексы), способные при поступлении (введении парентерально) вызывать синтез особых глобулинов-антител и вступать в специфическое взаимодействие с ними.

Антитела (нити. 1 тело) — противотела — специфические белки (иммуноглобулины), образующиеся в организме под воздействием антигенов. Они накапливаются в сыворотке крови и тканях, вступают в специфическую связь с соответствующими антигенами и разрушают или обезвреживают их.

Биологическая проба (биопроба) — один из методов диагностики инфекционных болезней с помощью заражения патологическим материалом подопытных животных (куриных амбри* онов, культур клеток) и их исследования.

Бнрнон — полноценная внеклеточная вирусная частица.

Вир у с они деление    выделение возбудителей инфекции из

организма больного животного или вирусоносителя.

Виру сон оситсльствд — наличие возбудителя инфекции в определенных органах и тканях клинически здорового животного, не сопровождающееся иммунологической перестройкой организма.

Вирусы (лат. oiru* — яд) ~ облигатные внутриклеточные паразиты, отличающиеся от растительных и животных организмов малыми размерами, отсутствием клеточного строения и автономного метаболизме, наличием только одного типе куклеинивой кислоты и дизъюнктивным способом размножения.

Кроткий словарь йсполъзооакиых ссперьпарных терминов    655

MiwatimMivaiwwniMiNM ■laiiMuMUMjiai ши» к» ком ainLMMMMift.tMMi;**» ыл.л» 1«киш£.«мл»м>«1МЯ.«|1М»ш

В. безоболочечные — вирусы, в структуре которых отсутствует липопротеидкая оболочка.

В. оболочечные — вирусы, в структуре которых присутствует липопротеид пая оболочка.

Вирусоскопия (вирусы + skopeo — смотрю, наблюдаю) — метод микроскопического изучения морфологии вирусов.

Гемагглютинация (греч. Aalma — кровь + agglutinatio — склеивание) — склеивание и выпадение в осадок эритроцитов под воздействием вирусов, бактерий, токсинов идр., способных адсорбироваться на поверхности эритроцитов, а также ге-магглютининов.

Г ем адсорбция (греч. hatma— кровь + ad&orbtio -*■■ поверх-ноет к ос поглощение) — способность культур клеток, зараженных вирусами, адсорбировать эритроциты различных живот* них, что объясняется включением в плазматическую мембрану синтезирующихся вирусных белков.

Диагностика (г|»еч. diagnoxtikw — способный распознавать) — раздел клинической ветеринарии о методах исследования животных для распознавания их болезней к состояния организма с целью назначения необходимого лечения и профилактических мероприятий.

Диагностический набор — набор стандартных препаратов, используемых для постановки диагноза (антиген, специфическая и контрольная сыворотки идр.).

ДНК-эондов метод — метод генодиагностики, осиовянный ИА способности меченой однедопочечиой молекулы ДНК вэви* мг>дс!Йстповать с комплементарной ей молекулой нуклеиновой КИСЛОТЫ определенного вируса с образованием двухцепочечной структуры.

ДНК-содержащие вирусы — вирусы, имеющие один тип нуклеиновой кислоты ■*— ДНК, у большинства она представлена двухцепочечной структурой, у некоторых — одной цепью.

Идентификация (лат, tdentlflco — отождествляю) — признание тождественности, опознание-определение видовой (типовой) принадлежности микроорганизма на основании всестороннего изучения его свойств.

Иммугюфермантпий диализ — группа методов, позволяющих выявлять кома леке антиген — антитело с помощью субстрата, который расщепляется ферментом (пероксидазом, щелочной фосфатазой идр.) с появлением окрашивания.

Инактивация вирусов (лат. inactivus — неактивный) — унич* тожоние инфекционной активности вирусов путем повреждения генома физическим или химическим воздействием.

Лабораторно* диагностика вирчсньх fcMmeh мшопны*

JillbrfU И* T«ilc*|ic*ii|, 6.lUMiMM!t »ГЧ»ь«||!ММВ|Я1|11ы1 i*r    1НК    Miiffi    Hi    iiitM    :uaon«i    iivigaiiiamiiaa    tW-

Индикация возбудителя инфекции {лат. Indicatio — указание) — выявление и идентификация патогенных микроорганизмов в различных о&ьектих.

