гДЛРСТВБНлАЯ КСШВДВ! ПО Х1ШЧВ2Ж СРЕДСТВАМ ЕОРЬЭД РДОШлвЯ, КиЙЗН^ РАСТЗгГЙ И СОИПКШ ПРИ МСХ СССР

КШЛИЧ^ХКИВ УКАЗАНИЯ ПО OPFS^vl^i;© аКРОКОЗЯЯЕСТВ пксташда [ТАШЯ.КОВШ к БНК|*ЛГлЛ -CP3JU

Часть 7III

МоскЗй

19?7 Г.

---

ГОСУДАРСТВЕННАЯ КОМИССИЯ

по хими чески и средствам оорьбы с вредителями,

БОЛЕЗНЯМИ РАСТЕНИИ И СОРНЯКАМИ ПРИ ЫСХ СССР

Утверждено

Уинистерстиои здривоохраионин СССР 1976 Г.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИИ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ЫИКРОКОЛИЧЕСТВ ПЕСТИЦИДОВ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ,КОРМАХ И ВНЕШНЕЙ СРьДК

Часть ЛИ

Данные методики апробированы и рекомендованы в качестве официальных группой экспертов при Госкомиссии по химическим средствам оорьбы с вредителями,болезнями растений и сорняками при ЫСХ СССР

Москва - 1977 г

ыечоют фронт растворителя и Помещают в сушильным шкаф при 105° на три минуты. Затем пластинку охлаждают и опрыскивают на пульверизатора хромо г ей ним реагентом, вновь высушивают при тех хе условиях и помещают в эксикатор над парами аммиака на 1 минуту. Зоокумарин проявляется в виде коричневых пятен на желтом фоне с fij -О ,4-0,5 в тонком слое силикагеля и R-J -0,29-0,35 на силуфоле. Количество пестицида в пробе определяют сравнением интенсивности окраски и площади пятна свидетелей tf образца. 3 случае, если задержание зооццда в пробе превышает 10 мкг, то следует получить хроматограмму стандартов большей концентрации (20-100 мкг).

Расчет результатов анализа. Концентрацию эоокуиарина в обрпэце вычисляют по формуле:

где: X-с одержание зооцида в исследуемой пробе, в мг/кг;

А-с оде ржание зоокумарина в исследуемой навеске, в мкг;

P-вес пробы, о граммах*

6.2.2. Газовал хссмцтореЫкя

Полученный после выпаривания остаток растворяют тремя 5дл метилирующего реагента и переносят в пробирку 15 см х 1,5см содержащую 5С0 мг безводного карбонита калия. Пробирку закрывают ватным тампснсм и выдерживают » водяной бане при 65° в течение 15 минут. Затем содержимое перекосят в делительную воронку емкостью 100 мл посредством 30 мл дистиллирован ней воды и б мл гексана. Метиловый эфир эоокумарина экстрагируют путем встряхивания делительной воронки в течение 2 минут, водную фазу отбрасывают, экстракт промывают 15 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия и сливают в сухую пре-

/ГУ

бирку. В испаритель газового хроматографа с электрокозах-ватным детектором вводят 6-10 мкл экстрикта при следующих условиях: расход газа-носителя 80 мл/мин, поддув - 120 мл/мин, температура колонки, детектора и испарителя - 225, 260 и 250° соответственно. Чувствительность электрометра - 1x10"**а/шкалу i Запись - 1 см/мин. Время удерживания метилового эфира зоокумарина - 2,6 мин. Высота пика при введении в испаритель 10 нг вещества - Ьи мм. Линейный диапазон от Ь до 26 нг.

Количественное определение проводят на основании калибровочной кривой по высоте пика. График строят в интервале концентраций 5-20 нг зоокумарина. С этой целью в фарфоровые чашки вносят 5, 10 и 2G мкг воокумарина в ацетоне. Ацетон выпаривают, а остаток метилируют, как и пробы. Введение в испаритель хроматографа 6 мкл гексанового экстракту соответствует детектированию б, 10, 20 Hi' зооцнда.

