ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ

b

• САНКТ-ПЕТЕРБУРГ • • МОСКВА •КРАСНОДАР-•2015*

ПРИЛОЖЕНИЕ к Методическим указаниям по выявлению парамиксовирусов, их идентификации и выявлению специфических антител при парамиксовирусной инфекции птиц (справка).

К парамиксовирусной инфекции восприимчивы все виды домашних, синантролных и диких птиц. Основным источником возбудителя являются больные птицы с клинически выраженными симптомами болезни или скрытые вирусо-н ос и те л и без проявлений заболевания.

Симптомы заболевание самые разнообразные и зависят от патогенных свойств вируса и других факторов. Они могут быть от самых легких и непродолжительных поражений респираторных органов и желудочно-кишечного тракта до тяжелых проявлений заболевания и 100% гибели птицы: отказ от корма, угнетение, затрудненное дыхание, воспаление воздухоносных мешков, синуситы, конъюнктивиты, диарея, нарушение координации движений, парезы, пара* лкчи. Любой из этих признаков может встречаться отдельно или в сочетании с другими. У клинически здоровых или больных может снижаться яйценоскость до 60...60%. Течение болезни может усугубляться другими заразными болезнями, нарушениями в кормлении и содержании птицы.

Вирусоносительство продолжается в течение месяца. По эпизоотологнческим, клиническим и патологоанатомическим данным парамиксовирусная инфекция сходна с другими инфекционными заболеваниями птиц.

ИШК1ШП<1>>1'1Е|1иП1ГМН11111:1ШШ1МГ111!|11*и№11№11ЛВ11«11Н^

КРАТКИЙ СЛОВАРЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ВЕТЕРИНАРНЫХ ТЕРМИНОВ

Антигены (анти + грсч. genes — порождающий) — чужеродные для организма высокомолекулярные органические вещества коллоидной структуры (белки, бел ково* липидные и белново-полисахаридные комплексы), способные при поступлении (введении парентерально) вызывать синтез особых глобулинов-антител и вступать в специфическое взаимодействие с ними.

Антитела (анти. + тело) — противотела — специфические болки (иммуноглобулины), образующиеся в организме под воздействием антигенов. Они накапливаются в сыворотке крови и тканях, вступают в специфическую связь с соответствующими антигенами и разрушают или обезвреживают их.

Биологическая проба (биопроба) — один из методов диагностики инфекционных болезней с помощью заражения патологическим материалом подопытных животных (куриных эмбрионов, культур клеток) и их исследования.

Внрион — полноценная внеклеточная вирусная частица.

Вирусовыделение — выделение возбудителей инфекции из организма больного животного или вирусоносители.

Вирусоноситсльство — наличке возбудителя инфекции в определенных органах и тканях клинически здорового животного, не сопровождающееся иммунологической перестройкой организма.

Вирусы (лат. virus — яд) — облигатные внутриклеточные паразиты, отличающиеся от растительных и животных организмов малыми размерами, отсутствием клеточного строения и автономного метаболизма, наличием только одного типа нуклеиновой кислоты и дезъюнктивным способом размножения.

Кроткий слооарь исылъхосиошх ветеринарных терминов    665

хмчлчч    «*№■ шаям ■ иммг ап» мтлм-    д».на«ик>4>«

В. беэоболочечныс — вирусы, в структуре которых отсутствует липопротеидная оболочка.

В. оболочечные — вирусы, в структуре которых присутствует липопротеидная оболочка.

Вирусоскопия (вирусы + вкорео — смотрю, наблюдаю) — метод микроскопического изучения морфологии вирусов.

Гемагглютннация (греч. hatma— кровь 4 agglutination склеивание) — склеивание и выпадение в осадок эритроцитов под воздействием вирусов, бактерий, токсинов идр., способных адсорбироваться на поверхности эритроцитов, а также ге-^агглютининов.

Гемадсорбцня (греч. haima — кровь + adscrbtto — поверхностное поглощение) — способность культур клеток, оаражси-ных вирусами, адсорбировать эритроциты различных животных, что объясняется включением в плазматическую мембрану синтезирующихся вирусных белков.

