ВСЕСОЮЗНАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК имени В. И. ЛЕНИНА

Отделение ветеринарии

Методические рекомендации по исследованию кормов на содержание охратоксинов

Москва

Всесоюзная академия оедьокохозяйотвсняых наук ■меад В. И.Ленина

Отдедеаде ветеринарии

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИССЛЕДОВАНИЮ КОРМОВ НА СОДЕЙШШБ ОХРАТОКСЙЮВ

Утверждаю:

Академик-секретарь Отделваяя ветеринарии

академик ВАСХНИД В. П. Шишков

4 августа 1980 г.

Москва - 1980

то

Заключение по результатам анализа

При обнаружении огратоксинов в кормах необходимо принять меры к рациональному использованию неблагополучных партий кормов, руководствуясь еле .дующими положениями.

Во parts пределом допустимых концентраций охратоксияов в кормах (исключая лредубойный период) следует считать 100 мкг в 1 кг корма для жвачных и 50 мкг/кг для свиней и птиц.

луп выявлении партий зернового сырья,средняя концентрация охратоксинов в которых превышает 3-4 мг/кг, ах не следует использовать для изготовления комбикормов. Такое сырье должно быть направлено на техническую утилизацию, так как повторная сушка или термическая обработка при существующих технологических режимах не обеспечивают удовлетворительного снижения концентрации токсина.

Корма для свиней и птиц, содержащие любые концентрации охратоксипов, следует категорически запрещать скармливать в десятидневный период, предшествующий уоого животных.

СОДЕРЖАНИЕ

методика пошошеочвенного ошадкшзгдя охратоксинсв в зв.на и ксмшашх......

Принцип метода .......................

ООорудование, реактивы и растворы

Ход анализа ..........................

Оценка результатов и дополнительное проявление ...........................

МЕТОДИК* ГАЗОХРШТОГРЛ-ЕГТХСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

УМОВЫХ ЭФИРОВ ОХРАТОКСИНОВ ............................... 7

Принцип методики ........................................ 7

Оборудование и посуда ................................... 7

Реактивы и растворы ........... 7

Ход анализа ............................................. 8

Заключение по результатам анализа.......................10

Технически:', редактор А.Г.Барнашкоза

Л 53299 от £9.06.1980 г.    Формат 60 х 34 I/I6

Тирах 500 экз•    Коч.л. 0,75 Заказ зеси    Еесгиагно

Москва. Типография ВАСХНИЯ

Методические рекомендации разработаны Всесоюзным научно-исследовательским институтом ветеринарной санитарии (А.Н.Леонов) и утверждены на заседании секции "Зоогигиена, ветеринарная оави-тарля и охрана окружающей среды" Отдатония ветеринарии ВАСХНИЛ 20 февраля 1930 г.

Методические рекомендации предназначены для научно-исследовательских ветеринарных учреждений, занимающихся вопросами санитарии кормов.

Ответственный за выпуск - ученый секретарь Отделения ветеринарии ВАСЛГ/Л кандидат ветеринарных наук К.Л.Семенов.

Всесоюзная академия сельскохозяйственных наук вмени В.И.Денина

э

Охратоксшш - метаболиты многих плесеней, возникающих при хранении, - являются причиной микотоксаческой иефкштки свилей, характеризующейся симптомами полидипсии и полаурии, Известны также случаи отравления охратоксинами кур и индеек.

Ущерб, причиняемый охрагокспяяш животноводству, достаточно велик, так как многие виды грибов, способные образовывать эти вещества, присутствуют в хранящемся ."уражо постоянно. Статистические данные о распространенности повышенных концентраций охра-токсинов в кормах в нашей стране отсутствуют, так как соответствующие исследования должным образом не ведутся.

Применяемые в практике упрощешше методы токсикологической оценки кормов, такие, как биопроба на коке кролика или рыбах гуппи, не позволяют установить наличие охратоксинов. Косвенным показателем может явиться виделоние в повышенных количествах одного из известных продуцентов охратоксинов при серийных микологических исследованиях кормов. Продуцентами охратоксинов являются Грибы, относящиеся к видам Penic.illium purpur^esceiiB Горр, Р. commune Thom, Р. virirtecalum lYestl.; P palitaus Weetl;

P. cyclopium V/vStl; P. varinbile fopp; P. verruculosun Peyro-леГ, Aspergillus sulphureus (Frer..) Thom a'd Churr.hj A. selerot -Orum Huber, A, alliaceus Thom arid Church; A, melleus Yukawa;

A. ochruceus Vilhelm; A. ostiarus Vehr.er• A. netrakii \oros»

Этот показатель относителен, так как не все разновидности потенциальных продуцентов способны образовывать охратоксинп, и происходит это далеко но всегда, даже если гриб получил на кормах достаточное развитие.