Инокуляция возбудителя (лат. tnoculatio — прививка) — введение возбудителя путем инъекции (искусственное заражение или внесение его в организм животного членистоногими переносчиками при укусах).

Консервирование вирусов (лат. conservare — сохранять) — общее название методов воздействия физическими и (или) химическими факторами на какие-либо объекты с целью длительного сохранения в них вирусов.

Контаминация (лат. соп(ат/лдНо — смешение) — обсеменение поверхности тела животного, предметов уходе, почвы, воды, кормов, биопрепаратов и других обьокто» патогенными микроорганизмами.

Культивирование вирусов — выращивание вирусов в искусственных условиях.

Культуры клеток (клеточные культуры) — клетки многоклеточною организма, живущие вне его в искусственно созданных условиях среды.

Куриным эмбрион — оплодотворенное куриное яйцо, в ыдер-жвнное и инкубаторе.

Лабораторные животные — животные, используемые в лабораториях при проведении исследований (мыши, крысы, кролики, морские свинки, хомяки, голуби идр.).

Лнофилизация (греч. 1уо — растворяю + рШео — люблю) --высушивание предварительно замороженного материала в глубоком паку уме.

Моноклональные антитела — строго специфические антитела, способные выявить минимальные различия в химическом составе и пространственной конфигурации молекул, являются продуктом отдельных клоков епггитслопродуцнрую-щих клеток.

Парные сыворотки — сыворотки, взятые в саком начале заболевания и 2...S недели спустя. Повышение титра антител в 4 риза и более считается основой положительной реакции.

Пассаж (фр, postage — переход) — последовательное заражение восприимчивых объектов (животные, куриные эмбрионы, культуры клеток) микроорганизмами.

Полимеразная цепная реакция (от англ. Polymerase Chain Reaction, ПЦР) — метод генодиогиостцки, основанный на многократном увеличении копий строго определенных фрагментов

молекулы ДНК вируса при помощи фермента тер нестабильной ДНК-полимеразы.

Реакция гем агглютинации (РГА) — метид обнаружения и идентификации вирусов* осаоаинкый на способности многих вирусов, обладающих ткаиопым тропизмом, агглютинировать эритроциты определенных видов животных.

Реакция иммувофлуоресцеиции (РИФ) (лат. fluore&cens — светящийся) — серологическая реакция, основанная на взаимодействии антиген — антитело, при атом один из компонентов, участвующий в реакции, связан с флуоресцирующим красителем.

Реакция нейтрализации (PH) — метод идентификации ви-руса, основанный на феномене потери им инфекционное™ в результате взаимодействия со специфическими антителами.

Реакция связывания компемента (РСК) — метод серологического исследования, основанный на способности образующегося комплекса антиген — антитело связывать комплемент, что выявляется по отсутствию гемолиза при добавлении гемалиэи* на и эритроцитов.

Реакция торможения гемагтл юти нации (РТГА) — метод идентификации вируса или выявления противовирусных антител в сыворотке крови, основанный на феномене отсутствия агглютинации эритроцитов вирусом, в присутствии специфических к нему антител.

РНК-содержащие вирусы -•• • вирусы, имеющие один тип нуклеиновой кислоты — РНК, у большинства она представлена одной цепью, у некоторых — двухцепочечной структурой.

Серовариант — самостоятельная группа внутри определенного вида к серогруппы (серотипа) микроорганизмов, обусловленная наличием антигенов, отличающихся от антигенов других микроорганизмов этого вида и серогруппы (серотипа), что выявляется с помощью серологических реакций.

Серогрупла (серотип) — самостоятельная группа внутри определенного вида микроорганизмов, обусловленная наличием антигенов, отличающихся от антигенов других микроорганизмов этого вида, что выявляется с помощью серологических реакций.

Серологические реакции — реакции, широко используемые при постановке диагноза инфекционных болезней, методы обнаружения антител и антигенов в крови и других тканях.

Сыворотка крови (лат. serum — сыворотка + sanguis — кровь) — составная часть крови, представляющая собой плазму, из которой удалены форменные элементы и фибрин в процессе свертывания кропи.