Диагностика (греч. diagnostikos — способный распознавать) — раздел клинической ветеринарии о методах исследования животных для распознавания их болезней и состояния организма с целью назначения необходимого лечения и профилактических мероприятий.

Диагностический набор — набор стандартных препаратов, используемых для постановки диагноза (антиген, специфическая и контрольная сыворотки и др.).

ДНК-зондов метод — метод генодиагностики, основанный па способности меченой одноцепочечной молекулы ДНК взаимодействовать с комплементарной ей молекулой нуклеиновой кислоты определенного вируса с образованием двухцепочечной структуры.

ДНК-содержащхе вирусы — вирусы, имеющие один тип нуклеиновой кислоты — ДНК, у большинство она представлена двухцепочечной структурой, у некоторых — одной цепью.

Идентификация (лат. identtflco — отождествляю) — приона-кие тождественности, опознание-определение видовой (типовой) принадлежности микроорганизма на основании всестороннего изучения его свойств.

Иммуиоферментный анализ — группа методов, позволяющих выявлять комплекс антиген — антитело с помощью субстрата, который расщепляется ферментом (пероксидазой, щелочной фосфатазой идр.) с появлением окрашивания.

Инактивация вирусов (лат. inactivuа — неактивный) — уничтожение инфекционной активности вирусов путем повреждения генома физическим или химическим воздействием.

Индикация возбудителя инфекции (лат. indicatio — указание) — выявление и идентификация патогенных микроорганизмов в различных объектах.

Инокуляции возбудителя (лат. tncculatic — прививка) — введение возбудителя путем инъекции (искусственное заражение или внесение его в организм животного членистоногими переносчиками при укусах).

Консервирование вирусов (лат. conservare -- сохранять) — общее название методов воздействия физическими к (или) химическими факторами на какие-либо объекты с целью длительного сохранения в них вирусов.

Контаминация (лат. contaminotlo — смешение) — обсеменение поверхности тела животного, предметов ухода, почвы, воды, кормов, биопрепаратов и других объектов патогенными микроорганизмами.

Культивирование вирусов — выращивание вирусов а искусственных условиях.

Культуры клеток (клеточные культуры) — клетки многоклеточного организма, живущие вне ого в искусственно созданных условиях среды.

Куриный эмбрион — оплодотворенное куриное яйцо, выдержанное в инкубаторе.

Лабораторные животные — животные, используемые в лабораториях при проведении исследований (мыши, крысы, кролики, морские свинки, хомяки, голуби и др.).

Лиофидизация (греч. 1уо — растворяю + philec — люблю) — высушивание предварительно замороженного материала в глубоком вакууме.

Моноклональные антитела — строго специфические антитела, способные выявить минимальные различия в химическом составе и пространственной конфигурации молекул, являются продуктом отдельных клонов антителопродуцирующих клеток.

Парные сыворотки — сыворотки, взятые в самом начале заболевания и 2...3 недоли спустя. Повышение титра антител в 4 раза и более считается основой положительной реакции.

Пассаж (фр. passage — переход) — последовательное заражение восприимчивых объектов (животные, куриные эмбрионы, культуры клеток) микроорганизмами.

Полимеразная цепная реакция (от англ. Polymerase Chain Reaction, ПЦР) — метод генодиагностики, основанный на многократном увеличении копий строго определенных фрагментов

Hpair.KLu словарь иепалиоеанних ветеринарных терминов

>ш о nw ятштт————————— ———

молекулы ДНК вируса при помощи фермента термостабильной ДНК-иолимеряэы.

Реакция гем агглютинации (РГА) — метод обнаружения и идентификации вирусов, основанный на способности многих вирусов, обладающих ткйневым тропизмом, агглютинировать эритроциты определенных нидов животных.

Реакция нммунофлуоросценции (РИФ) (лат. fluoreacena -светящийся) — серологическая реакция, основанная на взаимодействии антиген — антитело, при этом один из компокен* тов, участвующий в реакции, связан с флуоресцирующим красителем.

Реакция нейтрализации (PH) — метод идентификации вируса, основанный на феномене потери нм ннфекционыости в результате взаимодействии со специфическими антителами.

