ЛЛБОРЛТОРНЛЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ

h

•САНКТ-ПЕТЕРБУРГ-

•МОСКВА-

-КРАСНОДАР-

•S015-

жен ном (падающем) свете при объективе х40, окуляре *4 (или х5), возбуждающих светофильтрах ФС, БС и СС и запирающем светофильтре ЖС-18 (или ЯСС-19), увеличении бинокулярной насадки xl.l (или х1,6). Детальное описание центрировки и других правил работы люминесцентных микроскопов дано в прилагаемых к ним инструкциях.

5.2.3.    При необходимости в ходе исследования проводят фазово-контрастную микроскопию тех же пслей зрения препарата, но в проходящем свете (с целью дкфферен-цировки клеточных элементов от посторонних частиц).

6.2.4.    До и после исследования препараты можно хранить несколько дней в сухой кювете при 4°С или комнатной температуре в темном месте.

5.3.    Критерии специфичности свечения.

5.3.1.    Важные критерии, определяющие специфичность свечения в препаратах:

а)    цвет должен быть зеленым или изумрудно-зеленым;

б)    локализация только цитоплазматическая;

в)    интенсивность свечения должна отчетливо превышать таковую соседних неинфицированных клеток, а также клеток в отрицательных контролях;

г)    количество светящихся клеток не должно заметно отличаться от числа клеток с таким же зеленым свечением в положительном контроле (см. п. 5.1.4а).

5.3.2.    Все другие цвета свечения клеток: серо зеленый, серый, желтый, розовый или красный (разных оттенков) — не являются специфическими.

5.4.    Оценка результатов НРИФ.

6.4.1.    Наличие в сыворотке постинфекционыых антител определяют путем обнаружения в препаратах клеток со специфическим свечением, сходным с таковым в положительном контроле.

5.4.2.    Диагностическийг результат считают положительным при обнаружении специфического свечения хотя бы в одной из 5... 10 сывороток, присланных из данного хозяйства.

5.4.3.    Наличие в препаратах яркого серо-зеленого, серого или другого оттенка свечения клеток указывает на сомнительный результат реакции. Это может быть связано

с присутствием в данной сыворотке высокого титра поствак* цинальных антител. При сомнительных результатах через

7... 10 сут повторно получают и исследуют сыворотку от тех же животных.

5.4.4. Результат НРИФ является отрицательным при отсутствии специфическою свечения в препаратах, обработанных обоими разведениями испытуемой сыворотки.

5.5.    Титрование постинфекционных антител.

5.6.1.    Для определения уровня антител в испытуемой сыворотке проводят ее титрование с помощью КРИФ в следующем порядке:

■    испытуемую сыворотку, давшую положительную НРИФ,

разводят БФР с pH 7,2...7,4 последовательно 1:40, 1:80..... 1:280;

■    на препараты из культуры клеток, инфицированной вирусом ящура любого типа, пипеткой наносят вышеуказанные разведения испытуемой сыворотки, начиная с наивысшего;

■    дальнейшее исследование проводят по той же схеме, что и при выявлении постинфекционных антител (см. подразделы 5.1...5.4).

5.6.    Оценка результатов титрования.

5.6.1.0 титре постинфекционных антител в сыворотке судят по предельному ее разведению, которое способно давать положительную НРИФ.

5.6.2.    При проведении НРИФ с использованием гомологичных препаратов, т. е. при соответствии типа вирусного антигена в них с типовой принадлежностью антител испытуемой сыворотки, титры антител у живот-ных-реконвалесцентов, выявляемых этой реакцией, как правило, превышают титры вируснейтралкзующих антител на 2...3 log₂.

5.6.3.    При использовании для титрования гетерологичных препаратов титры постинфекцнонных антител в сыворотках, как правило, совпадают с титром вируснейтрали-зующих антител или превышают их на 1...21og_z.

5.6.4.    Выявление специфического свечения в препаратах, обработанных испытуемой сывороткой крупного рогатого скота в разведениях 1:10,1:20 и 1:40, свидетельствует

об остром переболеванни животного ящуром, т. е. о том, что с момента его заболевания прошло около недели.