058    ЛаСсрспсркал    диагностика вирусных болезней жилетных

■ШИШ hihhwhw    ими *iW«anu»n«»«Hw наимсниш——м——лт•*

Тельца включения — своеобразные морфологические обра-золения, обнаруживаемые в цитоплазме иля ядрах клеток определенных тканей при некоторых вирусных инфекциях и состоящие из скопления вирионов к вирусных белков.

Термолабильность (греч. thermos — теплый -I- лат. labitis — нестойкий) неустойчивый к тепловому воздействию, изме-лякицийсл при нагревании.

Термостабнльность (греч. thermos — теплый + лат. stabiUs —-неизменный) — сохраняющий свои свойства при нагревании.

Титр вируса — концентрация инфекционных единиц вируса в определенном объеме материала.

Цитопатогенное действие вирусов (ЦПД, цитопатический аффект) — специфическая морфологическая деструкция (разрушение) и функциональная патология зараженных вирусами клеток в культурах.

Штамм (нем. etamm — род, корень) — культура микроорганизмов одного вида с одинаковыми морфологическими и биологическими свойствами.

Элементарные тельца — см. Вярион (2, $).

ШИШ! ЮШ'ИШ *vpfei»4T^

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ

СПИСОК

1.    Лабораторные исследования в ветеринарии. Вирусные, риккетсиозные и иарааитирнме болезни : справочник / пед рея-Б. И. Антонова. — М. ; Агропромнздат, 1967. — 240 с,

2.    Бакрлзе, II. А. Эпнзоотологический словарь -справочник / И, А. Бакулев, Г. Г. Юрков, В. А. Ведерников {и др,]. — М.: Росселъхоэнздат, 19bt>,

3.    Нымм.Э.М. Словарь ветеринарных микробиологических и вирусологических терминов / 0. М. Нымм, К, А. Петерсон, Э. А. Аавср [и др.1. — М.: Росагропромиздат, 1989.

ПРЕДМЕТНЫЙ

УКАЗАТЕЛЬ

Агар мясо-пептонный (МПА) 101,109, 126, .326, 387, 444, 466, 476, 483, 542, 588 Альбумин бычий 7, 226, 618 Аппарат Киппа 126, 480 Бульон мясо-пептопный (МПБ) 76.101, 109,128, 326, 444, 466, 476, 483, 496, 542. 588 —    триптозо-фосфатный 519 Буфер вероналовий 86, 375 —    Сорвтный 148 —    фосфатно-солевой 174, 315, 328, 561, 604 —    калий-фосфаткый 231, 236, 407 —    карбонатно-бнкарбонатный 335.561.604, 618 Гемолизин 25, 114, 300, 369,607 Гемолитический система (геменстема) 25, 116, 216 Жидкость Руге 106, 446 —    Карнуа / 06 Иммуноасцитическвя жидкость (ИАЖ) 84 Комплемент 27, 116, 216, 300, 370, 507

Метод вирусоскопии 99,443, 548 —    Кербера 66 —    иммуьоферментногс анализа (ИФА) 88, 159, 173, 228, 233, 244, 314, 328, 336, 349, 406, 409, 436, 561, 603, 809, 617 —    кофал-геста 514 —    перекрестного иммунитета 64 —    полимеразной цепной реакции (ПЦР) 180, 253. 307, 342, 416, 425, 625 —    Рида и Менча 66, 242, 297, 324, 380, 394, 600, 528, 552, 566 —    электронной микроскопии 327, 593 Окраска гнстопрепаратов по Ленцу 80 —    Турбиной 584 —    Туревичу 81,684 —    мазков по Борману — Гайнуллиной 74 —    Минину 74 —- Морозову 100, 446 —    Муромцеву 73 —    Пашену 100, 447 —    Селлерсу 74 Перевиваемая линия почки свиньи (СГТЭВ) 70, 386, 392