Реакция связывания компемента (РСК) — метод серологического исследования, основанный на способности образующегося комплекса антиген — антитело связывать комплемент, что выявляется по отсутствию гемолиза при добавлении гемолизина и эритроцитов.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) — метод идентификации вируса или выявления противовирусных антител в сыворотке крови, основанный на феномене отсутствия агглютинации эритроцитов вирусом, в присутствии специфических к нему антител.

РНК-содоржащне вирусы — вирусы, имеющие один тип нуклеиновой кислоты — РНК, у большинства она представлена одной цепью, у некоторых — двухцепочечяой структурой.

Ссроварнант — самостоятельная группа внутри определенного вида и ссрогруппы (серотипа) микроорганизмов, обусловленная наличием антигенов, отличающихся от антигенов других микроорганизмов этого вида и ссрогруппы (серотипа), что выявляется с помощью серологических реакций.

Серогруппа (серотип) — самостоятельная группа внутри определенного вида микроорганизмов, обусловленная наличием антигенов, отличающихся от антигенов других микроорганизмов этого вида, что выявляется с помощью серологических реакций.

Серологические реакции — реакции, широко используемые при постановке диагноза инфекционных болезней, методы обнаружения антител и антигенов в крови и других тканях.

Сыворотка крови (лат. ее гит — сыворотка + sanguis — кровь) — составная часть кропи, представляющая собой плазму, из которой удалены форменные элементы и фибрин в процессе свертывания крови.

Тельца включения — своеобразные морфологические образования, обнаруживаемые в цитоплазме или ядрах клеток определенных тканей при некоторых вирусных инфекциях н состоящие из скопления вирионов и вирусных белков.

Термолабильыость (греч. thermos — теплый + лат. labilis — нестойкий) — неустойчивый к тепловому воздействию, изменяющийся при нагревании.

Термостабильность (греч. thermos — теплый + лат. stabШ$ — неизменный) — сохраняющий свои свойства при нагревании.

Титр вируса — концентрация инфекционных единиц вируса в определенном обт-еме материала.

Цнтопатогенное действие вирусов (ЦПД, цитопатический аффект) — специфическая морфологическая деструкция (разрушение) и функциональная патология зараженных вирусами клеток d культурах.

Штамм (нем. stamm — род, корень) — культура микроорганизмов одного вида с одинаковыми морфологическими и биологическими свойствами.

Элементарные тельца — см. Влрион (2, 8).

'гглгюлыткш мшглзт яяатл

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ

СПИСОК

1.    Лабораторные исследования и ветеринарии. Вирусные, риккетсиозные и паразитарные болезни : справочник / под ред. В. И. Антонова. — М.: Агроироымадат, 1987. — 240 с.

2.    Викулов, И. А. ЭлиэоотологическиЯ словарь-справочник/ И. А. Бакулов, Г. Г. Юрков, В. А. Ведерников [и др.]. — М.: Росселъхозиздат, 1986.

3.    Нымм, Э. М. Словарь ветеринарных микробиологических и вирусологических терминов / Э. М. Нымм, К. А. Петерсон, Э. А. Аавср [и др.]. — М.: Росагропромиздлт, 1989.

ПРЕДМЕТНЫЙ

УКАЗАТЕЛЬ

Агар мясо-пептоныый (МЛА) 101, 109, 126, 326, 387, 444, 466, 476, 483, 642, 688 Альбумин бычий 7, 226, 618 Аппарат Киппа 126, 480 Бульон мясо-пептонный (МПБ) 78,101, 109, 126, 326, 444, 466, 476, 483, 496, 642, 588 —    тршггозо-фосфатный 619 Буфер вероналовыи 36, 375 —    бораткый 148 —    фосфатно-солевой 174, 315, 328, 561,604 —    калий-фосфатный 231, 236, 407 —    карбонатно-бикарбонатыый 335, 501, 604, 618 Гемолизин 25, 114, 300, 369,607 Гемолитическая система (гехснстека) 26, 116, 216 Жидкость Руге 106, 446 —    Карнуа 108 Иммуноасцитическая жидкость (И АЖ) 84 Комплемент 27, 116, 216, 300, 370, 607

