ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ

'САНКТ-ПЕТЕРБУРГ ■ • МОСКВА •

»КРАСНОДАР * •2015'

474    ZaCopar.vi>iuui    диагностика вирусных болезней жиастиих

мпи»4«м«.»1    ии>»ишшин—а—urti i naiii ШШШШШтшИЧ—Щ

3.13.    Для практического использования биологическая активность сухой вирусвакцины из штамма «В1» должна быть не ниже 1О^7,0ЭИД_5П/мл, из штаммов «Ла-Сота* и «Бор-74 ВГНКИ» — 10^7,4 ЭИД_ЛГ)/мл, а из штамма «Н* — не ниже Ю⁷-°ЭЛД₆₀/мл.

3.14.    Цифровые значения антилогарифмов биологической активности вирусвакцин определяют при помощи таблицы В. М. Брадиса по цифровым показателям мантиссы к характеристики (табл. 35).

Т в б л и ц. а Я& Значения функции десятичных антилога рифтов

'\ Д«ся- \ тvie Сотые \ о 1 i 8 4 G С 7 8 В 1 0 ЮОО 12Е9 1686 1996 2512 3162 3981 6012 6310 7843 1 1023 1288 1622 2042 2670 3236 4074 5129 6467 8128 2 L047 1318 1660 2089 26ЭО 3311 4169 6248 6607 8318 [ 8 1072 1340 1698 2138 2692 3388 4366 6370 6761 8611 4 1006 1380 1738 2188 2764 3467 4360 6496 6918 8710 б 1122 1413 1778 2239 2818 3648 4467 6623 7079 8913 В 1148 1446 1820 2291 2884 3631 4671 Б754 7244 9120 1 1176 1479 1862 2.344 29R1 3716 4677 6888 7413 9338 Я 1202 1514 1905 2399 3020 3802 4786 6036 7686 9660 В 1230 1649 1960 2456 3090 3890 4898 6166 7762 9772

Пример. Биологическая активность вакцин Ю⁸-⁰⁰ и Ю⁸'²⁵ ВИД53/мл имеет активность в цифровом выражении lrlOOOOOООО и 1:177 800000 ЭИД_е0 соответственно, т.е. искомое число антилогарифма 8,26 (8 — характеристика, 26 — мантисса) определяется показателем мантиссы на месте пересечения десятых и сотых цифровых значений (табл. 35), а характеристика указывает на количество знаков в цифровом выражении.

3.16. Результаты титрования записывают в соответствующей книге (журнале) учета по произвольной форме.

б. Болеть птиц

им 4.ШЗ-Й iui julvaiuiXMIVIWMinM iinunraaipM ярnutiiu м ак <n>HWiM>w>MXWhhm

В книге указывают наименование биопрепарата it учреждения, его изготовившего, номер серии и дату ее изготовления, дату поступления на исследование и наименование хозяйства, откуда препарат поступил.

шшшшштаmhwwiiuiminnimш aiiwiiinaiiiinnшин имeMini

КРАТКИЙ СЛОВАРЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ВЕТЕРИНАРНЫХ ТЕРМИНОВ

Антигены (анти + грсч. genet — порождающий) — чужеродные для организма высокомолекулярные органические вещества коллоидной структуры (белки, белково-липидные и белковополисахаридные комплексы), способные при поступлении (введении парентерально) вызывать синтез особых глобулинов-антител И вступать в специфическое взаимодействие с ними.

Антитела (анти, + тело) — противотела — специфические белки (иммуноглобулины), образующиеся в организме под воздействием антигенов. Они накапливаются в сыворотке крови и тканях, вступают в специфическую связь с соответствующими антигенами и разрушают или обезвреживают их.

Биологическая проба (биопроба) — один из методов диагностики инфекционных болезней с помощью заражения патологическим материалом подопытных животных (куриных эмбрионов, культур клеток) и их исследования.

Внрион — полноценная внеклеточная вирусная частица.

Вирусовыделение — выделение возбудителей инфекции из организма больного животного или вирусоиосителл.

Внрусоиосительство — наличие возбудителя инфекции в определенных органах и тканях клинически здорового животного, не сопровождающееся иммунологической перестройкой организма.

Вирусы (лат. virus — яд) — облигатные внутриклеточные паразиты, отличающиеся от растительных и животных организмов малыми размерами, отсутствием клеточного строения и автономного метаболизма, наличием только одного типа нуклеиновой кислоты и деэъюнктивным способом размножения.