б.б.б. Наличие специфического свечения в препаратах, обработанных испытуемой сывороткой в разведениях 1:80 и выше, указывает на то, что данная сыворотка взята от животкого-реконвалесцента.

5.7. Результаты исследования оформляют в виде протокола, в котором указывают:

■    дату исследования;

■    наименование и адрес хозяйства, откуда получены сыворотки;

■    причину исследования сывороток;

■    краткие данные о времени появления заболевания, клинические его признаки, охват животных заболеванием, предполагаемый диагноз, дату проведения вакцинации идр.;

■    характеристику испытуемых сывороток (от какого вида животных и когда они взяты, их количество);

■    наименование культуры клеток и типа (штамма) вируса ящура, используемых для приготовления препаратов;

■    срок и условия хранения препаратов;

■    серию, срок годности и рабочие разведения люминесци-рующей сыворотки и бычьего альбумина, меченного родамином;

■    проведенные контрольные исследования (характеристика контрольных препаратов и контрольных сывороток);

■    характер свечения в контролях и препаратах, обработанных разными разведениями исследуемой сыворотки;

■    результат реакции по каждой сыворотке и в целом по группе сывороток, полученных из хозяйства (фермы, гурта, отары и т. п.);

■    дату официального ответа и адресат.

6. Проведение исследований по тклироианию и количественному определению постинфекционных и поствак-цинальных антител в РРИД.

6.1.    Подготовка компонентов реакции.

6.1.1.    Агаровый гель готовят по следующей прописи:

■    агара — 20 г;

■    натрия хлористого — 1в г;

■    воды дистиллированной — до 1000 мл.

Смесь перечисленных ингредиентов доводят до кипения. После расплавления агара к нему добавляют 1 мл 50% -ного раствора карболовой кислоты или 1,0 гаоида натрия и 0,03 г метилоранжа. Расплавленный агар фасуют во флаконы объемом 50...100 мл или в ампулы объемом 3...6 мл, герметизируют и хранят при +4®С до 12 мос., а при комнатной температуре — до 6 мес.

6.1.2.    Каждую пробу испытуемой к эталонной сыворотки сначала разводят 1:5 буферным физиологическим раствором, а затем последовательно с двукратным шагом до 1:320.

При необходимости более точного определения титра антител исследуемую сыворотку разводят не двукратным шагом, а в арифметической прогрессии, например 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50 кт. д. Объем каждого разведения зависит от числа эталонных антигенов, с которыми проверяется сыворотка.

Его находят по формуле

Х = -+2мл, b

где X — объем разведения сыворотки, мл; а — число эталонных антигенов, с которыми будет исследована сыворотка; Ъ — число антигенов, размещаемых на одной иммуно-диффузионной пластинке.

Если в результате получается не целое число, то его округляют в сторону увеличения объема.

Непосредственно перед постановкой реакции все разведения сыворотки нагревают в водяной бане до +50...55°С.

6.1.3.    Сухие эталонные антигены регидратируют дистиллированной водой в объеме, указанном на их этикетках.

6.1.4.    Сухие эталонные сыворотки и препараты иммуноглобулинов сначала регидратируют дистиллированной водой в объеме, указанном на их этикетках, а затем готовят на буферном физиологическом растворе ряд последователь-

иых двукратных разведений начиная с 1:20, о объемах, как указано в п. 6.1.2.

6.1.6.    Подготовка иммунодиффузионных пластинок заключается в следующем: агаровый гель, полученный, как указано в п. 6.1.1, расплавляют в кипящей водяной бане, охлаждают до +50...55°С и смешивают с ранными объемами нагретых до этой же температуры испытуемых сывороток, разведенных, как указано в п. 6.1.2. Полученные жидкости тщательно смешивают и немедленно наносят по 4 мл на обезжиренные предметные стекла, установленные по уровню на строго горизонтальный стол.

Примечание. Обезжиривают предметные стекла смесью равных объемов спирта и эфира или хромпиком по методике подготовки стеклопосуды в вирусологических целях.