Содержание зоокумарина в анализируемой пробе (в мг/кг) находят по формуле:

где: Ск - количество вещества (щ;), найденное цо калибровочной кривой;

И - объем экстракта (мл), эквивалентный навеске Р (г);

- обьем вводимого в испаритель хроматографа экстракта (мкл).

Настоящая методика позволяет обнаружить микроколичества з'о'ояумарика в мышечной ткани или крови животного, что позволяет диагностировать то.чсикоа.

концентрация зоокумарина в мышечной ткани и крсви животных tflift отравлении колеблется от ) ,С до 10,0 мг/гсг.

/6S

6,3. Спектрофотометрическое определение

6.3.1.    Мышечная ткань и крозь животных. Полученный после выпаривания остаток в фарфоровой чашке растворяют в 4 ил 2%-ного раствора гидроокиси натрия, фильтруют через бумажный фильтр в пробирку и измеряют оптическую плотность при 308 ни. В качестве сравнения используют пробу мышечной ткани или крови от того же вида здорового животного,

6.3.2.    Препарат пенскумгпин. 0,4 мл фильтрате переносят в колбочку еик. 50 мл и добавляют 9,6 мл 2%-ного раствора гидроокиси натрия. Раствор перемешивают и измеряют его оптическую плотность при длине волн 808 нм в кюветах с длиной светового пути 1 см. В кювету для сравнения наливают 2%-ный раствор гидроокиси натрия.

6.3.3.    Приманки (корма). Полученный после выпаривания остаток растворяют в 10 мл 2%-ного р-ра гидроокиси натрия и филтруют через бумажный фильтр в пробирку. 0,2 мл фильтрата смешивают с 9,8 мл 2%-ного р-ра гидроокиси натрия и измеряют оптическую плотность при 308 нм против "холостой" пробы.

Количество вещества измеряют по калибровочном кривой, для построения которой в рдц пробирок емк. 15 мл вносят 0,25, 0,5, 1,0 и 2,0 мл стандартного р-ра натриевой соли зоокумарина (0,1 мг/мл),, что соответствует 25, 50, 100 и 200 мкг вооцида. Затем добавляют 2%-ный раствор гидроокиси натрия до объема 10 мл и после перемешивания измеряют опти*-ческую плотность растворов при ЗОЬ им..

Расчет результатов а длиза. Концентрацию зоокумарина в образце вычисляют по формуле!

№

Х« 10“⁴ •

где: X - концентрация активно действующего в-ва в препарате пелокумарин, мышечной ткани и крови, и кормах, в %\ С - содержание ооокумарина, найденное по калибровочной кривой, мкг;

А - общий объем раствора препарата, мл; а - объем раствора, взятого для анализа, мл;

Р - навеска препарата, в г.

иЬТОДИКА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО И СПЕКТРСФОТОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗСОНУМАРИНА В МШЕННОЙ ТКАНИ , КРОВИ ЖИВОТНЫХ, В ПВЕПАРАТЁ ПЕКОКУМАРИН И ПРИМАНКАХ (КОРМАХ) ^х)

1.Кроткая характернотика :цуепйрита Зоокумарин (М -3-\ оС-ацетс1^;к1:бензил)-4-сксикумари») применяют для борьбы с грызунами в животноводческих помещениях в форме пищевых приманок, содержащих 0,025% препарата-.

Это сильнодействующее вещество (1 группа государственной классификации). -ПДюО ^дл/‘ серы* ^КР^ЫС    мг/кг,    кошек    и    со

бак ЭО-GG мг/кг. Коэффициент кумуляции 0,4.

Рацемическая dl -форма пестицида представляет собой бесцветные кристаллы с температурой плавления 159-161°, без запаха. Препарат малолетуч, сохраняет токсические свойства в течение нескольких лет, но растворяется в воде, бензоле; хорошо растворим в ацетоне, хлороформе и диоксане.