Кроткий слсоарь использованных аетеринарных терминов    665

■ >м««ипмit a* ■iHMiiHnMемтеикшиеKoran*kh»j и-    ч«»

В. беэоболочечныс — вирусы, в структуре которых отсутствует липопротеидная оболочка.

В. оболочечные — вирусы, е структуре которых присутствует липопротеидная оболочка.

Вирусоскопия (вирусы -I- skopeo — смотрю, наблюдаю) — метод микроскопического изучения морфологии вирусов.

Гемагглнугинация (греч. haima— кровь + agglutination склеивание) — склеивание и выпадение в осадок эритроцитов под воздействием вирусов, бактерий, токсинов идр., способных адсорбироваться на поверхности эритроцитов, в также ге-магглютииицов.

Гем&дсорбцня (греч. haima— кровь + adeorbtio— поверхностное поглощение) — способность культур клеток, заражен-ных вирусами, адсорбировать эритроциты различных животных, что объясняется включением ъ плазматическую мембрану синтезирующихся вирусных белкой.

Диагностика (греч. diagncutlhos —способный распознавать) — раздел клинической ветеринарии о методах исследования животных для распознавания их болезней и состояния организма с целью назначения необходимого лечения и профилактических мероприятий.

Диагностический набор — набор стандартных препаратов, используемых для постановки диагноза (антиген, специфическая и контрольная сыворотки к др.),

ДНК-зондов метод — метод генодиагностики, основанный на способности меченой одиоцепочечной молекулы ДНК взаимодействовать с комплементарной ей молекулой нуклеиновой кислоты определенного вируса с образованием двухцепочечной структуры.

ДНК-сидержащие вирусы — вирусы, имеющие один тип нуклеиновой кислоты— ДНК, у большинства она представлено двухцепочечной структурой, у некоторых — одной цепью.

Идентификация (лат. tdentlflco — отождествляю) — признание тождественности, опознание-определение Видовой (типовой) принадлежности микроорганизма на основании всестороннего изучения его свойств.

Иммунофермеитный анализ — группа методов, пооволяю-щих выявлять комплекс антиген — антитело с помощью субстрата, который расщепляется ферментом (пероксидвзой, щелочной фосфатазой и др.) с появлением окрашивания.

Инактивация вирусов (лат. inactivue — неактивный) — уничтожение инфекционной активности вирусов путем повреждения генома физическим или химическим воздействием.

656    Лабораторная оцагчостика вируснм {ад«к«i тиютхыг

iMfi MHiiiwaiMR MjKMjiatMMianMNMiiiM *n Mintii*мамамt » м\итшт мим »иин>- г»1Млп.»тит«и»1Ш щ

Индикация возбудителя нкфекцни (лат. tndicaiio — указание) — выявление и идентификация патогенных микроорганизмов в различных объектах.

Инокуляция возбудителя (лат. Inoculattc — прививка) — введение возбудителя путем инъекции (искусственное заражение или внесение его в организм животного членистоногими переносчиками при укусах).

Консервирование вирусов (лат. conservare — сохранять) — общее название методов воздействия физическими и (или) химическими факторами на какие-либо объекты с целью длительного сохранения в них вирусов.

Контаминация (лат. corUamfnatto — смешение) — обсеменение поверхности тела животного, предметов ухода, почвь:, воды,

Jгормон, биопрепаратов н других объектов патогенными микроорганизмами.

Культивирование вирусов — выращивание Вирусов в искусственных условиях.

Культуры клеток (клеточные культуры) — клетки многоклеточного организма, живущие вне его в искусственно созданных условиях среды.

Куриный вибрион — оплодотворенное куриное яйцо, выдержанное б инкубаторе.

Лабораторные животные — животные, используемые в лабораториях нри проведении исследований (мыши, крысы, кролики, морские свинки, хомяки, голуби и др.).

Лиофнлизация (греч. 1уо — растворяю + phileo — люблю) — высушивание предварительно замороженного материала в глубоком вакууме.

Моноклональные антитела — строго специфические антитела, способные выявить минимальные различил в химическом составе и пространственной конфигурации молекул, являются продуктом отдельных клонов антителопродуцирующих клеток.

Парные сыворотки — сыворотки, взятые веемом начале заболевания и 2...3 недели спустя. Повышение титра антител в 4 раза и более считается основой положительной реакции.