Метод вирусоскопии 99, 443, 648 —    Кербера 66 —    иммунофермснтного анализа (ИФА) 88, 159, 173, 228, 233, 244, 314, 328, 336, 349, 406, 409, 436, 661, 603, 609, 617 —    кофол-тАСта 514 —    перекрестного иммунитета 64 —    полимеразной цепной реакции (ПЦР) 180, 253, 307, 342, 416, 426, 625 —    Рида и Маяча 66, 242, 297, 324, 380, 394, 600, 523, 662, 656 —    электронной микроскопии 327, 693 Окраска гистопреларатов но Ленцу 80 —    Турбиной 584 —    Туревичу 81,584 —    мазков по Борману — Гайнуллиной 74 —    Милину 74 —    Морозову 100, 446 —    Муромцеву 73 —    Пашен у 100, 447 —    Селлерсу 74 Перевиваемая линия почки свиньи (СПЭВ) 70, 386, 392

---

—    культура клеток ВНК-2/ 18,110 —    культура клеток почки поросенка (РК-25) 289, 892 Первично-трипсиниэкроыш-ная культура клеток почки свиньи (ПЭС) 70,141, 886 —    почки эмбриона коров (ПЭК) 141, 218, 289 —    селезенки эмбриона коров (СЭК)218 —    легкие эмбриона коров (ЛЭК) 218 —    тестикулов бычка (ТВ) 218, 239 —    почка ягненка И О Раствор 30-50%-ного стерильного глицерина 21, 72, 100, 108, 886, 482, 688, 616 *— азида натрия 600 —    азотнокислого серебра 106, 446 —    Альсевера 55, 271, ЗС1 —    бис-диаэсбенэкдина 55 —    бори о-6оратный буферный 676 —    бромистого этиднл 180, 263, Ж, 342, 416, 626 —    версена 17, 69, 296 —    гексаметафосфата натрия 216 —    эабуференый физиологический (ЗФР) 7, 298, 825, 863, 388, 399, 663, 596 —    лимоннокислого натрия 127,135, 402, 448, 468, 469, 476, 636 —    мединал-веронвловый 83, 669 —    мертиолята 376, 600 —    натрия хлористого 7, 171, 215, 269, 276. 287, 262, 376, 392,571,611 —    трипсина 18, 69, 296 —    физиологический 21, 54, 78, 83, 101,110,127, 124. 212, 236, 257, 263, 266, 308,

364, 367, 419, 428, 444, 448, 456, 469, 475,482,607, 535, 642,    647, 554, 616, 630 —    фосфатно-буферный 7, 21, 54, 77, 109, 215, 229, 234, 271, 294, 322, 363, 358, 362, 367, 386, 448, 602, 607. 591,620 —    формалина 86, 100, 108, 482, 60S. 637, 617 —    Хоикса 18, 70, 87,141,211, 240, 296, 323, 377, 387, 486, 492,    636, 589, 616 —    хромоген-субстратный 318, 332, 338, 353, 564, 606 —    Эванса 299 —    Эдиигтоиа 108 —    Эрла 18, 296, 589 Реакция гемвгглютинации (РГА) 127, /35. 221, 270, 359, 403, 449. 459, 472, 477, 643,    697 —    гемпдеорбции (РГАд) 142, 220 —    диффузионной преципитации (РДП) 4, 76,118, 145, 214, 268,280,376. 483,488, 493,    600, 636, 546, 562. 699 —    длительного связывания комплемента (РДСК) 113 —    нммунолиффузии (РИД) 154, 170, 276 —    иммунофлуоресценции (РИФ) 77,112,142, 212, 242, 262, 268, 298, 322, 378, 886, 516, 562, 691 —    иммуноосмофореэа 84 —    иммуноолектроос-мсфорг.тл (РИЭОФ) 669, 573 —    нейтрализации (PH) 69, 86, 143, 227, 241, 324,379, 389, 393, 395, 464, 493, 497, 522, 54 3, 548 —    нейтрализации вирусных гем агглютинин он (РНВГ) 226 —    непрямой гемагглютикации (РИГА) 83, 227, 325, 494, 501,516

