ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ

г САШСТ-ПЕТЕРБУРГ • •МОСКВА-^КРАСНОДАР» •201В’

6.1.1.    Исследуемые сыворотки и контрольные (специфическую и нормальную сыворотки, взятые иа «Набора препаратов», перед постановкой реакции растворяют 0,5 см⁸ дистиллированной воды), прогревают при 56°С 50 мин и разводят в пенициллиновых флаконах средой Игла (МЕМ) 1:8 (к 0,2 см³ сыворотки добавляют 1,4 см^а среды).

6.1.2.    Во флаконы с разведенными сыворотками вносят равный объем 1000 ККИД_Б0/см³ вируса КЧС, шт. «Щи-Мынь*, (титрование вируса и расчет рабочей дозы вируса в Приложении, п. 3), тщательно встряхивают и инкубируют в течение 60 мин в термостате при (37±5)°С.

6.1.3.    После инкубации по 0,6 см^я смеси вносят в иро-бнрки с выращенной культурой клеток РК-15 на стеклянных пластинках» предварительно удалив ростовую среду. 11а каждую сыворотку берут по 4 пробирки. В качестве контроля токсичности разведенные сыворотки без вируса в объеме 0,5 см³ вносят в 4 пробирки и 4 пробирки оставляют интактными, сменив ростовую среду на поддерживающую («контроль культуры клеток»).

6.1.4.    Черед 2 ч смесь из пробирок удаляют, монослой дважды промывают средой Игла (МЕМ) и заливают поддерживающую среду. Каждые 24 ч культуру клеток просматривают под малым увеличением светового микроскопа дли контроля дегенерации клеток,

6.1.5.    При отсутствии дегенеративных изменений клеток через 48 ч после внесения смесей пластинки извлекают из пробирок, готовят пропарить: (и. 5.2), стивят реакцию прямой иммунофлуорвеценции (пп. 4.2...4.4) и проводят люминесцентную микроскопию (п. 4.5).

8.1.6.    Оценка результатов.

Результаты начинают оценивать в том случае, если в препаратах, обработанных смесью «нормальная сыворотка— вирус», обнаруживают флуоресцирующие микробляшки при их отсутствии в препаратах, обработанных смесью «специфическая сыворотка— вирус».

При отсутствии флуоресцирующих микробляшек в препаратах, обработанных смесью «исследуемая сыворотка — вирус», результат считают положительным, в случае обнаружения — отрицательным.

292    Лабораторная    диагностика    еиругных    вол«ней    хиеап-лыг

<№*UIN’IHM' М. и1ММ«М>М>ЯК1М»11н»МН11ШьИ!>»1В1Н1Ж<и!11Я< шнитм» ifcmaiMlMt »1]ИИМ Г»«ч« U№(*

6.2, Постановка реакции непрямой иммунофлуоресцен-цин (РНИФ).

6.2.1.    Положительные и отрицательные тест-препараты (приготовление в Приложении, п. 4) помещают на капли исследуемых и контрольных (специфической и нормальной) сывороток, разведенных 1:20, нанесенные на края предметных стекол во влажной камере. На каждую сыворотку берут по 2 положительных и отрицательных тест-препарата. Обработку тест-лрепаратов сыворотками проводят при (Я7±0,5)°С в течение 30 мин.

6.2.2.    Отмывание тест-препаратов от несвяэавшихся антител проводит по п. 4.3.

6.2.3.    Тест-препараты слегка подсушивают и помещают на капли раствора ФИТЦ-иммуноглобулинов аитиевн-кых в рабочем разведении, нанесенные на края предметных стекол во влажной каморе. Обработку тест-препаратов ФИТЦ-иммуноглобулинами антиевнными проводят при (37±0,5)^ЛС в течение 30 мин,

6.2.4.    Отмывание тест-препаратов от несвязаишнхсл ФИТЦ-иммуноглобулинов аытиевиных, подготовку препаратов для люминесцентной микроскопии и микроскопию проводят по пп. 4.3-4.б.

6.2.5.    Оценка результатов.

Проводят по интенсивности свечения антигенсодержащих клеток флуоресцирующих микроблишек положительных и отрицательных тест-препаратов, обработанных исследуемыми и контрольными сыворотками:

■    яркое, желто-зеленое или изумрудное свечение вирус-специфических антигенов в зараженных клетках положительных тест-препаратов, обработанных исследуемыми и контрольными сыворотками;

■    яркое, желто-зеленое или изумрудное свечение вирус-специфических антигенов в зараженных клетках положительных тест-препаратов, обработанных исследуемыми сыворотками, — результат положительный;

■    тусклое зеленое свечение в клетках положительных тест-препаратов — результат отрицательный.