---

—    культура клеток ВНК-2/ 18,110 —    культура клеток почки поросенка (РК-15) 289, 892 Периично-трипспнмэиропяп-ная культура клеток почки свиньи (ППф 70, 141, 386 —    почки эмбриона коров (ПЭК) 141, 218, 239 —    селезенки эмбриона коров (СЭК) 218 —    легкие эмбриона коров (ЛЭК) 218 —    тестикулов бычка (ТБ) 218, 239 —    почка ягненка 110 Раствор 30-50%-копе стерильного глицерине 21, 72,100, 108, 386, 482, 588, 616 —    азида натрия 600 —    азотнокислого серебра 106, 446 —    Альсевера 55, 271, 361 —    бис-дипзобенэидпка 55 —    борно-боратный буферный 576 ~ бромистого эгидня 180, 253. S06, 342, 416, 626 ~ версенв / 7, 69, 286 —    гекенметафосфата натрия 216 —    эябуференый физиологический (ЗФР) 7, 298, 325, 353, 386, 39», 663, .596 —    лимоннокислого натрия 127,135, 402, 448, 468, 469, 476,535 —    мединал-вероналовый 83, 669 —    ыертиолята 376, 600 —    натрия хлористого 7, 171, 215, 269, 276, 287, 352, 376, 392, 571,611 —    трипсина 18, 69, 295 —    физиологический 21, 84, 78, 83, 101, ПО, 127, 134, 212, 236, 257, 263, 266, 303,

364, 367, 419, 428.444, 448, 456, 469, 475, 482, 597, 535, 542,547, 554,616,630 —    фосфатно-буферный 7,21, 54, 77, 109,215, 229,234, 271,294,322, 363, S5S, 362, 367, 386, 448, 502, 607, 591,620 —    формалине 86, 100, 108, 482,503. 637,617 —    Хоккее 18, 70. 87141, 211, 240, 296, 323. 377, S87, 486, 492,536,589, 616'" —    хромоген-субстратный 318, 332, 338, 363, 564, 606 —    Овенса 299 —    Эдингтона 108 —    Эрла 18, 296, 589 Реакция гемвгглгстинвции (ГГЛ) 127, 135, 221, 270, 369, 403.449,450,472,477, 543, 697 —    гемадсорбции (РГАд) 142, 220 —    диффузионной преципитации (РДП) 4, 75,118, 145, 214, 268, 280, 376, 483, 488, 493, 500.636, 545, 552. 599 —    длительного связывания комплемента (РДСК) 113 —    кмкунодиффузяи (РИД) 154, 170,276 —    иммуиофлуоресценции (РИФ) 77, 112, 142,212, 242, 262, 268, 293, 322. 378, 386, 516, 552. 591 —    иммуноосмофореяа 84 —    иммулоэлсктроосмофореэа (РИЭОФ) 569, 579 —    нейтрализации (РТ1) 69, 86, 143. 227, 241, S24, 379, 389, S93, 395, 464, 493, 457, 622, 549, 548 —    нейтрализации вирусных гокагтлютякивоь (РНВГ) 226 —    непрямой гемагглютинеции (РИГА) 83, 227, 325, 494, 501, 516

---

662    Лаборап-лрмих    диагностика    вирусных    Романеи    животных

1М» ЫВЧиИ * "I Nnit/llll Jll l*«al1MDHM|:M Ч>ра4|:]1Ч11«и«1 W«|hMi :игк-«в »|«' ui'llMi    ■<    1Ч11Щ1Мв11*||Р

СОДЕРЖАНИЕ

1. Болезни, общие для веек

или нескольких видов животных...................5

Ящур.......... 5

количественному определению антител к вирусу ящура в сыворотке крови животных (утверждены 10 февраля 1983 г., № 115-6а)............Б

1.2.    Методические указания по выделению и идентификации штаммов вируса ящура (одобрены и рекомендованы

15 октября 1973 г., б/н)................20

Бешенство...................... 72

1.3.    Методические указания

по лабораторной диагностике бешенства

(утверждены 27 феврали 1970 г., б/н).....72

Болезнь Ауески........................ 82

1.4.    Методические указания по лабораторной

диагностике болезни Ауески животных (рекомендованы 18 мая 1978 г.,б/'н)......82

1.5.    Инструкция по применению набора для определения антител к г липопротеину jfl