После затвердения геля пластинки выдерживают при комнатной температуре на воздухе 1 ч или во влажной камере — 18...20 ч. В затвердевшем агаре специальным штампом на каждом стекле вырезают 4 лунки диаметром 4 мм или 3 лунки диаметром 7,7 мм, что зависит от активности эталонных антигенов. Бели титр их активности в РСК выше 1:16, то делают лунки диаметром 4мм, а если ниже-7,7 мм.

6.1.6.    Лунки иммунодиффузионных пластинок заполняют эталонными антигенами, нс допуская их переполнения и растекания по поверхности агара. Затем пластинки помещают’ во влажную камеру или в эксикатор и помещают в термостат при + 37°С. Предварительный учет реакции проводят через 6...7 ч после постановки. Окончательно результаты учитывают через 18 ч.

6.1.7.    Реакцию учитывают но наличию зоны специфической преципитации. Для ее выявления применяют косое освещение иммунодиффузионных пластинок осветителем ОИ-19. Положительная реакция характеризуется образованием кольца преципитации в виде опалесцирующей или вуалевой зоны вокруг лунки с антигеном, гомологичным возбудителю, вызвавшему заболевание, или вакцинному штамму.

Примечание. В отдельных случаях возможно появление зоны опалесценции вокруг лунок с гетерологичными антигенами. Для исключения ложноположительных результатов пластинки с такими зонами следует на 18...20 ч поместить в воду, после чего учесть результаты повторно.

6.1.8.    Учет результатов.

Антитела, обнаруженные в испытуемой пробе сыворотки, относят к тому серотипу, с антигеном которого они дали положительную реакцмю. Их предельным титром считают максимальное разведение испытуемой сыворотки, с которым наблюдается положительная реакция.

Титры сыворотки, полученной от вакцинированных животных, зависят от активности использованной вакцины, кратности и сроков ее применения и физиологических характеристик животного (возраст, вид). У однократно вакцинированного против ящура взрослого крупного рогатого скота обычно титры через З0...90сут после введения вакцины лежат в диапазоне 1:20... 1:80, а после двукратной иммунизации в эти же сроки они возрастают до 1:80...1:160. Титры у молодняка, как правило, в 2...3 раза ниже, чем у взрослых животных. У свиней и овец титры ниже, чем у крупного рогатого скота.

После переболеваиия животных титры значительно выше, чем после вакцинации, и обычно превышают разведение 1:160.

6.1.9.    Результаты исследования сыворотки в РРИД протоколируют в специальных журналах, в соответствии с п. 6.7.

7. Общее заключение.

7.1.    Выявление в 11РИФ специфического свечения свидетельствует о наличии в испытуемой сыворотке постинфекционных антител, т. е. о переболевании животного ящуром.

7.2.    Исследование реконвалесцентных сывороток в РРИД позволяет определить типовую специфичность антител, а по ним ретроспективно поставить диагноз на заболевание. Исследование поствакцинальных сывороток н этой реакции позволяет определить типовую специфичность и состо-

яние гуморального иммунитета, а также эффективность применяемых средств активной иммунизации против ящу-ра и других везикулярных болезней животных.

Общая продолжительность исследования сыворотки составляет 18 ч, в том числе дифференциация постинфекцн-онных антител от поствакцинальных с помощью НРИФ — 4 ч, типирование антител и определение титра их активности с помощью РРИД —18 ч.

ПРИЛОЖЕНИЕ к «Методическим указаниям по выявлению, идентификации типовой специфичности и количественному определению антител к вирусу ящура в сыворотке крови животных».

Способ приготовления препаратов (антигенов) для НРИФ. 1. Аппаратура, материалы, реактивы, питательные среды.