^шмиыо-аналитическое исследование кормов на содержание охратоксинов необходимо как с диагностической, так и с профилактической целью.

В первом случае необходимость исследования обусловлена ся.цуомвтичссши комплексом, позволяющш предположить г,(икотоксическую ноброиатию. Методически наиболее правильным является исслэдопзние подозреваемых кормов, которые использовались б течение месяца, предшествующего возникновению заболевания.

Показанием к организации профилактических доследований долкон служить 4»кт поражения кормов одним из видов грибов, перечисленных выше. Из зериофуража, подверженного поражению такими грибами, наиболее благоприятным для накопления охратокоинов субстратом слодуот считать ячмень, овес, кукурузу (как зерно, так и в початках) и в мешой стопони - пшеницу. Токсянообразо-вание особенно усиливается при повышенной влажности субстрата, и этот процесс носит очаговый характер, что должно учитаватьоя при отборе проб для анализа.

Исследование о?обран:шх образцов монет бить провидено с помощью одной из слодующпх мотодяк.

шдакл цотосюств^^юго сшзджкдо охглтас;ксв в вярнь* к т'с:жоя\\х

Принцип метода

Метод основан на извлечении охратокег.иов подкисленным хлороформом из измельчал:*,оГ. дроби. Экстракт очищают на колонке с дли тома том, элядруюг о.чдалну» фрашщ» пэ колонки споцяфчбсдоЙ системой растворителей. Полученный полуочдг энный экстракт расде-лязот в тонком слое силикагеля в присутствии вещества-свидетеля с. последующей идентификацией анализируемых веществ по Диктору удерживания (^1) и характеру флуоресценции в удьтрг^типлетовой части спектра. Чувств;:/едьнссть определения - на менее 40 мкг/кг исследуемого образца.

Оборудование,реактивы и растворы^

И^ттель-агшарлт; баял водяная тли пасочная; источник У'2>-света (хроматоскоп, UiR-I иля друг ей прибор с аналогичной характеристикой излучения); хро.чятографпческая камера; колонки хроматографические (2 х 70 см); пластинки j хч хроматограф:) типа Силу фол; 'натомит марки Целит-115; фосфорная кислота; «лу р^рьп-ная кислота вб^-ная; уксусная кислота ледяная; хлороформ;

^х/ Все роэктивн должны соответствовать кбплп <трпвгди х.ч. или ч.д.а. в соответствии с требованиями дэйсгвущгх гостов.

гексан; бензол; метанол; спирт этиловый; раствор двууглекислого натрия, водный, 1,255-ный; смесь хлороформа с цуравыиюй кислотой (99:1). свежоприготовленная; стандартный раствор охратокси-на А, 1-5 мкг/мл.

Ход анализа

Экстракция пробы и очистка экстракта. К 50 г тщательно измельченной и перемешанной пробу, помещенной в колбу Орле Плейера объомом 500 мл, прибавляют 25 мл 0,1 U раствора фосфорной кислоты и 250 мл хлороформа, экстрагируя? при встряхивании на шутгель-алпарате в течение получаса и фильтруют через воронку Бюхнера, содержащую 10 г диатомита. Первые 50 мл полученного экстракта смешиваю? с 40 мл гексана и вносят в хроматогра'Тичс-скую колонку, содержащую 2 г диатомита, внесенного с помощью I мл водного раствора двууглекислого натрия. Колонку элюируют при максимальной скорости вытекания и промгвают 75 мл хлороформа. Полученный элюат сохраняют для возможного дальнейшего исследования на содержание эфиров охратоксинов с помощью газохроматографического метода (при отсутствии подобной возможности элюат отбрасывают).

Извлечение охратоксинсодержащей фракции из колонки. Колонку промывают 75 мл свежеприготовленной смеси хлороформа с муравьиной кислотой (99:1), давая стечь растворителю с макешдаль-ной скоростью. Элюат быстро выпаривают на водяной бане (для предотвращения бурного кипения добавляют стеклянные бусы), и остаток переносят с помощью небольшого количества хлороформа в конически центрифужную пробирку. Полученный раствор выпаривают, а остаток растворяют в 750 мкл бензола, содержащего X% уксусной кислоты. Этот раствор используют для дальнейшего определения вещества в тонком слое силикагеля.