В положительных тест-препаратах, обработанных специфической сывороткой, наблюдают яркое желто-зеленое

или изумрудное свечение вирусспецифических антигенов в зараженных клетках и отсутствие подобного свечения в специфических тест-препаратах, обработанных нормальной сывороткой; в отрицательных тест-препаратах, обработанных специфической и нормальной сыворотками, наблюдают тусклое зеленое свечение цитоплазмы клеток.

7. Выделение н идентификация вируса КЧС биопробой ла животных.

7.1.    Для постановки биопробы используют 4 здоровых ро-росят 2...4-месячного возраста, полученных от свиноматок, не вакцинированных против КЧС и не содержащих в сыворотке крови специфических антител к вирусу КЧС, и 2 поросят такого же возраста, иммунных против КЧС. Для иммунизации поросятам вводят по 1000 ИмДдр/см³ вирусва крины ЛК ВНИИ-ВВлМ против классической чумы свиней и через Ю...15сут после прививки используют для постановки биопробы.

7.2.    Животных помещают в разные боксы по два подсвинка в каждый станок.

7.3.    Двух не иммунных подсвинков содержат в отдел fa-ком помещении в качестве контрольных.

7.4.    Содержание и кормление животных должны соответствовать зоотехническим нормам.

7.5.    Непосредственно перед введением готовят экстракты 20% -ных суспензий лимфатических узлов и селезенки подозреваемых в заболевании классической чумой свиней (п. 3.5) и фильтруют через фильтр «Миллипор* (или его аналог) с величиной пор 0,22...0,48 мкм.

Равные объемы экстрактов органов смешивают, при этом общий объем смеси должен быть не менее 20 см^я,

7.6.    Подготовленный материал вводят двум восприимчивым и двум иммунным животным внутримышечно, соблюдая правила асептики, с внутренней стороны бедра в количестве З...5см⁸ каждому поросенку. За животными ведут клиническое наблюдение с ежедневным измерением температуры тела в течение 15сут,

7.7.    Оценка результатов.

7.7.1. При повышении температуры тела у невакцини-рованных поросят до 40,5...42°С, угнетении, отсутствии аппетита через 3...5 сут после введения исследуемого матери-

ала, на б...10-е сутки после повышения температуры тела выше нормы проводят убой поросят и отбор проб органов (п, 3.1), их подготовку (п. 3.5) и исследование (пп. 5.1...5.4) с целью реизоляции и идентификации вируса КЧС. При выделении н идентификации вируса результат биопробы считают положительным.

7.7.2. При установлении заболевания и гибели невак-циннрованных и вакцинированных против КЧС поросят проводят дифференциальные лабораторные исследования на африканскую чуму свиней.

8.    Постановка лабораторного диагноза.

Диагноз на классическую чуму свиней считают установленным в случае:

■    выделения и идентификации вируса КЧС в одной из исследуемых проб органов;

■    выявления специфических антител в сыворотках крови свиней, полученных из хозяйств, не применяющих вакцинацию против КЧС в течение последних 2 лет;

■    получения положительных результатов биопробы на животных, реизолнции и идентификации вируса.

9.    Срок исследований: вирусологических — 2...12 сут, серологических — 1...2сут, бионроба — 12...24 сут.

ПРИЛОЖЕНИЕ к Методическим указаниям по лабораторной диагностике классической чумы свиней.

1. Материалы и реактивы для постановки реакции прямой и непрямой иммунофлуоресценции.

1.1.    Предметные стекла по ГОСТ 9284-75, обезжиренные спирт-эфиром, взятыми в соотношении 1:1.

1.2.    Блажная камера (чашка Петри) или стерилизаторе увлажненной фильтровальной бумагой.

1.3.    Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСК) 0,01 М pH 7,2...7,5 готовят, смешивая:

а)    0,01 М раствор двузамещенного фосфата натрия (1,4 2 г NajjHPO* безводного или l.TSrNzHPO^HgO) с 0,85% хлористого натрия, воды дистиллированной до 1 дм³;

б)    0,001 М раствор однозамещенного фосфата калия (1,36 т КН_гР0₄) с 0,85% хлористого натрия, воды дистиллированной до 1дм³.

MWftttMWllU* НИММПОГП ••HT'llh II М»1 Ш IIIUaUNftUtJPTJI n i l Mi4lalfliiiNMIiitUllKllH iminimill»*

Для приготовления 0,01 M ФСБсpH 7,2...7,4 смешивают 850 см³ раствора «а* с 250 см³ раствора «б*.

1.4.    Штатив для отмывки препаратов наготавливают из пенопласта размером 10x10x2 см или из деревянной дощечки такого же размера.

1.5.    Байка цилиндрическая по ГОСТ 23932-70.

1.6.    НефлуорссцирующнЙ глицерин иди глицерин для люминесцентной микроскопии (фирмы «Merck* art,.4095 нлн любой другой фирмы).

1.7.    Парафин по ГОСТ 23683-79.