Пассаж (фр. passage — переход) — последовательное заражение восприимчивых объектов (животные, куриные эмбрионы, культуры клеток) микроорганизмами.

Полимеразная ценная реакция (от англ. Polymerase Chain Reaction, ПЦР) — метод генодиагностики, основанный на многократном увеличении копий строго определенных фрагментов

Краткий словарь использованиях ветеринарных терминов

mui цитат aniH!»»ww4M^iwii4iwiwj—n»t штштшшшшшшяш

молекулы ДНК вируса при помощи фермента термостибмльной ДНК-иолимериэы.

Реакция гем агглютинации (РГА) — метод обнаружения и идентификации вирусов, основанный на способности многих вирусов, обладающих тканевым тропизмом, агглютинировать эритроциты определенных видов животных.

Реакция мммуиофлуоресценции (РИФ) (лат, fluorescent — светящийся) — серологическая реакция, основанная на взаимодействии антиген — антитело, при этом один из компонентов, участвующий в реакции, связан с флуоресцирующим красителем.

Реакция нейтрализации (PH) — метод идентификации вируса, основанный на феномене потери им инфекционности в результате взаимодействия со специфическими антителами.

Реакция связывания компемента (РСК) — метод серологического исследования, основанный на способности образующе-гося комплекса антиген — антитело связывать комплемент, что выявляется по отсутствию гемолиза при добавлении гемолизина и эритроцитов.

Реакция торможения гемагглютинации (PITA) — метод идентификации вируса или выявления противовирусных антител в сыворотке крови» основанный на феномене отсутствия агглютинации эритроцитов вирусом, в присутствии специфических к нему антител.

РНК-содержащке вирусы — вирусы» имеющие один тип нуклеиновой кислоты — РНК, у большинства она представлена одной цепью, у некоторых — двухцепочечной структурой.

Серов арка иг самостоятельная группа внутри определенного вида и серогруппы (серотипа) хикрооргапизмов, обусловленная наличием антигенов, отличающихся от антигенов других микроорганизмов этого вида и серогруппы (серотипа), что выявляется с помощью серологических реакций.

Серогруппа (серотип) — самостоятельная группа внутри определенною вида микроорганизмов, обусловленная наличием антигенов, отличающихся от антигенов других микроорганизмов этого вида, что выявляется с помощью серологических реакций.

Серологические реакции — реакции, широко используемые при постановке диагноза инфекционных болезней, методы обнаружения антител и антигенов в крови и других тканях.

Сыворотка крови (лат. serum — сыворотка 4 sanguis •— кровь) — составная часть кропи» представляющая собой плазму, из которой удалены форменные элементы и фибрин в процессе свертывания крови.

Тельца включения — своеобразные морфологические образования, обнаруживаемые в цитоплазме или ядрах клеток определенных тканей при некоторых вирусных инфекциях и состоящие из скопления еириоьов и вирусных белков.

Термолабкльностъ (гроч. thermos — теплый + лат. labilis — нестойкий) — неустойчивый к тепловому воздействию, изменяющийся при нагревании.

Термостабилькость (греч. thermos — теплый + лат. stobUis — неизменный) — сохраняющий свои свойстве при нагревании.

Титр вируса — концентрация инфекционных единиц вируса в определенном объеме материала.

Цнтопатогеиное действие вирусов (ЦНД, дитопатический аффект) — специфическая морфологическая деструкция (разрушение) и функционолыгпя патология зараженных вирусами клеток в культурах.

Штамм (нем. etamm —- род, корень) — культура микроорганизмов одного вида с одинаковыми морфологическими и биологическими свойствами.

Элементарные тельца — см. Вирион (2, 3).

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ

СПИСОК

1.    Лабораторные исследования в ветеринарии. Вирусные, риккетсиозные и паразитарные болезни : справочник / под ред. В. И. Антонова. — М.: Агронроыиздат, 1987. — 240 с.

2.    Вакрлое, И.А. Эпизоо то логический олопарь-справочник / И. А, Бякулов.Г. Г. Юрков, В. А, Ведерников (и др,]. — М.: Ро ссельхо зиз дат, 1986.