2. Принцип метода Хроматографический метод основан на извлечении зоокумарина из биологических объектов хлороформом, очистке экстракта на колонке с окисью алюминия с последующим хроматографическим определением пестицида в закрепленном тонком слое силикагеля по реакции диазосочетания или в виде метилового эфира на газовом хроматографе с электроноэахватным детектором. Чувствительность тонкослойной хроматографии - 2 мкг so о кумарина в

х) Разработана во Всесоюзном научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии &Л-.Болоховец, В.В.Ермаковым,

Д.Ф.Трахаловым ,утвержден 20 декабря,№50-76,

/Гб

пробе, а при навеске 25 г - С,2 мг/кг. Минимально-детектируемое количество о о оку марина на газовом хроматографе - 1 кг или О ,02 мг/кг. Степень обнаружения зоокумарина - 80-5%.

Спектрофотометричеекий метод основан нс извлечении зооци-да иэ пе но кумарина, кордов, мышсФной ткани и крови животных хлороформом с последующей очисткой экстракта на колонке с окисью алюминии и определением натриевой соли зеокум.арина по характерному поглощению света в ультрафиолетовой области спектра при Х0 нм. Чувствительность метода 10 мкг вещества в исследуемой пробе: 0,4 мл ленокумарика; 0,5 г корма; 25 г мышечной ткани и крови животных. Воспроизводимость 90# - 5%. Процент обнаружения добавок эооцида 90# - 3#.

3. Реактивы, растворы и их приготовление Кислота серная по ГОСТ 4204-66, 1 н раствор; хлороформ по ГОСТ 3160-51; кислота уксусная по ГОСТ 61-69; натрий сернокислый оеэводный по ГОСТ 4166-66; ацетон по ГОСТ 2603-71; аммиак водный по ГОСТ 3760-64;

натрий азотистокислый (нитрит натрия) по ГОСТ 4197-74; 1%-ный водный раствор; гексан;

диэтиловый эфир;

кислота соляная но ГОСТ 3113-67, 0,33 н раствор (готовят из фиксанала);

натрия гидрат окиси (натр едкий) по ГОСТ 4328-66 (2%-ньй раствор);

вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72;

насыщенный раствор 2,4-дихлоракилииа в С,33 н соляной кислоте. Берут 1 г вё&ества, смешивают со КС мл С_#СЗ н соляной кислоты и встряхивают а течение часа, л Ранят раствор в склянке темного стекла в холодильнике* Рейки* в устойчив в течение 3-х мееллеь;

реактив для выявления эсс куЛарина (хромогснньГ реагент): смешивают '2Ь гм 1,.- вс дне го ристнора нитрита -натри»! с 25 мл насыщенного раствора 2,4-Д их лора i лл.чна в 0 „33 ш оо<плк''Ц кислоте. Готовят не реже одного райи и неделю;

смесь растворителей, состоящая .до »пс:ьсзна и ацетона в соотношении 2:1;

основной раствор го с* кумарина, 1 мг/мл: растворяют 100 мг вещества в if0 ни ацетона;

рабочий раствор ио оку мар*/, на, 10 мкт/мп: разбавляют 1 мл основного раствори в LOG мл ацетона;

стандартный раствор 8оокуь.ирнна и нитр.чаьси соли воску-марина для спектроф-стоиег ричсокнх измерений, 0,1 мг /мл: растьорнют 10 мг зооцида в 2/*-нсм раствсре гидроокиси натрия в мерной колбе емкостью 1С0 ил; силикагель КСК; гипс медицинский; окись алкм'лния для хроматографии; кальций хлористый по ГОСТ 4161-67;

калий углекислый (кадия карбонат) но ГОСТ 10&^V'-64, растений порошок, прокаленный в течение 6 часов при температуре 160°. Храня! в эксикато| • над безводным хлористым кальцием;

метилирующий реагент: в колбу емкостью 100 мл вносят 6г безводного карбонита калия, 47,6 мл абсолютно! о. ацетона и 2,6 мл диметилсульфата. После перемешивания реактив хранят

без доступа ?оздух<*;

аце-гсн абсолютный: 0,5 л ицетсна встряхивают ЭО минут с 50 г безводного хлористого кальция. Обработанный ацетон перегоняют на хиг.ямяЬ водяной бане. Первые и последние 50 мл дистиллята отбрасывают, ч остальное'собирают :i склянку с притертой пробкой. Хранят без доступа иочдуха;

натри» хлористый ;ц» JWi 4X33-06, насыщенный водный раствор;

метипсилоксан St -<>0 (5/'), нанесенный на силаниаироминный хроматом о0-100 меш.