1.8.    Магнитная мешалка любого типа.

1.9.    Набор препаратов для иммунофлуоресцентной диагностики классической чумы свиней.

2. Поддержание к выращивание перевиваемой культуры клеток почки поросенка (РК-16).

2.1.    Работу проводят в изолированном, стерильном помещения. При одновременной работе с другими линиями клеток принимают меры для предотвращения контаминации одной линии клетками другой.

2.2.    Материалы, необходимые для поддержания к культивирования культуры клеток РК-15.

Среда Игла (МЕМ), содержащая L-глутамип (300 мг на 1 дм³).

Сыворотка фетальная крупного рогатого скота (КРС), не содержащая антител к вирусу диареи крупного рогатого скота.

■    0,25% раствор трипсина;

■    0,02% раствор версена;

■    пенициллин, стрептомицин;

■    пробирки биологические;

■    флаконы (матрасы) РУ;

ш покровные стекла 18x18;

■    стерильные центрифужные флаконы 100,.,500 см⁸;

■    рефрижераторная низкоскоростная центрифуга.

2.3.    Культивирование клеток.

2.3.1. Суспензию клеток готовят на среде Игла (МЕМ), содержащей 5... 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, прогретой при (56±2)°С в течение 30 мйн — ростовая среда. Ростовую среду считают пригодной для работы,

Лабораторная Лиинотико вирусных бсяетей животных вяштшхяяжтяяыщщшш и    *

если монослой формируется на 3...4-е сутки при посадач-ной концентрации клеток 100 ООО в 1 см³ и объеме суспензии 100 см³/флакон РУ. Монослой клеток должен представлять собой единый пласт клеток с четким разделением границ между ними. При наличии округлых клеток с вакуолями, включениями и другими признаками цитопатологии данную партию культуры выбраковывают.

2.3.2. Пассаж (пересев) клеток проводят после образования сплошного монослоя клеток. Для этого из матраса удаляют ростовую среду и вносят подогретую до (37±0,5)°С смесь 0,25%-ного раствора трипсина и 0,02% -лого раствора версена в соотношении 1:9. Матрас помещают в термо-статна 5...7 мин. Как только часть клеток начинает отслаиваться от стекла, 90...95% диспергирующего раствори удаляют, добавляют небольшое количество ростовсй среды и матрацы энергично встряхивают до полного отделения клеток от стекла и берут пробу суспензии для подсчета клеток. Суспензию клеток разводят ростовой средой до концентрации 100000 клеток/см³. К приготовленной суспензии клеток добавляют антибиотики из расчета 100 ЦД/см³ пенициллина и 100 мг/см³ стрептомицина и разливают во флаконы РУ по 100 см³ и по 2 см³ в пробирки с покровными стеклами. Инкубируют при (37±0,б)°С. В случае неудовлетворительного роста клеток и формирования монослоя ростовую среду меняют на свежую.

3. Титрование и определение инфекционной активности вируса КЧС. Вируссодержащую культуральную жидкость, разведенную от 10'¹ до ИГ* раствором Эрла или Хенк-са, вносят в объеме 0,5см⁸ в пробирки с культурой клеток РК-15, выращенной на покровных стеклах, при этом ростовую среду предварительно удаляют. На каждое разведение вируссодержащего материала берут но 4 пробирки с хорошим монослоем.

После 2 ч контакта при (37±0,5)°С вируссодержащин материал удаляют и вносят по 2 См^я поддерживающей среды и инкубируют 3 сут при (37±0,5)^ЙС. Затем пластинки из пробирок извлекают, высушивают, обрабатывают холодным ацетоном. После фиксации ацетон с препаратов удаляют- обсушиванием на воздухе (1...2 мин) и ставят РНИФ.

J. Волыни C»UUtil    297

iv i чишлмИ mw ими («MdBiHi ■iindimi ihUMaua»'na^i jrJHMM«iBMK*Bi_litL ■нкм^вмиа! ;«bh№ih

Титром вируса КЧС считают наибольшее его разведение, при котором обнаруживают флуоресцирующие микробляшки или единичные клетки, содержащие специфический цитоплазматический антиген вируса. Вычисляют титр по методу Рида и Мснча (или его модификации), выражая его в клеточно-культуральных 60%-ных инфекционных дозах (ККИДн/объем).

4. Приготовление тест-препаратов для постановки РНИФ.

4.1.    Перевиваемую культуру клеток почки поросенка (РК-15), выращенную на покровных пластинках ь пробирках, заражают стандартным вирусом КЧС (штамм вШи-Мынь*) в дозе 0,001...0,0001 ККИД₅₀/клетка в объеме 0,5 см^я на пробирку, предварительно удалив ростовую среду, и помещают в термостат при (37±0,5)°С на 2 ч. Затем, удалив вируссодерж&щую жидкость, вносят поддерживающую среду. Зараженную культуру клеток инкубируют в условиях термостата при (37±0,о)°С.