3.    Нымм, Э. М. Словарь ветеринарных микробиологических и вирусологических терминов / Э. М. Нымм, К. А. Петерсон, Э. А. Аоъср [идо.]. — М.: Росагропромиэдат, 1989.

limit IP ПИШИ. M 111 11Ш1ГЮ11ШШШШ1Ш1Ш1UdMlMl Ё*ШШ

ПРЕДМЕТНЫЙ

УКАЗАТЕЛЬ

Агар мяпо-пептонный (МПА) 101, 109, 125, 326, 387, 444, 466, 476, 483, 642, 688 Альбумин бычий 7, 226, 618 Аппарат Киппа 126, 480 Бульон мясо-пептокиьш (МПБ) 78, 101, 109, 126, 326, 444, 466, 470, 483, 496, 542, 588 —    триптооо-фосфатный 519 Буфер вероналовын 36, 376 —    боратный 148 —    фосфатно-солевой 1 74, 316, 328,561,604 —    кплий-фосфатный 231, 236, 407 —    карбонатво-бинарбонатный 336, 561.604, 618 Гемолизин 25, 114, 300, 369.    607 Гемолитическая система (гексистема) 25, 116, 216 Жидкость Руге 106, 446 —    Карнуа 108 Иммуноасцитлческнн жидкость (ИАЖ) 84 Комплемент 27, 116, 216, 300, 370,    607

Метод вирусоскопии 99, 449, 648 —    Кербера 66 —    иммунофермснтного анализа (ИФА) 88, 159, 178, 228, 233, 244, 314, S28, 336, 349, 406, 409, 436, 561, 603, 609,617 —    к сф ал-тоста 514 ■— перекрестного иммунитета 64 —    полимеразной цепной реакции (ПЦР) 180, 253, 307, 342, 416, 425, 625 —    Рида и Менча 66, 242, 297, 324, 380, 394, 500, 523, 662, 656 —електрснкой микроскопии 327, 599 Окраска 1,ис1,опрепаратов по Ленцу 80 —    Турбиной 584 —    Туревичу 81,684 —    мазков по Борману — Гайнуллиной 74 —    Минину 74 —    Морозову 100, 446 —    Муромцеву 73 —    Нашену 100, 447 —    Селлерсу 74 Перевиваемая линия почки свиньи (СПЭВ) 70, 386, 392

---

—    культура клеток ВНК-21 18,110 —    культура клеток почки поросенка (РК-15) 280, 392 Лерви'шо-Трипстшэкроьвн-ная культура клеток почки свиньи (ПЭС) 70,141, 886 —    почки эмбриона коров <ПОК) Ut, 218, 289 —    селезенки эмбриона Коров (СОК) 218 —    легкие эмбриона коров (ЛУК) 2! 8 —    тестикулов бычка (ТВ) 218, 239 —    почка ягненка ПО Раствср 30-60% -иого стерильного глицерина 21, 72,100, 108. 386,482, 588, 61 б —    азида натрия 600 —    азотнокислого серебри 106, 446 —    Альсевсра 55, 271, 361 —    Скс-диазобензиднна 55 —    боркп-боратный буферный 676 —    бромистого этидия 180, 253, 306, 342, 416, 625 ~ версеиа 17, 60, 296 —    гексаметафосфата натрия 215 —    аабуференый физиологический (ЗФР) 7, 298, 325, 353, 386, 399, 563,596 лимоннокислого натрия 127, 135, 402, 448, 468, 460, 476, 535 —    медкнал-вероннлопый 83, 569 —    мертиоянта 376, 600 —    натрия хлористого 7, 171, 215, 269, 276, 287, 352, 376, 392,571, 611 —    трипсина 18, 69, 296 —    физиологический 21, 54, 78. 83, 101,110,127, 134. 212, 236, 257, 263, 266, 309,