1.1. Для приготовления препаратов дополнительно, кроме указанного в п. 3.1 «Методических указаний*, необходимо следующее:

■    автоклав;

■    бокс стерильный;

■    горелка газовая или спиртовая;

■    круг наждачный;

■    холодильник электрический бытовой или на ~20°С;

■    шкаф вытяжной;

■    шкаф сушильный электрический лабораторный;

■    центрифуга лабораторная стационарная с набором центрифужных пробирок;

■    банки стеклянные вместимостью 0,5... 1л;

■    матрасы вместимостью 1...1,бл;

■    пипетки пастеровские;

■    стекла предметные;

■    ацетон, осч, или производства ГДР, ЧССР;

■    спирт этиловый ректификованный или спирт гидролизный;

■    эфир для наркоза;

■    версен (0,02%-ный раствор);

■    вирус ящура (любого типа ила штамма), адаптированный к культуре клеток, с титром около 10 ТЦД^/мл;

■    раствор Хенкса (без индикатора);

■    среда питательная поддерживающая (среда Игла для перевиваемой культуры клеток, 0,6%-ный гидролизат лактальбумина на растворе Хенкса или Эрла — для первичных культур клеток);

■    среда питательная ростовая, т. е. соответствующая поддерживающая среда с 10% -ным содержанием сыворотки крови крупного рогатого скота;

■    суспензия или монослой первичной культуры клеток бычьей или свиной почки (БП, СП) или перевиваемой культуры клеток ВНК-21;

■    трипсин (0,25%-ный раствор).

1.2. Растворы и среда должны быть стерильными. Посуда должна быть обработана общепринятым способом, а предметные стекла — по следующей методике. Заранее на одном из концов каждого предметного стекла с помощью наждачного круга делают матовый шлиф шириной около 1 см, потом стекла тщательно моют в нейтральных детергентах, ополаскивают дистиллированной водой и хранят в смеси спирт-эфира (поровну). Перед употреблением их протирают насухо, проводят через пламя горелки и охлаждают. После употребления стекла вновь обрабатывают по той же схеме.

2. Приготовление препаратов.

2.1.    Препараты готовят путем инфицирования однослойной культуры клеток вирусом ящура.

2.2.    Однослойные культуры клеток выращивают в матрасах вместимостью 1...1,5 л общепринятым способом. При этом монослой клеток ВНК-21 формируется через 1...2 сут, СП — через 3...5, БП — через 5...7 сут.

2.3.    Для инфицирования выращенной культуры клеток используют оптимальную дозу вируса, определяемую накануне путем титрования на соответствующей культуре клеток. Необходимо, чтобы эта доза вируса вызывала в указанной культуре лишь частичную деструкцию монослоя через

18...24 ч инкубации.

2.4.    Культуру клеток инфицируют в следующей последовательности:

■    ив матраса с выращенным монослоем удаляют ростовую питательную среду м ополаскивают свежей поддерживающей средой;

■    в матрас вносят соответствующую дозу вируса и 160... 200 мл поддерживающей среды, ставят в термостат при 87^сС на 16...20 ч и периодически проводят световую микроскопию монослоя (для контроля ЦПД вируса).

2.5.    Препараты готовят при наличии в монослое 10... 30% пораженных клеток, т. е. при начальных признаках ЦПД вируса, когда при световой микроскопии обнаруживают единичные очаги округления и деструкции клеток, а также отслоение некоторых из них от стекла.

2.6.    Препараты готовят на специально обработанных предметных стеклах (см. п. 1.2) в следующей последовательности:

■    из матраса удаляют поддерживающую питательную среду;

■    клетки монослоя «снимают» со стекла и дезагрегируют по общепринятому способу с помощью 30...50 мл раствора трипсина или иерсена, подогретого до 37°С;

■    диспергированные клетки центрифугируют при 800... 1000 об/мин в течение 5...10 мин;

■    полученный осадок ресуспендируют в 5...10-кратном объеме раствора Хенкса (без индикатора);

■    клеточную суспензию, содержащую около 10 клеток/мл, наносят с помощью пастеровской пипетки на предметные стекла в виде серии из 2...3 капель диаметром 0,5...0,7 см и расстояния между ними около 1 см;

■    жидкость из капель суспензии высушивают на воздухе (под вентилятором) до получения на стеклах беловатого осадка, состоящего из клеток.