4.2.    Через 48 ч инкубации пластинки с зараженной культурой клеток извлекают, укрепляют в расщепы спичек, высушивают, обрабатывают холодным ацетоном в течение 10 мин и хранят в герметически закрытом контейнере при температуре -Ю...-12°С. Отрицательные тест-препараты готовят аналогично, исключая этап заражения культуры клеток.

i mu 'hum m in тиши ;aaiuiifcw;ii№i: ш «ши m -ran i iiniiiixiii nun шиш i;vu

КРАТКИЙ СЛОВАРЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ВЕТЕРИНАРНЫХ ТЕРМИНОВ

Антигены (анти + rpe-ч. genes — порождающий) — чужеродные для организма высокомолекулярные органические вещества коллоидной структуры (Селин, белково-липидные и белкови-солисахаридные комплексы), способные при поступлении (ине-дении парентерально) вызывать с нитез особых глобулинов-антител и вступать в специфическое взаимодействие с ними.

Антитела (анти. + тело) — противотела — специфические белки (иммуноглобулины), образующиеся в организме под воздействием антигенов. Они накапливаются в сыворотке крови и тканях, вступают в специфическую связь с соответствующими антигенами и разрушают' или обезвреживают их.

Биологическая проба (бнопроба) — один из методов диагностики инфекционных болезней с помощью заражения патологическим материалом подопытных животных (куриных эмбрионов, культур клеток) и их исследования.

Внрион — полноценная внеклеточная вирусная частица.

Вирусовыделение — выделение возбудителей инфекции из организма больного животного или вирусокосителя.

Вирусоиоситслъство — наличие возбудителя инфекции в определенных органах и тканях клинически здорового животного, нс сопровождающееся иммунологической перестройкой организма.

Вирусы (лат. virus — яд) — облигатные внутриклеточные паразиты, отличающиеся от растительных и животных организмов малыми размерами, отсутствием клеточного строения и автономного метаболизма, наличием только одного типа нуклеиновой кислоты и деэъюнктивным способом размножения.

Краткий словарь иакипзоеакных ветеринарных терминов ■w * «мигам • au> к *малпти<) hiemiimiw—*«ич

В. беэоболочечиые — вирусы, в структуре которых отсутству-ет лнпопротеидная оболочка.

В. оболочечные — вирусы, в структуре которых присутствует липопротеидная оболочка.

Вкрусоскопмя {вирусы +■ skopeo — смотрю, наблюдаю) — метод микроскопического изучения морфологии вирусов.

Гемаггян/гинация (греч. huima — кровь + agglutinulio — склеивание) — склеивание и выпадение в осадок эритроцитов под воздействием вирусов, бактерий, токсинов идр., способных адсорбироваться на поверхности эритроцитов, в также ге-м агглютининов.

Гемадсорбцня (греч. hatma— кровь+ adsorbtto— поверхностное поглощение) — способность культур клеток, вереженных вирусами, адсорбировать эритроциты различных животных, что объясняется включением в плазматическую мембрану синтезирующихся вирусных белков.

Диагностика (греч. diagnoetlhos — способный распознавать) — раздел клинической ветеринарии о методах исследования животных для распознавания их болезкей и состояния организма с целью назначения необходимого лечения и профилактических мероприятий.

Диагностический набор — набор стандартных препаратов, используемых для постановки диагноза (антиген, специфическая и контрольная сыворотки и др.).

ДНК-зондов метод — метод генодиагностики, основанный на способности меченой одчоцепочечной молекулы ДНК взаимодействовать с комплементарной ей молекулой нуклеиновой кислоты определенного вируса с образованием двухцепочечной структуры.

ДНК-сидержащме вирусы — вирусы, имеющие один тип нуклеиновой кислоты — ДНК, у большинства она представлена двухцепочечной структурой, у некоторых — одной цепью.

Идентификация (лат- identlflco — отождествляю) — признание тождественности, опознание-определение видовой (типовой) принадлежности микроорганизма на основании всестороннего изучения его Свойств.

Иммуноферме нтный анализ — группа методов, пооволяю-щих выявлять комплекс пптиген — антитело с помощью субстрата, который расщепляется ферментом (пероксидазой, щелочной фосфатазой и др.) с появлением окрашивания.

Инактивация вирусов (лат. inactivu» — неактивный) — уничтожение инфекционной активности вирусов путем повреждения генома физическим или химическим воздействием.

656    Лабораторная    йисяностика    еирисньх    болезней    животных

ЦГМЯГ ИМк l«l|U*M«a Ь>| £* 1*«1» -IfllMW l| ki.iln Л1ШИ1 UN MbJIll    Ilk    MIHMlMl    UMIHI

Индикация возбудителя инфекции (лат. indicatio — указа* кие) — выявление и идентификация патогенных микроорганизмов в различных объектах.