364, 867, 419, 428, 444, 448. 456, 469, 476, 482, 607, 525, 642, 547. 554, 616, 630 —    фосфатно-буферный 7, 21, 54, 77, 109, 215, 229, 234, 271, 294, 322, 358, 358, 362. 367, 386, 448,602,607, 591.620 —    формалина 86, 100, 108. 482, 60S, 537, 617 —    Хеикса 18, 70, 87,-141, 211, 240, 296, 328, 377, 387. 486. 492,    636. 589, 616 —    хромоген-субстратный 318, 332, 338, 353, 564, 606 —    Ованса 299 —    Эдикгтоно 108 —    Эрла 18, 296, 589 Реакция гемагглютинации (РГА) 127, 135, 221, 270, 359, 403, 449, 459, 472. 477, 643,697 —    гемадсорбции (РГАд) 142, 220 —    диффузионной преципитации (РДД) 4, 76, 118. 145. 214, 268, 280, 376, 483, 488, 493,    600, 636, 646, 552, 599 —    длительного связывания комплемента (РДОК) 113 —    нммунодиффузии (РИД) 154, 170, 276 —    иммунофлуоресценции (РИФ) 77,112,142, 212, 242, 262, 268, 298, 322, 378, 386,516, 562,591 —    иммуноосмофореоа 84 —    иммуноалектроссмофореэа (1'ИЭОФ) 569, 573 —    нейтрализации (PH) 69, 86, 143. 227, 241, 224, 379, 389, 393, 395, 464, 493, 497, 522, 543, 548 —    нейтрализации вирусных гемагглктининов (РНВГ) 226 —    непрямой гемагглютинации (РИГА) 83, 227, 325, 494, 501, 516

---

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ

Составители:

П. И. Барышников,

В. В. Разумовская

Издание второе, исправленное

допущено

Министерством сельского хозяйства РФ в качестве учебного пособии для студентов вузов. обучающихся пс направлению подготовки (специальность) * Ветеринарию

ДОПУЩЕНО

УМО ayfion РФ по пб}ни$манип н области жюмехнии и ветеринарии в качестве учебного пособия для студентов вузов, обучающихся по направлению подготовки (специальности) «Ветеринария»

(каалшрцкацил (степени) о Ветеринарный враче)

•САНКТ-ПЕТЕРБУРГ* МОСКВА* КРАСНОДАР« * 2016*

662    Лаборатсрним    дмтнспыкс    синусных    Зслынсй жисстлых

|"1г»й1и«1*иыи1 iruiiMi* rt u»ine№*iri»Ti:iiiw4rji«M»niiiij hi М1ч«1 игр м eicitmm» лдеямвамншши «мч

—    непрямой кммунофлуо-ресдекции (РНИФ) 5, 112, 202f $22 —    пассивной гемагглютииации (РИГА) 53 “ подавления иммунофлуо-рссцснцим 2/3, 386 *— радиальной ншунодиф* фузии (РРИД) 5, 276 —    сероэащиты (РЗ) 65 —    связывания комплемента (РСК) 24, 35, 215, 268, 299, 368,507 —    угнетения снизывания комплемента (РУСК) 59 —    торможения (задержки) гемагтлютикяции (РТГА, Р8РА) 125, 135, 144, 221, 262, 265, 272, 357, 361, 399, 448, 467, 477. «507 —    гемадсорбдии (РТГАд) /42, 220, 262 —    непрямой гемагглютинацки (РТНГА) 225 Среда 199, 323, 386, 486, 618, 640,690 —    0,5% -но1Ч1ГидролизЕгалак-тальбумкна 18, 70,110,

240. 323, S36, 436,5/3, 640, 533 —    5% -ногогемогидролизата 386 —    Игла 18, 70,110, 486, 518, 540, 590 —    Игла (МВД) 289, 393 —    Китта-Тцроцци 326, 542 поддерживающая 18, 323, 386, 393, 486, 523, 640, 550 —    ростовая 18, 296, 393, 436, 6/3, 530 Тельца Бабеиги — Негри 74 ТермолабИльиыс* ингибиторы 126, 403, 449, 480 Термостабкльные ингибиторы 126, 480 Тканевая цитоиатическая доза (ТЦД) 18, 70, 87, 143, 380, 394, 544 Цитопатическое действие (ЦПД) 19, 70, 87, 110, 143, 219, 241, 324, 280, 388, 394, 486, 544 Эритроцитарный диагностикум 55, 83, 325

---

ББК 48.7я73 Л 12

Л 12 Лабораторная диагностика вирусных болезней животных / Сост. Л. И. Барышников, В* В. Разумов* скал: Учебное пособие. — 2-е иэд., испр. — СПб.: Издательство «Лань», 2015.— 672с.: ил, — (Учебники для вузов. Специальная литература)*

ISBN ЭТ8-5-8114-1882-4

Учебное издание содержит действующие методические указания, наставления и инструкции по лабораторной диагностике вирусных болезней животных, утвержденные Министерством сельского хозяйства СССР, РФ и Россальхоэиддзором РФ. Документы автоматизированы по видам животных, в большинстве прописи МЖИЧЫКТНКЛО аЦПрОбАЦлЮ U АлГАЙсДОЙ крдепой BAl ери норной ли бораторни н включены в «Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, я такж* контрола безопаскгстк сырья животного и раздельного происхождения» (по состоянию на июль 2011 г.). Приводятся предметный указатель и библиографический список.