Из одного матраса таким образом можно приготовить

200...400 препаратов, которые должны Сыть тонкими, т. е. содержать ио более одного слон клеток.

2.7.    После высушивания препараты сразу же или на другой день фиксируют в течение 10...20 мин в ацетоне, охлажденном от +4°С до -10°С. Фиксатор при атом должен свободно циркулировать между предметными стеклами.

2.8.    После фиксации препараты высушивают на воздухе (в вытяжном шкафу), затем прогревают при 56°С в течение 4 сут (для инактивации вируса) и хранят до использования в закрытых фильтровальной бумагой банках при +4°С или -20°С, периодически проверяя их качество с помощью НРИФ.

2.9.    Для контроля подобным же образом готовят препараты из аналогичной, но неинфицировакной культуры клеток.

Методические указания разработаны Всесоюзным научно-исследовательским ящурным институтом МСХ СССР (А. М. Рахманов, X. А. Шажко, Н. В. Кудрявцев, Г. А. Кудрявцева, В. А. Мищенко).

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ

Составители:

П. И. Барышников, В. В. Разумовская

Издание второе, исправленное

ДОПУЩЕНО

Министерством сельского хозяйства РФ в качестве учебного пособил длл студентов вузов, обучающихся по направлению подеотсвки (специальность) •Ветеринарии*

ДОПУЩЕНО

УМО вузов РФ по образованию в области зоотехнии и ветеринарии в качестве учебною пособив длл студентов вузов, обучающихся по напров-сению подготовки (специальности) »Ветеринаром» (Квалификация (степень) •Ветеринарной враче)

•САН КТ ЛГГРРВУРГ*МОСКПА • КРАСНОДАР* *8015.

яяяяши нвша ишшгодожы imwimiii ни ш тн и н и и ж m i»:i \

КРАТКИЙ СЛОВАРЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ВЕТЕРИНАРНЫХ ТЕРМИНОВ

Антигены (анти + греч. genes — порождающий) — чужеродные для организма высокомолекулярные органические вещества коллоидной структуры (белки, белково-липидные и белково-полисахаридные комплексы), способные при поступлении (введении парентерально) вызывать синтез особых глобул и нов-антител и вступать в специфическое взаимодействие с ними.

Антитела (анти. 4 тело) — противотела — специфические белки (иммуноглобулины), образующиеся в организме под воздействием антигенов. Они накапливаются в сыворотке крови и тканях, вступают в специфическую связь с соответствующими антигенами и разрушают или обезвреживают их.

Биологическая проба (биопроба) — один из методов диагностики инфекционных болезней с помощью заражения патологическим материалом подопытных животных (куриных эмбри* онов, культур клеток) и их исследования.

Вирион — полноценная внеклеточная вирусная частица.

Вирусоьыделение — выделение возбуди телей инфекции из организма Сольного животного или вирусокосителя.

Вирусоиоситсльство — наличие возбудителя инфекции в определенных органах и тканях клинически здоропого животного, ие сопровождающееся иммунологической перестройкой организма.

Вирусы (лат. oirus — яд) ~ облигатные внутриклеточные паразиты, отличающиеся от растительных и животных организмов малыми размерами, отсутствием клеточного строения и автономного метаболиома, наличием только одного типа нуклеиновой кислоты и дезъюнктивным способом размножения.

ББК 48.7я73 Л 12

Л12 Лабораторная диагностика вирусных болезней животных / Ссст. П. И. Барышников, В. В. Разумовская: Учебное пособие. — 2-е изд„ испр. — СПб.: Издательство «Лань*, 2015.— 672с.: ил, — (Учебники для вузов. Специальная литература).

ISBN 978-5-8114-1882-4

Учебное издание содержит действующие методические указания, наставления и инструкции по лабораторной диагностике вирусных болезней животных, утвержденные Министерством сельского хозяйства СССР, РФ и Россельхоаиадэором РФ. Документы системАтизироьамы по видам животных, в большинстве прошли многолетнюю аплроблцию в Алтайской краевой ьеторинормой лаборатории и включены в «Перечень нормативной документации, разрешенной для использования о государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб. пчел, и также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения* (по состоянию на июль 2011 г.). Приводятся предметный указатель и библиографический список.