Инокуляции возбудителя (лат. tncculatlo — прививка) — введение возбудителя путем инъекции (искусственное заражение или внесение его в организм животного членистоногими переносчиками при укусах).

Консервирование вирусов (лат. conservare — сохранять) — общее название методов воздействия физическими и (или) химическими факторами на какие-либо объекты с целью длительного сохранения в них вирусов.

Контаминация (лат. contaminoUo — смешение) — обсеменение поверхности тела животного, предметов ухода, почвы, воды, кормов, биопрепаратов и других объектов патогенным к микроорганизмами.

Культивировал иг ни рус пн — выращивание вирусов в искусственных условиях.

Культуры клеток (клеточные культуры) — клетки многоклеточного организма, живущие вне его в искусственно созданных условиях среды.

Куриный змбрион —оплодотворенное куриное яйцо, выдержанное в инкубаторе.

Лабораторные животные — животные, используемые в лабораториях при проведении исследований (мыши, крысы, кролики, морские свинки, хомяки, голуби и др.).

Лиофилнзация (греч. 1уо ■— растворяю + phllec — люблю) высушивание предварительно замороженного материала в глубоком вакууме.

Моноклональные антитела — строго специфические антитела, способные выявить минимальные различил в химическом составе и пространственной конфигурации молекул, являются продуктом отдельных клонов антителопродуцирующих клеток.

Парные сыворотки — сыворотки, взятые в самом начале заболевания и 2...3 недоли спустя. Повышение титра антител в 4 раза и более считается основой положительной реакции.

Пассаж (фр. passage — переход) — последовательное заражение восприимчивых объектов (животные, куриные эмбрионы, культуры клеток) микроорганизмами.

Полимеразная цепная реакция (от англ. Polymerase: Chain Reaction, ПЦР) — метод генодиагностики, основанный на многократном увеличении копий строго определенных фрагментов

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕН ЖИВОТНЫХ

Составители;

JL И, Барышников,

В. В« Разумовская

Издание второе, исправленное

ДОПУЩЕНО

Мшшслирстеом сельского хозяйства РФ в качестве учебного пособил длл студентов ву^ов. обучающихся по нилриолепию подготовки (специальность) ¹ Ветеринария¹

ДОПУЩЕНО

УМО вузов РФ по образованию в области зоотехнии и ветеринарии и Качестве учебного посоОмг длл сг.уОонтоо вузов, обучающихся па направлению подготовки (специальности) «Ветеринария» (квалификация (степень) о Ветеринарный врачя)

Краткий словарь испояъзсейкхых ветеринарных терм unto    657

ими» иш т тттттттттятлтттшштшттыяшяшвшятшаштяшщттт ттштшшшшт

молекулы ДНК вируса при помощи фермента термостабильной ДНК-нолимеразы.

Реакции гемаилютииации (РГЛ) — метод обнаружения и идентификации вирусов, основанный на способности многих вирусов, обладающих тканевым тропизмом, агглютинировать эритроциты определенных видов животных.

Реакция иммупофлуоресценции (РИФ) (лат. fluorescent — светящийся)— серологическая реакция, основанная на взаимодействии антиген — антитело, при этом один из компонентов, участвующий в реакции, связан с флуоресцирующим красителем.

Реакция нейтрализации (PH) *— метод идентификации вируса, основанный на феномене потери им ннфекциопностк в результате взаимодействия по специфическими антителами.

Реакция связывания ком цемента (РСК) — метод серологического исследования, основанный на способности образующегося комплекса антиген — антитело связывать комплемент, что выявляется по отсутствию гемолиза при добавлении гемолизина н эритроцитов.

Реакция торможения гем агглютинации (РТГА) — метод идентификации вируса или выявления противовирусных антител в сыворотке крови, основанный на феномене отсутствия агглютинации эритроцитов вирусом, в присутствии специфических к нему антител.

РНК-содержащне вирусы — вирусы* имеющие один тип нуклеиновой кислоты — РНК, у большинства опа представлена одной цепью, у некоторых — двухцел очечной структурой.

Серовариант — самостоятельная группа внутри опредслон-ного вида и серогруппы (серотипа) микроорганизмов, обусловленная наличием интигенов, отличающихся от интигенов других микроорганизмов этого вида и серогруппы (серотипа), что выявляется с помощью серологических реакций.

Серогруппа (серотип) — самостоятельная группа внутри определенного вида микроорганизмов, обусловленная наличием антигенов, отличающихся от антигенов других микроорганизмов этого вида, что выявляется с помощью серологических реакций.

Серологические реакции — реакции, широко используемые при постановке диагноза инфекционных болезней, методы обнаружения антител и антигенов в крови и других тканях.