свиней методом конкурентного иммуноферментного анализа

♦ZETECT-Серелиза-АУВСКИ-Ат»........88

Оспа.........................................98

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ

Составители:

П. И. Барышников,

В. В, Разумовская

Издание второе, исправленное

допущено

Министерстве* с'ельскоес хозяйстоа РФ в каяесщле учебного пособил djm студснгпов ауэов. обучающихся по направлению подготовки (спе^иьльлоспиО «ЯетериксДОк*

ДОПУЩЕНО

УМО eyctca РФ по образованию в области эсотехпии и ветеринарии о качбсбьве учебною пособим для студентаа аулов, обучающихся по уапршлемию подло тс* к и (спсциалььос/чи) r>Bnm*p и мшил» (нсолифокациА (степень) «Ветеринарный лрачь)

•САНКТ-ПЕТЕРБУРГ* МОСКВА»КРАСНОДАР •

C64    Лсборапорнал    диагкостина    висусмых    вгллх(й    животнш;

iMirtniNiiri .1 wcinaiiin nwwi«llMMNNmHMM*MniWM «iixfcMmi ншппип u« «•«ии*»

Катаральная лихорадка крупного

рогатого скота. Овец и коз.................... 107

1.7. Методические указания по лабораторной диагностике катаральной лихорадки крупного рогатого скота, овец и коз (утверждены 11 июня 1986 г., № 432-0) .. 107

2. Болезни лошадей..............................123

Грипп.......................................123

Рмпоннесмония............ 140

2.3.    Методические указания

по лабораторной диагностике рикопневмонии лошадей

(утверждены 27 августа 1980 г., б/н).....140

Инфекционная анемия .........................146

2.4.    Инструкция по применению набора для диагностики инфекционной

преципитации (РДП)

(утверждена 24 марта 2009 г.)....... 145

3. Болоаки    крупного рогатого скота.................153

Лейкоз......................................153

3.1.    Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота (утверждены 23 июля 2000 г.,

№13-7-2/2130)......................153

3.2.    Инструкция по применению набора

ББК 48.7я73 Л 12

Л 12 Лабораторная диагностика вирусных болезней животных / Сост. П. И. Барышников, Б* В. Разумовская: Учебное пособие. — 2-е изд.» испр. — СПб.: Издательство *Лань», 2015*— 672с,: ил. — (Учебники для вузов. Специальная литература).

ISBN 078-5-8114-1882-4

Учебное издание содержит действующие методические указания, наставления и инструкции по лабораторной диатостико вирусных болезней животных, утвержденные Министерством сельского хозяйства СССР, РФ и Россельхознедаорок РФ- Документы систематизированы по видам животных, в большинстве прошли многолетнюю атшробацию в Алтайской краевой ве-горикарной лаборатории и иключепы я «Перечень нормативной докумантации, разрешенной для использования D государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел* а также контрола безопасности сырья животного и растительного происхождения * (по состоянию ня июль 2011 г.). Приводятся пред* меткий указатель и библиографический список.

Предназначено для студентов, обучающихся по специальности «Ветеринария* и направлению •Ветеринарио-ганитарная экспертиза «_к ветеринарных врачей и лаборантов ветеринарных лабораторий.

ББК 4Ь.7я73

Рсшецпситы:

И. И. ГУСЛлВСКИЙ — доктор ветеринарных наук, профессор кафедры микробиологии, эпизоотологии, паразитологии и НСЭ Алтайского государственного аграрного университета;

В. И. ПЛЕШАКОВА — доктор ветеринарных паук, профессор, зав, кафедрой ветеринарной микробиологии, вирусологии к иммунологии Омского государственного аграрною университета нм. П, Л. Столыпина;

В. А СИНИЦЫН — доктор ветеринарных наук, зав. отделом ФГБУ «Новосибирская межрегиональная ветеринарная лаборатория».