Предназначено для студентов, сЧ5учаюшихся по специальности «Ветеринария» и направлению • Ветеринарно-санитарная »кс-пертиза*. ветеринарных врачей и лаборантов ветеринарных лабораторий.

ББК 48.7я73

Рмивши

И. И. ГУС ЛАНС КИЙ — доктор ветеринарных наук, арофессор кафедры микробиологии, уг.иаоотологии, паразитологии и ВСЭ Алтайского государственного аграрного университета;

В. И. ПЛЕШАКОВА — доктор ветеринарных паук, профессор, зав. кафедрой ветеринарной микробиологии, вирусологии и иммунологии Омского государственного аграрного университета им. П. А. Столыпина;

В. А. СИНИЦЫН — доктор ветеринарных наук, зев. отделом ФГБУ «Новосибирская межрегиональная ветеринарная лаборатория».

Обложка © Издательство «Лань», 2015 Е. А. ВЛАСОВА О Коллектив авторов, 2015 О Издательство «Лань»,

художественное оформление, 201Б

БОЛЕЗНИ, ОБЩИЕ ДЛЯ ВСЕХ ИЛИ НЕСКОЛЬКИХ ВИДОВ ЖИВОТНЫХ

ЯЩУР

1.1.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВЫЯВЛЕНИЮ, ИДЕНТИФИКАЦИИ ТИПОВОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ И КОЛИЧЕСТВЕННОМУ ОПРЕДЕЛЕНИЮ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ЯЩУРА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ животных

(утверждены 10 февраля 1083 г.. Л® 11б-6а)

1. Общие положения.

1.1.    Настоящие методические указания предназначены для научно-исследовательских и других учреждений, занимающихся лабораторной диагностикой ящура и изучением динамики формирования гуморального иммунитета у переболевших или вакцинированных животных.

1.2.    Выявление, идентификация и количественное определение антител к вирусу ящура проводится в два этапа, выполняемых одновременно или последовательно:

■    выявление и определение уровня постинфекционяых антител с помощью непрямой реакции иммунофлуо-ресцен дни (НРИФ);

■    идентификация типовой специфичности и количественное определение антител с помощью реакции радиальной иммунодиффузки (РРИД).

1.3.    Выявление постинфекциокных антител в НРИФ основано на способности сыворотки крови переболевших животных давать специфическое свечение, в отличие от сыворотки вакцинированных или интактных животных, не дающей специфического свечения.

1.4.    Сущность НРИФ заключается в формировании зоны специфической преципитации вирусных антигенов Антителами, включенными в состав агарового геля. Дян-паи реакция является типоспецифичной. По мере снижения

концентрации специфических антител при разведении сыворотки интенсивность зоны преципитации уменьшается, а размер — увеличивается.

2. Взятие и пересылка материала на исследование.

2.1.    Материалом для исследования на наличие антител к вирусу ящура служат сыворотки крови животных, подозреваемых в переболевании ящуром или другими везикулярными болезнями либо вакцинированных против них.

2.2.    Для достоверного выявления антител и определения их типовой специфичности пробы сыворотки крови должны быть взяты не ранее 7 дней с момента появления у животных признаков везикулярного заболевания или проведения вакцинации. На исследование следует направлять

5... 10 проб сыворотки от каждой возрастной группы животных. При сомнительных результатах первичного исследования необходимо отобрать кровь повторно от тех же животных спустя 7.. ДО дней.

2.3.    Кровь у крупного и мелкого рогатого скота берут из яремной вены, а у свиней — из ретробульбарного венозного синуса. Сыворотку, полученную общепринятым методом, консервируют антибиотиками (по 500 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина) или замораживают при - 20°С. На исследование сыворотку (не менее 5 мл от каждого животного) направляют в термосе со льдом.