---

Лаборсигхрких диагностика вирусных больней живешигх

«■«И МИМШИШ» ИМ1ГИ!!— • »ии

—    непрямой кммунофлуо* ресценции (Р11ИФ) б, 112, 292, 822 —    пассивной гемагглютииацин (РПГА) S3 —    подавления иммунофлуо* ресценции 213, 386 —    радиальной кммуноднф* фузии (РРИД) 6, 276 —    серозащиты (Р8) 66 —    связывания комплемента (РСК) 24, 36, 216, 268, 299, 368, 507 —    угнетения связывания комплемента (РУСК) 59 —    торможения (задержки) гемагглютишщии (РТГА, РЗГА) 125, 135, 144,221, 262, 265, 272, 357, 361, 399, 446, 457, 477, 697 —    гемадсорбции (РТГАд) 142, 220, 262 —    непрямой гем агглютинации (РТНГА) 225 Среда 190, 323, 386, 486, 618, 540, 690 —    0,5% -нсгогидролилаталак-тальбумина 18, 70,110,

240, 323, 386. 486, 518, 540. 589 —    б% «ногогемогидролизата 386 —    Игла 18, 70, 110, 486, 518, 640, 690 —    Игла (МЕМ) 289, 393 —    Китта-Тароцци 326, 542 —    поддерживающая 18, 923, 386, 393, 486, 618, 640, 590 —    ростовая 18, 296, S9S, 486, 518, 690 Тельца Бабеигл — Негр и 74 Термолабильные ингибиторы 126, 403, 449, 480 Термостабильные ингибиторы 126, 480 Тканевая цитопатическия доза (ТЦД) 18, 70, 87,143, 380, 394, 544 Цитояатическое действие 70,87,110,143, 219, 241, 324, 380, 388, 394, 486, 644 Эритроцитарный диагностикум 65, 88, 325

---

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ

Составители:

П. И. Барышников,

В. В. Разумовская

Издание второе, исправленное

ДОПУЩЕНО

Министерством сельского хозяйства РФ в качестве учебного пособия для студентов вузов. обучакчцихся по направлению подготовки f специальность J •Ветеринария»

ДОПУЩЕНО

УМО вузов РФ по образованию в области зоотехнии и ветеринарии » качестве учебного пособил для студентов вузов, обучающихся по наяравленик подготовки (специальности) •Ветеринария» (квалификаций (степень) •Ветеринарный врач»)

•САНКТ-ПЕТЕРБУРГ • МОСКВА • КРАСНОДАР • •2015-

СОДЕРЖАНИЕ

I. Болезни, общие для всех

или нескольких видов животных...................б

Ящур ........... 5

количественному определению антител к вирусу ящура в сыворотке крови животных (утверждены 10 февраля 1983 г_м Nfe 115-ва)............5

1.2.    Методические указания по выделению и идентификации штаммов вируса ящура (одобрены и рекомендованы

15 октября 1073 г., б/н)................20

Бешенство....................................72

1.3.    Методические указания

по лабораторной диагностике бешенства

(утверждены 27 февраля 1970 г.,б/н).....72

Болезнь Ауески........ 82

1.4.    Методические указания по лабораторной

диагностике болезни Ауески животных (рекомендованы 18 мая 1978 г.,б/н)......82

1.5.    Инструкция по применению набора для определения антител к гликопротеину gl

свиней методом конкурентного иммуноферментного анализа

«ZETECT-Серелиза-АУЕСКИ -Ат*........88

Оспа.........................................08

ББК 48.7я73 Л 12

Л 12 Лабораторная диагностика вирусных болезней животных / Сост. Л. И. Барышников, В. В. Разумовская: Учебное пособие. — 2-е изд., испр. — СПб.: Издательство «Лань», 2015.— 672с.; ил. — (Учебники для вузов. Специальная литература).

ISBN 978-5-8114-1882-4

Учебное издание содержит действующие методически® указания, наставления и инструкции по лабораторной диагностике вирусных болезней животных, утнержденные Министерством сельского хозяйства СССР. РФ и Россельхознадэороы РФ. Документы систематизированы по видам животных, в большинства прошли многолетнюю н апробацию в Алтайской краевой ветеринарной ла Моратории и включены в «Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения» (пс состоянию на июль 2011 г.). Приводятся предметный указатель и библиографический список.