Обложил <S> Издательство ♦Линь*, 2015 Е. А. ВЛАСОВА © Коллектив авторив, 2016 © Издательство «Лань*,

художественное оформление, 2015

288    ЛаборилюрийА    диагностика    оииусных    билезнви    лшосдекиг

vr -***ч«| «р|к'1.1>кяг |ъм'.(1-11'.ьм№^пЦ|^№_|1имп4л\лг иао*мн«мг    ним^ви

ИНФЕКЦИОННЫЙ ЮШОТРАХЕИТ

3 8

МЕТОДИКА ИО ИССЛЕДОВАНИЮ СПЕРМЫ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА НА КОНТАМИНАЦИЮ ВИРУСОМ ИНФЕКЦИОННОГО РИЯОТРАХЕИТА — ПУСТУЛЕЗНОГО ВУДЫЮВАГИНИТА (ИРТ-ШТВ)

(утверждена 8 феврали 1983 г., б/н)

ИРТ-ИПВ — остро протекающая ковтагиозная болезнь, характеризующаяся катарально-некротическими поражениями органов дыхания, лихорадкой, общим угнетением и коньюктивитом, а также развитием пустулезного вульво-вягинита и появлением абортов у коров, а также баланопа-ститами у быкои.

Возбудителем болезни является ДНК-содержвщий вирус из группы герпесвирусов. Вирус культивируется в культуре лервичяо-трипсяниаиро ванных и перевиваемых клеток почек и семенников телят, не обладает гемадсорбирую-щими и гемагглютинирующими свойствами, чувствителен к эфиру, хлороформу, инактивируется при 66°С в течение 20 мин, при 37°С — через 4...10 дней, быстро теряет активность в кислой среде, но длительно сохраняется при pH 6...9 и температуре 40°С или в замороженном состоянии.

Метод обнаружения вирусных контаминантов в сперме основан на выделении вируса в культуре клеток и идентификации его в реакции нейтрализации или методом флуоресцирующих антител.

Исследованию подлежит неразбавленная сперма, а также сперма, разбавленная и сохраненная при 2,„5°С или в замороженном виде при температуре -190°С.

Выделение вируса проводят путем заражения первнчно-грипсинизи решенной культуры клеток почек эмбрионов коровы (ПЭК) или гестикул бычков (ТБ).

Для проведения исследований применяют следующее оборудование и реактивы:

■    автоклав;

Ш центрифуга на Ь тыс. об/мин;

■    шкаф сушильный;

М термостат;

■    магнитная мешалка;

■    микроскоп бпологический;

■    микроскоп люминесцентный;

■    ножницы;

■    пипетки мерные 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 мл;

■    колбы мерные;

■    чашки бактериологические ГОСТ 10515-63;

■    пробки резиновые № 12, 14, 24;

■    фильтры марлевые;

■    раствор Хенкса pH 7,2...7,4;

■    0,5% раствор гидролизата лактальбумипа;

ш сыворотку крупного рогатого скота;

■    специфическую сыворотку против вируса ИРГ' и отрицательную сыворотку;

■    флуоресцирующую сыворотку против вируса ИРТ;

■    масло нефлуоресцирующее;

■    антибиотики: пенициллин натриевая соль, стрептомицин хлоркальциевый комплекс, полимиксин, сульфат М, микостатин (нистатин);

■    спирт этиловый-ректификат ГОСТ 5962-67,

ПОДГОТОВКА К ИССЛЕДОВАНИЮ Подготовка к исследованию спермы. Неразбавленную сперму перед инокуляцией в культуру клеток разводят 1:10 раствором Хенкса, содержащем ленициллип, стрептомицин 750..Л 000 мкг/мл, полимиксин — по 750,.. 1000 ЕД/мл и микостатин (нистатин) — 50 ЕД/мл. Сохраненную (оамо-

Лабораторно* диагностика пирмлш: баланса животных щшы»»ляшлшппиткыттлтттытстштят9сщгтытыттлтт1вст1тш1шшшшй тттюттт

роженно-оттаяпную) спорму разводят с учетом разбавления, сделанного перед замораживанием, и доводят разведение до 1:10. Если исследованию подвергается сперма, разбавленная 1:10 или более, то к такой сперме, если она не санирована, добавляют только антибиотики в указанной концентрации. Подготовленную сперму замораживают два-три раза при -15...-40°С и оттаивают при комнатной температуре.