Хроматографическое разделение в тонком слое. На стартовую линию пластинки наносят ряд проб объемом 3,    5,    7,5    и    дваж

ды по 10 мкл раствора исследуемого вещества. В одну из нанесенных проб объемом 10 мкл прибавляют 10 мкл стандартного раствора охратокспия Л (внутренний стандарт). Стандартный раствор наносят также в виде отдельных проб объемами 5, 7,5 и

10 мкл (для намесенгл проб на пластинки рекомендуется пользоваться ьшкроагфицвм для газовой хроматографии объемом 10 мкл).

Пластинку помещают в ненасыщенную камеру, содеряащую смесь бензол-мотанол-уксусная кислота (13:1:1), и разделяют до момента подъема фронта растворителя на максимальную высоту. Поело этого шшстшг.су извлекают, подсушивают на воздухе до исчезновения запаха смеси растворителе Г. а просматривают в темноте под длинно-волновым У<>-светом. Охратоксины А и В имеют показатель фактора удерживания (    )    в    диапазоне    0,4-0,8. Охратоксин А более ин

тенсивно флюоресцирует под воздействием длинноволновой области спектра (job нм), созываемого ШТ-I, охратокспн В - в коротковолновой области спектра (254 нм), создаваемого хроматоскопом.

Оценка результатов и дополнительное проявление

При обнаружении в исследуемом экстракте веществ, идентичных стандарту по *£ а характеру флюоресценции, визуально сравнивают интенсивность флюоресценции в пробах исследуемого и стандартного вещества. В случае несоответствия интенсивности свечения стандарта п пробы анализируемый раствор может быть сконцентрирован или разбавлен а процесс хроматографирования повторяют па новой пластинке, с тем чтобы получить сслостазимую интенсивность свечения. Это позволяет ориентировочно определить концентрацию вощесгв~ в исследуемом растворе в ыкг/мл. При пересчета на концентрацию в исследуемом корме все вещество, находящееся в элюате из колонка, следует принимать за котичестьо, аликвотное 10 г исследуемого материала, ила 2С£.

Для уточнения получешшх результатов и подтверждения, что обнаруявняоэ вещество действительно является охратоксилом, пластинку можно опрыснуть спиртовым раствором дву угле голого патрая (6 г Va.iCOg 100 мл воды + 20 ил этанол*). Китенсав-iiocTb флюоресценции обнаруженного и стандартаоги вещества при просмотре пластилин в длинноволновом УФ-свете должна возрасти, а ее оттенок сместиться в сторону голубого. Ориентировочную оценку концентрации обнаруженного вещества повторяют. При песо ответствии первой и второй оценок правильной следует призвавзт первую оценку.

ЫКТОДИКА ГА30ХРа.:АТ0ГРА^НЬСКиГ0 ШВД’ЛЕНИЯ

ЭТИЛОВЫХ    охра токсинов

Принцип методики

Метод основан на извлечении охратоксилов из пг ^лби и фракционировании природных эфиров охратоксинов от охратОг-Ш!on,обладающих свойствами кислот. Экстракт разделяет на колонке, заполненной диатомитом, повторно очищают (Тракцию, содержащую эфирг охратокояяоз, методом осадочной хроматографии на второй колош е о диатомитом. Пробу очищенного экстракта роздел;к>т на хроматографе. Это позволяет 7л^х1«рзнцированно обнаруживать баологичас* ^г< активные (токсичные) и биологически неактивные (нетоксичш.е) Форш ПрНрОДНЫХ ЕфЯрОП О'ГраТОКСШЮВ И ПРОВОДИТЬ ИХ КОЛНЧООГЯМ/1-

яое определение в пробе.

Чувствительность метода при введении в колонку хроматографа минимальных объемов экстракта (I мкл) составляет не менее 20 нг/ыкл, или 25С мкг/кг корма. При введении в испаритель прибора оптимального объема Кб мкл) метод позволяет определять вещество на уровне рекомендуемых предельно допустимых концентраций (ПДО - 50 мкг/кг.

Обо: -/дование и посуда

Газовый хроматограф Газохром 1106 э со стеклянной колонкой 0,3 х. 50 см, заполненной метилеллокеаном 5Ь-30 (Ь% на хромато-не); споктрофото.мегр CO-IG (СФ-26) или аналогичный прибор; шут-гвль-ашгар^т; баня водяная или песочная; колонки хроматографические (2 х ?0 см); лабораторная посуда.

х/

геактивы и растворы^

Хлороформ; бензол; гексан; метанол; кислота уксусная ледяная; кислота фосфорная; кислота муравьиная 853-ная; натрий двууглекислый; диатомит маок* Целлт-545 (перед ребе гой следует прокалить при 150° в течение д-12 ч); раствор двууглекислого натрия водный, 1,253-ныЯ; раствор двууглекислого натрия водно-иетанольный (0,3 г A^aHCO^ в 30 мл ^0 + 70 ьи метанола).