11редназндчено для студентг.в, «ручающихся по специальности «Ветеринария» и направлению «Ветеринарно-санитарная экспертиза», петгринлрнмх орлчей и яаборантоп ветеринарных лабораторий.

ББК 48.7я73

Рецензенты:

И. И. ГУСЛАВСКИЙ — доктор ветеринарных наук, профессор кафедры микробиологии, эпизоотологии, паразитологии и ВСЭ Алтайского государственного аграрного университета;

В. И. ПЛЕШАКОВА — доктор ветеринарных наук, профессор, зав. кафедрой ветеринарией микробиологии, вирусологии и иммунологии Омского государственною аграрною университета им. П. А. Столыпина:

В. А. СИНИЦЫН — доктор встерииарпых наук, зав. отделом ФГБУ «Новосибирская межрегиональная ветеринарная лаборатория».

Обложка €> Издательство «Лань», 2015 Е. А. ВЛАСОВА О Коллектив авторов, 2015 © Иодатсльство «Лань»,

художественное оформление, 2015

ПАРАМИКСОВИРУСЫ

6.11.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ 110 ВЫЯВЛЕНИЮ ПАРАМИКСОВИРУСОВ.

ИХ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ВЫЯВЛЕНИЮ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ (утверждены 6 февраля 19911.. Л? 044-3)

1.    Общие положения.

1.1.    Лабораторные исследования на парамиксовирусную инфекцию птиц основаны на:

■    выделении вируса ка эмбрионах кур (ЭК) и его идентификации в реакции торможения гемагглютинации (РТГА);

■    исследовании проб сывороток крови птиц.

Для проведения исследований на парамиксовкрусную инфекцию птиц используют набор, который содержит антигены и сыворотки различных серологических вариантов парамиксовирусов.

2.    Подготовка материала к исследованию.

2.1.    В лабораторию для исследования доставляют:

■    патологический материал от 3...5 больных птиц в первые два дня заболевания (головной мозг, селезенку и легкие);

■    сыворотку крови больных и переболевших птиц в количестве I...2 мл — не менее 20 проб из каждого помещения. Патологический материал помещают в термос со льдом

или в раствор 60%-ного х/ч глицерина, приготовленного на физиологическом растворе (pH 7,2...7,3), и направляют в лабораторию.

2.2.    В лаборатории из патологического материала готовят 10%-ную суспензию на стерильном физиологическом растворе (pH 7,2...7,3), центрифугируют 15 мин при

1600 об/мин. Надосадочную жидкость переносит в стерильные пробирки, добавляют 1000ЕД/мл пенициллина и 1000 мг/мл стрептомицина, выдерживают при комнатной температуре (20°С) 60 мин, проверяют на отсутствие бактериального загрязнения путем высева на питательные среды МПБ, МПА и используют для заражения эмбрионов кур.

3.    Выделение вируса на эмбрионах кур.

3.1.    С этой целью исследуемый материал (10%*ную на-досадочную суспензию) вводят в объеме 0,2 мл в аллантоисную полость 3...10-дневным эмбрионам. Заражают не менее 10 эмбрионов, контролем служат 5 незараженных эмбрионов.

3.2.    Зараженные и контрольные эмбрионы инкубируют в термостате при температуре 37...38°С и относительной влажности 60...70% в течение 96 ч. В процессе инкубации эмбрионы овоскопируют два раза в сутки, погибших исследуют в капелькой реакции гемагглютинации РГА (н. 4).

Через 96 ч инкубации все эмбрионы вскрывают после предварительного охлаждения в холодильнике при 4°С.

3.3.    Перед вскрытием эмбрионов скорлупу над воздушным пространством (пугой) обрабатывают спиртом, обжигают и из каждого эмбриона отбирают экстраэмбриональ-ную жидкость в стерильные пробирки, одновременно делают высевы на питательные среды МПБ, МГ1А для контроля на отсутствие бактериальной контаминации.

4.    Постановка капельной реакции гемагглютинации (РГА).

4.1.    Для постановки капельной реакции гемагглютинации экстраэмбриональную жидкость от каждого эмбриона смешивают в равных каплях с 1%-ноЙ взвесью эритроцитов петуха на стекле или пластинах. При положительной реакции через 2...5 мин появляются хлопья агглютинированных эритроцитов.