Предназначен© для студектсв, обучающихся по специальности «Ветеринария» и поправлению ♦ВетеринврнО'Санитариаи экс* пертитш», явтериилркмх прпчпй и лаборантов ветеринарных лабо-раторий.

ББК 48.7*73

Рецензенты:

И. И. ГУСЛАВСКИЙ —• доктор ветеринарных наук, профессор кафедры микробиологии, э^зоотологии, паразитологии и ВСЭ Алтайского государствен наго аграрного университета;

В. И. ПЛЕШАКОВА — доктор ветеринарных наук, профессор, зав. кафедрой ветеринарной микробиолсн*ик, вирусологии и иммунологии Омского государственного аграрного университета им, П, А. Столыпина:

В. А. СИНИЦЫН ~ доктор ветеринарных наук, зав. отделом ФГБУ «Новосибирская межрегиональная ветеринарная лаборатория*.

Обложка Ф Издательство »Лань», 2015 Е. А. ВЛАСОВА 0 Коллектив авторов, 2015 0 Ипдятсльство «Лань*,

художественное оформление, 2015

■мятиичи >ч «—»»»«i4Hhi»iiic—«»i4

0.10.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВИРУСВАКЦПН ПРОТИВ НЬЮКАСЛСКОЙ БОЛЕЗНИ ПТИЦ (утверждены 12 июлл 1980 г.. Л? 115-6)

1. Общие положении.

1.1.    Определение биологической активности вируса против ньюкаслской болезни проводят в республиканских, краевых, областных, зональных и специализированных ветеринарных лабораториях специалисты, владеющие методами вирусологических исследований.

1.2.    Биологическую активность вирусвакцкн определяют методом титрования на развивающихся эмбрионах кур с последующей статистической обработкой полученных данных.

6. Ik. лез fi и птиц    469

■ «ими* ■niJWiHi»an*'«w<iuMimj*uikiMi матицами и с » j 1гиь1Цмм1|И||»«'Н'1очыа>нммчм11

Вакцину исследуют на биологическую активность по-редее применением для аэрозольной вакцинации птиц против ньюкаслской болезни, также в случаях выявления нарушений режимов хранения или транспортировки биопрепарата.

2. Материалы и методы.

2.1.    Для проведения титрования необходимо иметь:

■    оборудованный бокс с прсдбоксником для вирусологической работы, темную комнату, овоскоп, термостат, центрифугу и бытовой холодильник;

■    стерильные плоскодонные колбы (50...250 мл), пастеровские пипетки, градуированные пипетки (1 и 10 мл), пипетки Мора (25.. Л 00 мл), шприц для инъекции (1 мл) с иглами (лучше туберкулиновые), пробойник;

1 стерилизатор, штативы, глазные пинцеты, глазные изогнутые остроконечные ножницы, лотки с ячейками для эмбрионов, эмалированные кюветы, фарфоровая (стеклянная) кружка:

■    антибиотики (пенициллин и стрептомицин), спиртовой раствор йода (0,1%-ный), раствор лимоннокислого натрия (4...5%-ный), взвесь эритроцитов кур (5Уо-ная), стерильный физиологический раствор (pH 7,1...7,3), стерильные ватные тампоны, парафин, дезраствор(2% -иый растзор едкого натра или хлорамина);

Я 9... 11-дневные развивающиеся эмбрионы кур (РЭК) с белой скорлупой и петухи-доноры,

2.2.    Для исследования берут 3 ампулы или 3 флакона каждой исследуемой серии вакцины из разных коробок.

2.3.    Для определения биологической активности вируса лентагеиных штаммов («В1», «Н», «Ла-Сота» и «Бор-74 ВГНКИ* и др.) используют РЭК 9...10-дневнсго возраста, а из меоогенных штяммов(«Н» и др.) — 10... 11 -дневного возраста, полученные из благополучного хозяйства..

Для титрования вируса можно использовать РЭК, полученные и от кур, привитых инактивированной или живой вакциной из группы лентагеиных штаммов.