2.4.    На партию проб сыворотки оформляют сопроводительный документ, в котором должно быть указано:

■    наименование и адрес хозяйства, где отобраны сыворотки;

■    вид животных, от которых взяты сыворотки;

■    количество и номера проб, а также дата их взятия;

■    причина направления сывороток на исследование;

■    краткие клинические признаки болезни, время их проявления н предполагаемый диагноз;

■    дата вакцинации и характеристика использования вакцин;

■    фамилия к должность лица, направившего сыворотки не исследование.

8. Аппаратура, материалы, реактивы, растворы и сыворотки.

3.1. Для исследования сыворотки в НРИФ применяют:

■    вентилятор настольный;

■    весы лабораторные;

■    камеру влажную (стерилизатор или кювета с крышкой, на дно которых кладут смоченную водой фильтровальную бумагу);

■    микроскоп люминесцентный;

■    потенциометр или рН-метр;

■    термостат электрический с автоматическим регулятором;

■    препараты из культуры клеток, содержащие антиген вируса ящура (готовят во Всероссийском научно-исследовательском ящурном институте в соответствии с «Приложением»);

■    препараты из неинфицированной культуры клеток (для контроля);

■    пипетки вместимостью 1 и 5 мл с ценой делении ОД мл;

■    пробки резиновые;

■    флаконы пенициллиновые;

■    воду дистиллированную;

■    буферный физиологический раствор (БФР) с pH 7,2...7,4. Вначале готовят раствор А (9,08 г калия фосфорнокислого однооамещенного, х. ч., растворяют в веде объемом до 1 л) и раствор Б (9,48 г натрия фосфорнокислого двузамещенного безводного, х. ч., или 23,75 г Ne*HP0₄12Н*0 растворяют в воде объемом до 1л).

Для приготовления 1/15 М раствора фосфатного буфера с pH 7,2...7,4 смешивают 280 мл раствора А и 720 мл раствора Б. Для получения БФР с тем же pH берут 300 мл раствора фосфатного буфера и 700 мл 0,85%-ного раствора натрия хлористого, х. ч. Растворы готовят на кипяченой дистиллированной воде. Перед употреблением проверяют pH полученного БФР. При отклонении pH в щелочную сторону добавляют раствор А, в кислую — раствор Б;

■    альбумин бычий, меченный родамином;

■    сыворотки крови крупного рогатого скота, овец и свиней, не содержащие постинфекционных антител к ви-

русу ящура, т. е. нормальные или негативные сыворотки (для контроля);

■    сыворотки крови крупного рогатого скота, овец и свиней — ящурных реконвалесцентов, т. е. позитивные сыворотки (для контроля);

■    сыворотки крови крупного рогатого скота, овец и свиней, привитых инактивированной вакциной, т. е. сыворотки, содержащие поствакцинальные антитела (для контроля);

■    сыворотки сухие кроличьи люминесцирующие против глобулинов быка, Сарана к свиньи (антивидовые). Рабочие разведения люминссцирующей антнвидовой

сыворотки и бычьего альбумина, меченного родамином, готовят согласно наставлениям, прилагаемым к этим реактивам Институтом эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи (Москва), который их выпускает.

3.2. Для постановки РРИД применяют:

■    бани водяные ИЮ и 56°С;

■    рН-метр;

■    пробирки серологические с резиновыми пробками;

■    штативы для пробирок;

■    пипетки серологические вместимостью 1, 2, 5 и 10 мл;

■    колбы, цилиндры и другую посуду различной емкости;

■    предметные стекла 26x76 мм;

■    камеру герметическую или эксикатор для постановки реакции во влажной атмосфере;

■    штамп для изготовления лунок диаметром 4,0 и 7,7 мм;

• уровень;

■    осветитель ОИ-19 с синим светофильтром;

■    шланги резиновые разных диаметров;

■    раствор буферный физиологический (см. п. 3.1);

■    воду дистиллированную;

■    антигены эталонные 7 типов вируса ящура я других везикулярных болезней (ВБС 0-72 и Т-76, ВЭС А-48 и С-72, ВС «Индияка» и «Нью-Джерси»), изготавливаемые ВНИЯИ по инструкциям, утвержденным ГУВ МСХ СССР;

■    сыворотки эталонные 7 типов ящура и других везикулярных болезней (ВБС 0-72 и Т-75, ВЭС А-48 и С-72, ВС

•Индиана» к 4 Нью-Джерси»)» изготавливаемые ВНИЯИ по инструкциям, утвержденным ГУВ МСХ СССР, или препараты иммуноглобулинов, выделенных из иммунных сывороток, полученных на инактивированный вирус перечисленных болезней;

■    агар белый или импортный фирм «Серва» или «Дифко»;

■    азид натрия или кислота карболовая.