4.2.    Для получения 1%*ной суспензии эритроцитов используют петухов старше б мес. Кровь берут из подкрыльцовой вены во флаконы с 2.,.3%-ным раствором лимонно-

кислого натрия на физиологическом растворе (pH 7,2...7,3), трижды отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 1500 об/мин 10 мин. Из осадка эритроцитов готовят 1%-ную суспензию и хранят ее не более трех суток в условиях холодильника (4°С).

4.3. При наличии гемагглютинации и отсутствии бактериального загрязнения проводят титрование выделенного вируса в количественной РГА.

В случае отрицательной РГА образцы экстравмбрио-нальной жидкости объединяют (по 5 ЭК) и проводят еще два пассажа с последующим контролем на вирус в капельной РГА.

5.    Постановка количественной РГА.

5.1.    Для постановки количественной РГА готовят двукратные разведения исследуемой дкетраамбркональиой жидкости ЭК от 1:2 до 1:1024. Для этого в ряд лунок пластин наливают физиологический раствор (pH 7,2...7,3) в объеме по 0,2 мл. В первую лунку вносят 0,2 мл исследуемой жидкости, трехкратно лииетируют и переносят 0,2 мл смеси во вторую лунку и так далее до требуемого разведения. Из последней лунки 0,2 мл удаляют в дезраствор.

5.2.    В каждую лунку добавляют по 0,2 мл 1%-ной суспензии эритроцитов, затем пластины встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Контролем служат две лунки с эритроцитами и физиологическим раствором в равных объемах (по 0,2 мл).

5.3.    При положительной РГА эритроциты образуют осадок в виде зонтика. Титром вируса считается то наибольшее его разведение, при котором наблюдается еще агглютинация эритроцитов, что и соответствует 1 АЕ. Выделенный вирус идентифицируют в РТГА.

6.    Идентификация нмрусд в реакции торможения ге-магглютииацик (РТГА).

в. 1. Идентификацию выделенного вируса проводят в РТГА с эталонными специфическими сыворотками.

Подготовку препаратов к работе проводят согласно требованиям, указанным во вкладыше в набор.

6.2.    Для постановки РТГА готовят рабочую дозу исследуемого вируса (8 АЕ) исходя из его титра (1 АЕ).

Для этого исходный вирус разводят физиологическим раствором во столько раз, сколько получают от деления его титра (1 АЕ) на 8.

Пример: если титр вируса 1:256, то его рабочее разведение будет равняться 256: 8 *- 32, т. е. в 0,2 мл разведенного 1:32 вируса будет содержаться 8АЕ. В данном примере необходимо взять 31 мл физиологического раствора и 1 мл исходного вируса.

6.3.    Перед постановкой основного опыта проверяют правильность выбора 8 АЕ. Для этого на пластике в 5 лунок поливают по0,2 мл физиологического раствора, затем в первую лунку добавляют 0,2 мл 8 АЕ вируса и после пилотирования 0,2 мл переносят во вторую лунку, затем в третью, в четвертую и в пятую, а из пятой лунки удаляют 0,2 мл в дезраствор. Таким образом в первой лунке будет 4 АЕ, во второй — 2 АЕ, в третьей — 1 АЕ, в четвертой — 0,5 АЕ, в пятой — 0,25 АЕ. После этого в каждую лунку добавляют по 0,2 мл 1%-ной суспензии эритроцитов. Пластину встряхивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре.

6.4.    При правильном определении рабочей дозы (8 АЕ) в первой, второй и третьей лунках должна быть полная агглютинация, в четвертой — частичная, в пятой — четко выраженная пуговка. Если в четвертой лунке оказывается полная агглютинация, то это означает, что выбранная доза вируса содержит более 8 АЕ. В этом случае доза должна быть уменьшена. И наоборот, отсутствие агглютинации ь третьей и в четвертой лунках свидетельствует о недостаточном количестве вируса. Увеличение или уменьшение рабочей дозы проводят добавлением вируса или физиологического раствора и затем повторно проверяют 8 АЕ.

6.5.    Постановка РТГА (основной опыт).