2.4.    Перед заражением РЭК просматривают нр. овоскопе, все погибшие, слабые и с неправильным расположена

470    Лабораторная    диагнасгешко ви^скыж болезней жавошых

I Iwwft ■«№*<«■•>№«%1ВММШМ1ШЛММ1м-11 (Mil MdNIWIimai «а г*|К ,K»ilMW4ftiilM«llW*»ll>i.««>«« ■ ««Ml

ем куги выбраковывают. У остальных простым карандашом отмечают нугу и очерчивают в бсссосудиетой ионе место для введения вируса.

2.5.    На каждое испытуемое 10-кратное разведение вируса используют по 4 эмбриона. При этом на скорлупе каждого эмбриона делают соответствующую маркировку (наименование штамма, номер серии, разведенке и дату заражения). Четыре эмбриона оставляют в качестве контроля.

2.6.    Маркированные но разведениям (от 10'^Л до 10 ^1П) и контрольные РЭК размещают на чистом профлакбирован-ном металлическом (деревянном) лотке и до заражения помещают в термостат. При этом в термостате должны быть емкости с водей и открытые вентиляционные каналы.

3. Титрование вируса и статистическая обработка.

3.1.    Перед тем как приступить к титрованию, обращают особое внимание на расфасовку вакцины в ампулах (флаконах), подвергнутых лиофильному высушиванию. Количество доз и объемное содержание вируса в ампуле (флаконе) указано в Наставлении по применению сухой виру свакцины против ньюкаслской болезни.

3.2.    Исходное разведение лиофилизированного вируса готовят в колбе, начиная с разведения 1СГ¹ (без учета наполнителя), при этом на каждый миллилитр вируса в ампуле (флаконе) берут по 10 мл физиологического раствора (при работе с нативным вирусом берут его 1,0 мл и добавляют 9,0 мл физиологического раствора), содержащего по 200 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина.

Пример: 3 ампулы сухой внрусвакцины из штамма «Н» с содержанием в каждой по 0,5 мл вируса разводят в 15 мл, а 3 ампулы вакцины из штамма «Ла-Сота» с содержанием в каждой по 2 мл вируса, разводят в 60 мл физиологического раствора и т. п. Полученную взвесь тщательно взбалтывают и оставляют на 10...15 мин до полного растворения.

3.3.    Десятикратное растворение вируса готовят следующим образом. В 9 стерильных пробирок наливают по 9 мл стерильного физиологического раствора. Затем из исходного разведения вируса (К)"¹), предварительно взболтанного до однородной взвеси, берут 1 мл и переносят в пробирку

В. ijojif jhu егаш;    471

a i c. «-in mm HI i ■iiih-.hi — inntpim— мр—ярря цжиинищ i uina ■^>m*i мшишщ» —л—— —a

N® 2, но касаясь ее содержимого, получают разведение 10'². Пипетку, которой внесли исходную взвесь, помещают в кружку с дезинфицирующим раствором. Новой пилоткой путем трехкратного пипетирования перемешивают взвесь в пробирке 2, отбирают 1 мл содержимого и переносят в пробирку № 3, ис касаясьео содержимого, получают разведение 10~³. Так готовят и последующие разведения вируса до 1СГ¹⁰ включительно, используя при этом на квждре раз-ведение отдельную градуированную пипетку.

3.4.    Приготовленными 10-кратными разведениями вируса заражают эмбрионы в аллантоисную полость одним стерильным шприцем, начиная от разведения 10"¹⁰ и до 10~^ь включительно. Перед заражением ранее отмеченную пугу к бессосудистую зону РЭК обрабатывают спирт-ом с 0,1% -ным содержанием настойки йода и фламбируют. Затем стерильным пробойником в скорлупе пробивают два отверстия, сначала в центре пуги, а затем в бессосудистой зоне. Каждым разведением вируса заражают по 4 эмбриона в объеме 0,1 мл. После заражения РЭК отверстия заливают расплавленным парафином сначала в месте введения, а затем в области пуги. Зараженные РЭК помещают в термостат и овоскопируют 2 раза в день (утром и вечером). Гибель отдельных РЭК в течение первых 24 ч считается неспецифической.

3.5.    Зараженные и контрольные РЭК инкубируют: в течение 72 ч — инфицированные штаммом «Вор-74 ВГНКИ*, 96 ч — штаммими «В1* и «Ла-Сота» и 120 — штаммом «Н».