Сыворотка крови (лат. serum — сыворотка +    —

кровь) — составная часть криви* представляющая собой плазму, из которой удалены форменные элементы и фибрин и процессе свертывааия крови.

ВБК 48.7я73 Л 12

Л 12 Лабораторная диагностика вирусных болезней животных / Сост. Л. И. Барышников, В. В. Разумовская: Учебное пособие. — 2-е изд., испр. — СПб.: Издательство *Лань>, 2015.— 672с.: ил.— (Учебники для вузов. Специальная литература).

ISBN 978-5-8114-1882-4

Учебно© издание содержит действующие методические указании, наставлении и инструкции по лабораторно# диагностике вирусных болезней животных, утвержденные Министерством сель* ского хозяйства СССР, РФ и Росселнхоанадзороы РФ. Документы сиатематюшрованы по видам животных, в большинстве прошли многолетнюю агшробацию в Алтайской краевой ветеринарной лаборатории и включены ь #Перечень нормативной документации, разрешенной для испагшюшшии в государственных исторниариых лаГюраторкях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, в также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения* (пс состоянию на июль 2011 г.>. Приводятся предметный указатель к бчблногрпфичеасий список.

Предназначено для студентов, обучавшейся по сцециллыгос-ти 4Ветеринария» и направлению *Ввтерииарио«санитарная экспертиза*, ветеринарных врачей и лаборантов аетеринарпых лабораторий.

ББК 48.7к73

Рецензенты:

И. И. ГУСХАВС К И Й —• доктор ветеринарных наук, профессор кафедры ыикр^иологин, эпизоотологии, паразитологии и ВСЭ Алтайского государственного аграрного университета;

В. И. ПЛЕШАЛОВА — доктор ветеринарных наук, профессор, зав. кафедрой ветеринарией микробиологии, Вирусологии к иммунологии Омского государственного аграрного университета им. П. А. Столыпина;

В. А СИНИЦЫН — доктор ветеринарных наук, зав. отделом ФГБУ «Новосибирская межрегиональная ветеринарная л©бори*

тория».

Обложка Издательство «Лань*,2015 Е. А. ВЛАСОВА © Коллектив авторов, 2015 © Ипднтсльство «Лань»,

художественное оформление, 2015

5.

БОЛЕЗНИ СВИНЕЙ

КЛАССИЧЕСКАЯ ЧУМА

5,1.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

(утверждены 30 декабря 1996 г„ Л« 13 4-2/809)

1.    Общие положения.

1.1.    Лабораторная диагностика классической чумы свиней (КЧС) основана на:

■    обнаружении антигена вируса КЧС реакцией примой иммунофлуоресценции в клетках мпоков-отпечатков проб органов;

■    выделении эпизоотического вируса КЧС из патологического материала инокуляцией перевиваемой культуры клеток почки поросенка (РК-16) и его идентификации реакцией прямой иммунофлуоресценцил;

■    обнаружении специфических антител в сыворотках крови переболевших классической чумой свиней реакцией нейтрализации флуоресцирующих кикробляшек или реакцией непрямой икмуяофлуоресценцин;

Я выделении и идентификации вируса КЧС биопробой на

ЖИВОТНЫХ.

Для постановки иммунофлуоресцентных реакций используют «Набор препаратов для иммунофлуоресцентнсй диагностики классической чумы свиней».

1.2.    При проведении лабораторной диагностики руководствуются «Правилами работы и охраны труда в ветеринарных лабораториях», утвержденными Министерством сельского хозяйства СССР 14 января 1975 г.

2.    Схема проведения лабораторных исследований.

2.1. Отбор проб органов и подготовка патологического

материала для исследования.

2.2.    Приготовление мазков-отпечатков для постановки реакции прямой иммунсфлуоресценции и экстрактов проб исследуемых органов для инокуляции культуры клеток (проводится одновременно).

2.3.    Постановка реакции примой иммуиофлуоресцен-ции (РПИФ) с целью обнаружения специфического антигена вируса КЧС в мазках-отпечатках из проб органов. По положительным или отрицательным результатам реакции ставят предварительный диагноз.

2.4.    Инокуляция культуры клеток РК-1Б экстрактами суспензий проб исследуемых органов с последующей постановкой РПИФ для обнаружения и идентификации эпизоотического вируса КЧС.

2.5.    Исследование сывороток крови свиней в реакции нейтрализации флуоресцирующих микробляшек (РНФМ) или реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ). Серологические исследования проводит в тех случаях, когда пробы крови получены ог свиней, подозреваемых в пере-болеванни классической чумой (ретроспективные исследования из хозяйств, не применяющих вакцинацию против КЧС в течение последних 2 лет.

2.6.    Постановку Сиопробь: проводят только по указанию Департамента ветеринарии, когда при подозрении на КЧС на основании эпизоотологииеского обследования получены отрицательные результаты лабораторных исследований.