4.    Требования к условиям проведения исследований.

4.1.    Работа по выявлению, идентификациктиповойспе-цифичности и количественному определению антител к вирусу ящура может проводиться в условиях обычных ветеринарно-диагностических лабораторий и не требует создания более строгого санитарного режима, поскольку проводится с неикфекционными материалами.

5.    Проведение исследований по выявлению и определению уровня постинфекционных антител с помощью НРИФ.

5.1.    Техника проведения НРИФ.

6.1.1.    Сыворотки инактивируют при 5б°С в течение 30 мин, а затем разводят БФР с pH 7,2...7,4 в соотношениях 1:10 и 1:20.

6.1.2.    Препараты располагают в кювете и соответствующим образом маркируют графитовым карандашом на матовом шлифе стекла.

5.1.3.    НРИФ состоит из двух этапов.

Первый этап. Препараты, содержащие вирусный антиген, обрабатывают последовательными разведениями испытуемой сыворотки, нанося на них по 2...3 капли сыворотки, начиная с конечного ее разведения, с последующим инкубированием во влажной камере при 37“С в течение 30 мин. На каждое разведение сыворотки берут не менее двух препаратов. Н©связавшиеся антитела сыворотки отмывают в двух порциях (по 10 мин в каждой) БФР с pH 7,2...7,4, охлажденного до 4°С, и подсушивают на воздухе под вентиля тором.

Второй этап. Препараты окрашивают смесью рабочих разведений люминесцирующей антивидовой сыворотки

и бычьего альбумина, меченного родамином (по 2...3 капли на препарат). Препараты, обработанные на первом этапе НРИФ сывороткой крупного рогатого скота, допустимо окрашивать люмииесцирующей сывороткой против глобулинов барана и наоборот.

После этого препараты, как и на первом этапе реакции, снова инкубируют во влажной камере при 37°С в течение 30 мин, затем отмывают в двух-трех порциях БФР от не-связавшихся антител к ополаскивают в дистиллированной воде (для удаления осадка солей, находящихся в БФР).

5.1.4. Контроля. Для исключения возможных ошибок НРИФ должна сопровождаться следующими контролями:

а)    препараты на первом этапе реакции обрабатывают сывороткой ящурных рекоывалесцентов с известной имму-нофлуоресцентной активностью, т. е. позитивной сывороткой, разведенной БФР в соотношении 1:10 и 1:20 (положительный контроль);

б)    препараты на первом этапе реакции обрабатывают нормальной, т. е. негативкой сывороткой, разведепной БФР в соотношении 1:10 и 1:20 (отрицательный контроль, в котором специфического свечения не должно быть);

в)    при необходимости дифференциации постинфекционных антител от поствакцинальных антител препараты обрабатывают сывороткой от вакцинированных животных в разведениях 1:10 и 1:20 (отрицательный контроль);

г)    препараты из неинфнцированной культуры клеток обрабатывают теми же реактивами, что и в контроле «а» (отрицательный контроль, используемый, как и контроля «б* и «в», для исключения возможного ложно специфического свечения).

5.2. Люминесцентная микроскопия препаратов.

5.2.1.    Вначале микроскопируют контрольные препараты с тем, чтобы убедиться в качестве реактивов и антигенов. Неудовлетворительные контроля делают нецелесообразным исследование и остальных препаратов, т. е. выявление постинфекционных антител в сыворотках в этом случае становится невозможным.

5.2.2.    Техника люминесцентной микроскопии. Препараты исследуют под люминесцентным микроскопом в отра-