По истечении срока инкубации проводят- учет результатов титрования: для штаммов «В1», «Ла-Сота* и «Бор-74 ВГНКИ* по наличию гемагглютинации в исследуемых разведениях, используя при этом феномен «спонтанной* реакции гемагглютинации (кровь живого эмбриона + экстраэмбриональная жидкость этого же эмбриона) и капельной реакции гемагглютинации (экстраэмбриональная жидкость павших РЭК после 24 ч + 5% -нвя взвесь эритроцитов кур); для штамма *11* по наличию гемагглютинации в исследуемых разведениях и капельной реакций гемагглютинации (экстраэмбриональная жидкость только павших РЭК после 24 ч + 5%-ная взвесь эритроцитов кур).

3.6.    «Спонтанную* и капельную реакцию гемагглю-ткнации ставят на чист ых обезжиренных предметных стеклах или профламбировянных кюветах. Вскрытие начинают с контрольных РЭК, а затем or разведении 10 ¹⁰ и до 10 ⁵, при этом па каждый вскрытый эмбрион используют отдельную пастеровскую пипетку.

3.7.    При постановке ♦спонтанной» капельной реакции гемагглютинации живые РЭК вскрывают со стороны пути, отделяют ее, надрывают подскорлунную и хорионаллантоисную оболочки. Кровь, полученную при травмировании сосудов РЭК, смешивают (пипетированием) с экстряамбри-ональной жидкостью и 2...3 капли смеси переносят на предметные стекла. Затем через б...8 мин, осторожно наклоняя и покачивая, наблюдают за проявлением хлопьев агглютинирующих эритроцитов. Положительная реакция гемаг-глютипации служит показателем наличия вируса. В контрольных (незаряженных) РЭК реакция должна быть отрицательной.

3.8.    Капельную реакцию гемагглютинации от павших РЭК ставят так же, как и от живых, но здесь, к полученной экстраэмбриональной жидкости от каждого эмбриона добавляют по 1 капле 6%-ной взвеси эритроцитов кур, тщательно перемешивают и ведут учет реакции через 5. ..8 мин.

3.9.    Полученные результаты записывают в следующем виде, изложенном в таблице 33.

Та К лицо 33 Протокол титрования па РЭК вируса ньюкаслской болезни

Разведение вируса Объем ВВОДИМО' го инокулята, мл Количество РЭК, в котором установлен вирус (+), не установлен (-) Отношение количества РЭК с вирусом / к числу зараженных 1СН> 0,1 ■М-++ 4/4 1(Н 0,1 ++++ 4/4 10-5 од +++- 3/4 1(Н 0,1 1 2/4 io-« од - 1/4 КГ1' од — 0/4 | Контроль - 0/4 ___

3.10.    Титр вируса определяют по методу Кербера, видоизмененному П. П. Ашмариным, по формуле

lgDHfljo/O.l мл - lg- о ■ (la, - 0,5),

где ЭИД^о/0,1 мл — титр вируса в объеме ОД ыл, способный вызвать инфицирование 50% зараженных РЭК; Д_к — максимальная испытуемая доза вируса (Ю'^ь); о— логарифм кратности разведения (в нашем примере 10-кратные разведение, ст~ 1); а, — отношение числа РЭК в испытуемых разведениях, давших положительную реакцию гемаг-глютинации, к общему числу зараженных; Ха, — сумма значений а,, найденных во всех испытуемых разведениях (в нашем примере Xct, — 3,50).

3.11.    Для получения необходимых данных производят следующие расчеты (табл. 34).

Сумма значений:

Ха, - 3,50.

Пользуясь этими данными, находим по формуле титр вируса:

1_&9H^/0,1 - lg Ю-б - lg 10¹ - (3,50 - 0,5) =

= -5 - 1 - 3,00 - -5 - 3,00 - -8,00.

Отсюда lgЭИДзд/0,1 --8,00;

^ЭИДзд/мл - -9,00 (или 10 ^й'⁰⁰ ЭИ Дао/мл).

Антилогарифм полученного значения: 10"^в,о? ЭИД_м/мл, он равен разведению 1:1 000000000, т. е. 1 мл вируса содержит 1 ООО 000 000 ЭИД₆₀ (или Ю ® ⁰⁰ ЭИД^/мл).

3.12. Биологическую активность вирусвакцин из штаммов «В1«, «Ла-Сота» и «Бор-74 ВГНКИ» выражают в ЭИДзд/мл, а из штамма «Н* — в ЭЛД^/мл.