3. Отбор и подготовка проб к исследованию.

3.1.    Для исследования берут лимфатические узлы (подчелюстные и мезентериальные), части миндалин, селезенки, легкого, почки, кровь и костный мозг (из грудной или трубчатой кости) от 3...5 животных, убитых в стадии аю-нии, или не позже чем через 2...3ч после гибели,

3.2.    Пробы отбирают в стерильные флаконы массой

5... 10 г каждый, герметически укупоривают резиновыми пробками.

Флаконы снаружи обрабатывают 5%-иым раствором едкого натра или осветленным 20%-ным раствором хлорной извести, обертывают марлей, смоченной тем же раствором, укладывают в полиэтиленовый пакет и помещают в

термос со льдом. В случае длительной транспортировки (более 2 сут) пробы органов замораживают. Термос помещают в металлический контейнер, опечатывают и доставляют с нарочным в лабораторию с сопроводительным документом.

3.3.    При ретроспективной диагностике направляют5...10 проб крови (по 5...8 см³) от свиней, подозреваемых в перебо-леванин классической чумой. Кровь берут не ранее чем через 16...20сут после установления признаков болезни.

3.4.    В лаборатории пробы селезенки, лимфатических узлов, легкого, почки каждого животного очищают от жировой и соединительной тканей и готовят по 2 мазка-отпечатка каждого органа для РПИФ. Для этого обезжиренные спирт-эфиром (1:1) покровные стекла укрепляют в расщепах деревянных палочек с условными номерами и делают мазок-отпечаток, прикладывая стекло к поверхности среза исследуемого органа (каждый отпечаток делается новым срезом органа). Мазки-отпечатки высушивают на воздухе при комнатной температуре (30...60 мин) и помещают в химический стакан с холодным (2...4°С) ацетоном. Фиксацию проводят в камере бытового холодильника при (4±2)*С в течение 10...15 мин. Затем мазкк-отпечатки извлекают из ацетона, высушивают и используют для постановки РГШФ. Хранят мазки-отпечатки при (4.t2)°C не более 3 сут.

Контрольные отрицательные мазки-отг.ечатки готовят заранее, используя пробы органов от здоровых животных.

3.5.    Навески каждого органа (примерно по 2 г) отдельно растирают в ступке со стерильным порошком из стекла иди песком и готовят 20%-ную суспензию на стерильном 0,85%-иом растворе хлористого натрия. Приготовленные суспензии дважды замораживают при -10...-12°С, оттаивают при 30...37°С и центрифугируют в рефрижераторной центрифуге при 2500...3000 об/мин в течение 10...15 мин. Надосадочную жидкость (экстракт) отсасывают, вносят 100 ЕД/см³ пенициллина и 100 мг/см³ стрептомицина (конечная концентрация), выдерживают 1 ч при (37±0,5)°С и готовят разведения 1:5 и 1:10 на стерильном 0.85%-ном растворе хлористого натрия. Для инокуляции культуры клеток используют как исходные (неразведенные) экстракты, так и разведенные.

288 Ил i и»

3.6. Для получения сыворотки пробы крови выдерживают' 1 ч в термостате при (ЗТ^Ю.б)"^ или при комнатной температуре до образования сгустка. Сгусток обводят и пробы переносят в камеру бытового холодильника на

10...14 ч. Сыворотку отсасывают и используют для исследования.

4. Обнаружение антигена вируса КЧС реакцией прямой иммунофлуоресценции в мазках-отпечатках.

4.1.    Содержимое ампулы ФИТЦ-иммуноглобулинов КЧС растворяют 0,5 см⁸ дистиллированной воды и готовят рабочее разведение препарата на 0,01 М фосфатно-солевом буферном растворе — ФСБ (приготовление буферного раствора в Приложении, п. 1), указанное на ампуле.

4.2.    Препараты мазков-отпечатков, приготовленные по п, 3.4, помещают на капли ФИТЦ-иммуноглобулинов КЧС, нанесенные в рабочем разведении на края предметных стекол, находящихся во влажной камере, к выдерживают при (37±0,5)^СС в течение 30 мнн.

4.3.    Препараты снимают с предметных стекол, ополаскивают ФСБ и свободными концами спичек укрепляют в гнездах отмывочного штатива. Штатив помешают в цилиндрическую банку с раствором ФСБ, установленную на магнитную мешалку. Отмывание мазков-отпечатков от несвя-завшихся или неспецифически связавшихся ФИТЦ-иммуноглобулинов ведут в течение 20 мин в темном месте, сменяя буферный раствор через 10 мин.

4.4.    После отмывания препараты ополаскивают дистиллированной водой, подсушивают на воздухе и помещают на капли нефлуоресцирующего глицерина, разведенного раствором ФСБ в соотношении 9:1, нанесенные на прозрачные обезжиренные предметные стекла. Края препаратов заливают расплавленным парафином.