^ Все реактивы должны соответствовать квалификации х.ч. или ч.д.а. в соответствии с требованиями действующих гостов.

Стандартные раотворы этиловых заиров охратоксинов А и В или их сг.еоь (30-50 икг/шх) ь хроматографически чистом ацетоне или гексане. При необходимости концентрацию уточняют, измеряя оптическую плотность вещества в бензоло, содержащем 1$ уксусной кислоты (jCrmyt ' 333 НМ, МВ - 431, & - 6200 и    - 320 нм,

МВ - 39?, £- 6500).

Смесь бензол-гексан-муравьиная кислота. Приготовление: смешать ь делительной воронке бензол с гексаном (2:8) и прилить к полученной смеси десятую часть 702-ного водного метанола. Дождаться разделения фаз и отбросить нижнюю, а к верхней прибавить 8Ь?-ную кислоту в количестве, составляющем 52 от объема первой меси, Разделить и отбросить нижний слой.

/од анализа

Извлечение вещества из пробы и его очистка. Измельченный высушенный корм (50 г) помещают в колбу объемом 0,5 л, приливают 26 мл 0,1 М раствора фосфорной кислоты и 250 мл хлороформа. Экстрагируют при интенсивном перемешивании (шуттель-аппарат) в течение 30 мин. Экстракт отфильтровывают через стекляный фильтр о 10 г диатомита Целит-545. 50 мл фильтрата смешивают с 40 мл гексана и вносят в хроматографическую колонку, содержащую 2 г диатомита и I мл X,252-ного раствора двууглекислого натрия. Колонку элюируют при максимальной скорости вытекания смеси и домывают 75 1дл хлороформа. Объединенный элтоат, полученный из колонка, выпаривают. Остаток с помощью 50 мл гексана переносят во вторую колонку с 4 г диатомита и 2,5 мл водно-метанолового раствора двууглекислого ньгрия. Бистро сливают внесенный раствор и промывают колонку 50 мл смеси бензол-гексан (1:9), уравновешенной 2,5 мл водно-метзнолового раствора двууглекислого натрия. Ьлюат отбрасывают и колонку промывают смесью (100 мл) бензол-гексан-муравьиная кислота. Вновь полученный элтоат немедленно егшаривают. Остаток переносят в пробирку с притертой пробкой с помощью небольших количеств хлороформа, излишек рас твори толя вы-па рила гот в токе аз^та до ,'зчезнолеиия запаха, л остаток перераспределяют в I мл хроматограф чеки чиотого а:^т,огона или гексана, полученный раствор (V*₂) Нсптъсум для аь*да в хроматограф.

£я 1делепне. идентификация и ксличзственноо определение охратоксинор ш хроматограф. Ус **анавлираят следующий режим работы прибора: температура, термостато колоаки - 220°, У".рмо-стата детектора - 240-250°, испарителя - 235°. Соотношение расхода газа-нооитоля и газа, подаваемого в кемэру дебитора, -40-60 мл/мин. Вводят в испаритель пробу стандартного раствор , объемом Х-ь мкл (в зависимости от выбранного для работы масяти-ба усиления электрометра). Определяют время удерживания охра-токсинов, которое при ншуказаниим режиме должно составлять для эфира охратоксина В (нетоксичного) около .10 мин, a для. ndr-ра охратокепкв А (токс ичного) - около 14-14,5 мши

Вводя! в исшрителъ прибора ря^ проб исследуемого раствор тех ке объемов и определяет среднее значение высот пиков, имеющих то хс время удерживания, что и стандарт. Но трем повторным результатам рассчитывают среднее значение высоты пика стандартного вещества (Hj) и вещества в определяемой пробе (Н^).

Копнен града определимого вещества в исследуемом продукте (X) рассчитывая? по следующей формуле, принимая 'Г^ за 0,2 от величины навески, взятой для анализа:

,25 • А • Н₂ • V “i • ^vi

концентрация вещества в исследуемой пробе (мг/л, мг/кг);

количество вещества в стандартном растзоре введенном в хроматограф (мкг);

высота пика стандартного вещества (ми);

высота ника определяемого вещества 1т);

количество анализируемой пробы (мл, г);

объем экстракта, введенный з испаритель хроматографа (мкл);

V₂ - общий объем экстракта после его упаривания (мл);

1,25- коэффициент учета потеря вещества при экстракции я очистке экстракта нэ колонках.