В ряд лунок, начиная со второй, наливают по 0,2 мл физиологического раствора. Затем в первую и вторую лунки добавляют по 0,2 мл специфической сыворотки, содержимое второй лунки пипетируют и переносят 0,2 мл смеси в третью лунку итак далее до предельного разведения, указанного на этикетке ампулы. После этого во все лунки

вносят по 0,2 мл рабочего разведения вируса (8 АЕ). Пластины встряхивают и после 30-микутного контакта сыворотки с вирусом в каждую лунку добавляют по 0,4 мл 1%-ной суспензии эритроцитов.

6.6.    Контроля:

■    сыворотки (0,2 мл сыворотки + 0,2 мл физиологического раствора и 0,4 мл 1%-ноЙ суспензии эритроцитов);

■    стандартных диагностикумов (0,2 мл 8 АЕ антигена + 0,2 мл гомологичной ему сыворотки + 0,4 мл-1%-ной суспензий эритроцитов);

■    эритроцитов иа спонтанную агглютинацию (0,2 мл физиологического раствора + 0,2 мл 1%-ной суспензии эритроцитов).

Учет реакции проводят через 30...60 мин после полного оседания эритроцитов.

6.7.    Идентификацию вируса считают завершенной, если специфическая сыворотка тормозит гемагглютинирующую активность выделенного вируса не менее 1/4...1/8 ее титра, указанного на отикетке ампулы.

6.8.    Для постановки РГА и РТГА микрометодом используют микротитратор системы ТАКАЧИ или микропипет-ки. Микрореакцию ставят в объеме 0,026 мл (1 капля) вместо 0,2 мл с 0,7%-ной суспензией эритроцитов.

7. Выявление специфических антител в сыворотке крови больных птиц РТГА.

7.1.    Наряду с выделением вируса от больной птицы на четвертый день после начала заболевания исследуют сыворотку крови па наличие специфических антител к парамик-ссвирусу в том случае, если птица не была вакцинирована. С этой целью необходимо исследовать в РТГА не менее 20 проб сыворотки крови с эталонными диагностическими антигенами парамиксовирусов.

7.2.    Пробы крови от больных птиц берут стерильно из подкрыльцовой вены в пробирки, увлажненные стерильным физиологическим раствором. Полученную кровь выдерживают до образования сгустка при комнатной температуре, осторожно обводят спицей (или пастеровской пипеткой) и оставляют на 2... 3 ч. Затем сыворотху отсасывают

в стерильные пробирки и разводят 1:6 дистиллированной водой. Для удаления термолабильных ингибиторов сыворотку крови прогревают на водяной бане при 56°С в течение 30 мин.

7.3.    Ампулы (флаконы) с антигенами разводят физиологическим раствором (pH 7,2...7,3) согласно требованиях вкладыша по применению диагиостикума.

7.4.    Для постановки РТГА готовят двукратные разведения сывороток на физиологическом растворе, начиная с разведения 1:5 до 1:320. Далее РТГА ставят, как описано в п. 6.

7.5.    При обнаружении в сыворотках крови титров 1:10 и выше РТГА ставят повторно. Для этого сыворотки освобождают от неспецифических термостабильных ингибиторов с целью подтверждения наличия в них специфических антител к парамиксовирусу. Для удаления термостабильных ингибиторов через разведенную и прогретую сыворотку крови пропускают углекислый газ из аппарата Киппа или добавляют кусочки сухого льда. Обработку сыворотки ведут в течение 2...3 мин. Образовавшийся осадок удаляют центрифугированном в течение 10 мин при 1500 об/мин. Над осадочную жидкость исследуют в РТГА.

7.6.    Для одновременного удаления термолабнльных и термостабильных ингибиторов сыворотки крови ее обрабатывают нейраминидазой нехолерных вибрионов согласно «Инструкции по применению нейраминидаяы нехолерных вибрионов*, утвержденной Минздравом РСФСР 19.11.86 г.

7.7.    Титром антител в сыворотке считают последнее ее разведение, давшее полную задержку гемагглютинации с исследуемым антигеном.

8.    При выделении титра антител 1:10 и выше в 30...50% исследуемых сыворотках проводят вирусологические исследования.

9.    Срок исследований.

Выделение вируса и обнаружение специфических антител — 4... 12 дней.