4.5.    Люминесцентную микроскопию препаратов проводят в сине-фиолетовом свете при освещении их сверху, через объектив на микроскопах типа «ЛЮМАМ». Возбуждающий светофильтр ФС-1-2 или СС-15-2; запирающий ЖС-18 + ЖЗС-19. Препараты последовательно просматривают при увеличении 7x10, 7x40 (*сухая» микроскопия), затем при необходимости в иммерсионной системе при уве-

личении 7x60, используя нераэведенный нефлуоресцирую-щпй глиперин.

4.6.    Специфическую флуоресценцию учитывают в лимфоидных клетках паренхимы селезенки, лимфатических узлов, легкого, расположенных группами, а также а эпителиальных клетках миндалин и клетках эпителия почечных канальцев, расположенных группами. Флуоресценцию обнаруживают в виде яркого, зеленого, диффузного свечения цитоплазмы антигеисодержащих клеток.

4.7.    Учет и оценка результатов.

Проводят по условной четырехкрестовой шкале при увеличении 5x40: (++++, +++, ++, +) обнаружение во всех полях зрения множества групп клеток с яркой зеленой цитоплазматической флуоресценцией — результат положительный; (1) обнаружение в 5...10 полях зрения единичных групп, состоящих из 3...5 клеток с зеленой цитоплазматической флуоресценцией — результат сомнительный; отсутствие в мазках-отпечатках клеток с цигошшзматиче-ской флуоресценцией. Свечение клеток тускло-зеленое — результат отрицательный.

Отдельно расположенные клетки с флуоресценцией цитоплазмы или ядра не учитывают.

5. Выделение эпизоопгческого вируса КЧС из патологического материала инокуляцией перевиваемой культуры клеток почки поросенка (РК-15) и идентификация его реакцией прямой иммупофлуоресценции.

5.1. Подготовленные для исследования экстракты 20% -ных суспензий проб органов (п. 8.5) вносят по 0,5,..0,6 см® в пробирки с культурой клеток РК-15, выращенной на стеклянных пластинках из покровных стекол (выращивание культуры клеток РК-15 в Приложении, п. 2), предварительно удалив ростовую среду', Для пнокуляции суспензии каждого органа берут не менее 8 пробирок.

Пробирки помещают в термостат (37±0,5)°С на 2 ч. По истечении указанного времени ииокулюм удаляют, монослой клеток однократно промывают средой Игла (МЕМ) без сыворотки. Затем в пробирки вносят по 2,0см³ питательной среды, содержащей 2% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (поддерживающая среда), и инкубируют

Лаборокорнал duaiitiKтина вирусных болезней животных

---Ч»»Т—

24...9Сч, Через 24 ч после инокуляции поддержииающую среду меняют на свежую. В качестве контроля культуры клеток (отрицательные препараты) 8 пробирок оставляют интактными, предварительно сменив ростовую среду нп поддерживающую.

5.2.    Каждые 24 ч по 2 пластинки с культурой клеток, инокулированной иследуемым экстрактом суспензии квж-дою органа, извлекают и и пробирок, вставляют и расщепы спичек с номерами, обсушивают на воздухе до полного удаления влаги и фиксируют холодным ацетоном в течение 10 мин (п. 8.4).

5.3.    С препаратами, приготовленными по п. 5.2, ставят РПИФ и проводят люминесцентную микроскопию (пп.4.2...4.5).

5.4.    Оценка результатов.

5.4.1.    При обнаружении специфической желто-зеленой или зеленой диффузной флуоресценции в цитоплазме клеток, расположенных группами («флуоресцирующие микробляшки»), и отсутствии ее в отрицательных препаратах вирус КЧС считают выделенным и идентифицированным, а результат положительным.

5.4.2.    В случае обнаружений тусклой, диффузной зеленой флуоресценции в клетках препаратов и при отсутствии «флуоресцирующих микробляшек» после 96-чьсовой инкубации проводят 2 дополнительных пассажа.

Для этого пробирки с инокулированной культурой 1-го пассажа, взятые через 96 ч культивирования (п. 5.1), дважды замораживают при -10...-12*0, оттаивают при 30...37°С и культуральную жидкость используют в качестве нноку-люма для проведения 2-го пассажа <пп. 5.1...5.4). 3-й пассаж проводят аналогично.

В случае отсутствия «флуорецирующих микробляшек» в третьем пассаже результат считают отрицательным.

6. Обнаружение специфических антител в сыворотках крови переболевших классической чумой свиней реакцией нейтрализации флуоресцирующих микробляшек и реакцией непрямой иммунофлусресценциии.

6.1. Постановка реакции нейтрализации флуоресцирующих микробляшек (РНФМ).

1

САНКТ-ПЕТЁРВУ РГ • МОСКВА • КРАСНОДАР • •2015-