Приготовление культур клеток. Культуру клеток ПЭК или ТБ готовят по методике, изложенной в ♦Методических указаниях по приготовлению первично-трипсинизнрован-пых культур клеток крупного рогатого скота», рекомендованных ГУВ МСХ СССР в 1976 г. Клетки культивируют в среде, состоящей из 0,5% гидролизата лактальбумина в растворе Хенкса, 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков: пенициллина — 100 ЕД/мл, стрептомицина — 100 мкг/мл, микостаткна (нистатина) — 20 ЕД/мл. В качестве поддерживающей среды используют 0,5%-ный гидролизат лактальбумина без сыворотки.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выделение вируса. Для выделения вируса используют

3.. .4-суточную культуру клеток ПЭК или ТБ. Каждой серией спермы (партией) заражают нс менее 4 пробирок или один 100 мл матрац с культурой клеток. Серии спермы от одного быка, полученные в течение трех месяцев, смешивают и исследуют как одну пробу.

Клетки перед инокуляцией материала дважды отмывают раствором Хенкса или питательной средой, после чего в каждую пробирку вносят 0,1...0,2 мл подготовленной спермы. Матрацы заражают по 1,0...2,0 мл. Адсорбируют а течение 30 мин при 37°С или одного часа при комнатной температуре. Затем инокулят удаляют, а монослой отмывают два раза раствором Хенкса или питательной средой. В пробирки добавляют по 1,0 мл, а в матрацы по 10„.12мл под-держипающей среды и культивируют при 37°С в течение

5.. .7 дней.

Для контроля оставляют не менее б пробирок с неояра-жеяной культурой клеток. Зараженные и контрольн ые про-

& Лмыли крупное pc/iimcto скота    241

тимы>|>ш1ц№|11*|1г'-р»м»аи»чу|10Ц|»|1Ч1Ицц»иимимц|>ошии11амЁ|Щ₁|.1<и||»|и1ци«ц.ли1ч^»м

бирки ежедневно смотрят под микроскопом (об. 8,10 хок. 7} на наличие цитопатических изменении (ЦПД). Через 5...7 дней проводят второй пассаж исследуемого материала. Для этого культуру инфицированных клеток замораживает при -15...-40Х и оттаивают при комнатной температуре. Суспензию тщательио перемешивают и вносит по 0,1...0,2 кл в пробирки с монослоем клеток. Через 5...7 дней учитывают результаты заражения и при отсутствии ЦПД проводят третий пассаж. При отсутствии цитопатичоских изменений я четырех пассажах сперму считают свободной от ниру-са ИРТ-ИПВ. При наличии цитопят»четких изменений в первом пассаже для исключения цитотоксического действия спермы проводят второй пассаж, Цитопьтический агент второго или последующего пассажей идентифицируют в реакции нейтрализации (PH) или методом флуоресцирующих антител (МФА).

Идентификация вируса в реакции нейтрализации (PH).

Реакцию ставят в культуре клоток ПЭК или ТБ со специфической и отрицательной сыворотками. Сыворотки каждую г отдельности прогревают при 56°С о течение 30 кии* разводят средой 1:10 и разливают по 1,0 мл в 7 стерильных пробирок. Затем готовят десятикратные разведения вируса на питательной среде в объеме 5 мл, начиная с 10"¹ до 10~⁷ и по 1,0 мл каждого разведения вносят в пробирки с сыворотками, встряхивают к инкубируют в течение часа при температуре 37°С и используют для заражения культуры клеток. Каждой смесью заражают по 0,2 мл 4 пробирки с культурой клеток. Через 30.„40 мин инкубирования в пробирки добавляют по 0,8 мл питательной среды. Параллельно готовят контроль специфической и отрицательной сывороток на токсичность. Для этого сыворотки (каждую в отдельности) э разведенки 1:10 смешивают с равным объемом питательной среда и вносят по „О, 2 мл а 4 пробирки с культурой клеток. Для контроля культуры клеток 4 пробирки оставляют незярвженными. В них ростовая среда меняется на поддерживающую.

Опытные и контрольные пробирки инкубируют в течение 7 сут, проводя микроскопию со 2-го дня. Учет реакции

242    Лабораторно* дыимослюхо вирусных вОАсзмек живог.нш

шияииммив м |лп«||1й whiimi пек»,*c,,i"ur mihwiuciie nii4r4iiBi..iir<w «mmai а, ЯЯШ.Ш

проводят при условии отсутствия цитопвтических изменений в контрольных пробирках.

Реакцию учитывают по индексу нейтрализации (ИН), ИН — это отношение титра вируса в смеси с отрицательной сыворсткой к титру вируса в смеси со специфической сывороткой. Его рассчитывают по формуле

титр вируса в смеси с отрицательной сывороткой титр вируса в смеси со специфической сывороткой’

Титр вируса определяют методом Рида и Менче по формуле    _сл    -J

_л o-50-d А = — т—» а-о

где А — показатель логарифма дозы, поражающей более 50% пробирок; а — процент эффекта дозы, поражающей более 50% орсбирок; * — процент эффекта дозы, поражающей менее 50% пробирок; d — разность показателей логарифмов доз, поражающих менее и более 50% пробирок.

Положитслышм считают индекс нейтрализации, ровный 2 и более десятичным логарифмам (Jg 2). Вирус ИРТ-ИПВ считают идентифицированным, если он нейтрализуется специфической сывороткой с положительным индексом.

Идентификация вируса методом флуоресцирующих антител основана на обнаружении вирусного антигена в культуре клеток, обработанных флуоресцирующим иммуноглобулином. Для этого культуру клеток выращивают в пробирках на полосках покровных стекол или слюдинках и заражают вирусом. Через 24 ч инкубации стекла извлекают, дважды промывают фосфатным буфером и подсушивают на воздухе. Затем фиксируют 10...12 мин в ацетоне и пссле повторного подсушивания препараты хранят при-20°С или окрашивают флуоресцирующей сывороткой.

Препараты обрабатывают флуоресцирующей сывороткой в рабочем разведении в течение 30 мин во влажной камере (чашка Петри с увлажненной фильтровальной бумагой) при температуре 37°С, затем двукратно промывают фосфатным буфером pH 7,2...7,4 и споласкивают дистиллированной водой. На высушенный препарат наносят каплю смеси, состоящей из 9 частей глицерина и 1 части фос-

минрини w»im— I иищвщ'тищини mnwapivwinwnmi «и* г

фатного буфера pH 7,2...7,4, покрывают покровным стеклом и просматривают в фиолетово-синем свете при использовании иммерсионного объектива. На ранней стадии инфицирования клеток специфический антиген выявляется б перинуклеарной зоне, а позднее в ядре и в цитоплазме инфицированных клеток. Специфичность флуоресценции контролируют следующим образом: обрабатывают флуоресцирующей сывороткой клетки, неаараженные вирусом; окрашивают специфической флуоресцирующей сывороткой инфицированные клетки, предварительно обработанные специфической немаркированной сывороткой.

Положительной считается реакция, при которой отмечают специфическую флуоресценцию в зараженной культуре клеток, при отсутствии флуоресценции в контрольных препаратах.

D случае отрицательных результатов исследования в реакциях нейтрализации и иммукофлуоресцекции со специфической к флуоресцирующей сыворотками против вируса ИРТ-ИПВ цптоаатическнй агент исследуют сыворотками против вирусов парагриппа-3, диареи и аденовирусов. Идентификацию изолята проводят методами, изложенными в «Методических указаниях по лабораторной диагностике вирусных респираторно-кищечных инфекций крупного рогатого скота*, утвержденных ГУВ МСХ СССР 25.07.1978.

При обнаружении в сперме вируса ИРТ-ИПВ сперму бракуют.

Методические указания подготовлены Всесоюзным государственным научно-контрольным институтом ветпрепа-ратов МСХ СССР.

Зав. лабораторией контроля и стандартизации препаратов, применяемых при искусственном осеменении с/х животных, Н. Г. Балашов;

Зав. лабораторией контроля и стандартизации препаратов против оспенных и респираторных инфекций, доцент В. В. Гуненков;

Ст. научный сотрудник, кандидат биологических наук Н. В. Изотова;

Младший научный сотрудник Г. Э. Фарботко.