Зое реактивы дол*лы бить клал иЬикадии х.ч. или ч.д.а.

4. Прагоюнлепиа силикагеля н пластинок Гранулы силикагеля KCit размалымают в шаровой мельнице, после чего 500 г фракции, просеянной через сито 100 мет, смешивают с 1000 мл соляной кислоты, предварительно разбавленной в два раза водой. Через IX часов надо садочную жидкость декантируют , а осадок промывают три раза дистиллированной водой по 1000 мл до нейтральной реакции. Силикагель высушивают при комнатной температуре и промывают его трижды диэтиловым эфиром (порциями пс 300 мл). После высушивания адсорбент просеивают через сито 100 меш. Для приготовления пластинок 14 г силикагеля и 1 г прокаленного при 1*50° (5 часов) медицинского гипса тщательно растирают в фарфоровой ступке в течение 20 минут до получения однородной массы. Затем порошок переносят в колбу емкостью 250 мл, вносят Лю мл дистиллированной воды и смесь энергично встряхивают 15 минут до удаления пузырьков воздуха. Полученную гомогенную смесь наносят на пластинки по одной чайной ложке, пластинки рысушивают при комнатной тем-

/S9

перстуре в течение сутох.

Для хроматографиювания. можно использовать и пластинки типа* ''’Силуфол".

5. Приборы и посуда

Аналитические весы.

Шутелль-гппарат.

Хроматографические камеры, эксикатор по ГОСТ о371-73.

Спектрофотометр СФ-4& или другой для измерения поглощения в ультрафиолетовой области спектра.

Колбы Срленмейера емкость» 50, 100,250 мл.

Чашк« /и»н Спаривания ЯР 5 и 10.

Мерные цилиндры на 50 и ЮС мл.

Мерные колбы емкость» 100 мл.

Пипетки на 1, 2, 5 и 10 мл.

Микропипетки на 0,1 мл.

Воронки для фильтрования йР 3 и 5.

Пластинки стеклянные 9 см х 12 см.

Пробирки 15 см х 1,5 см и градуированные - емкостью 15 мл.

Колонки стеклянные для хроматографии: 1,5 см х 35 см.

В качестве колонки можно использовать ьихнюю часть бюретки на 100 ил, разрезав ее наполовину.

Колонка для газовой хроматографии: стекллиния, длиной 0,75 м, диаметром 3 мм.

иикрошприцы емкость» 1C мкл.

Газовый хроматограф Ц6ЕТ-5-68, Jiam-ЬЦД "П" или другой с электроннозахватным детектором.

Ваня водяная.

/СО

Мельница шаровая.

Ступка фарфоровая.

ХОД АНАЛИЗА 6.1. Подготовка проб 6.1_f1_Т Извлечение ^оорумапина иэ мышечной ткани и кро~ вр животных* 25 г гомогенййированного образца (мышечную ткань, кровь и другой ггатматериал, не подвергшийся гниению) помещают в колбу Зрлонмеивра емкостью 250 мл, куда вносят 10 мл 1 н серной кислоты. Содержимое перемешивают, добавляют 75 мл хлороформа и встряхивают на шутелль-аппарате 40 минут. Затем в колбу вносят через фильтровальную воронку небольшими порциями (во избежании образования комков) 65 г сульфата натрия. Отделившийся хлороформный экстракт фильтруют в колбочку емкостью 100 мл«через тампон стекловаты (или обычной ваты). Извлечение препарата повторяют еще раз с 60 мл хлороформа и образец встряхивают 15 минут. Профильтрованный через ватный тампон экстракт соединяют с первой фракцией.

Объединенные порции экстракта пропускают через колонку, которую готовят следующим образом, В ее нижнюю часть помещают слой ваты (1 см), вносят 10 г окиси алюминия и промывают 20 мл хлороформа; затем вносят экстракт. После того, как весь экатракт опустится до адсорбента, колонку промывают 100 мл чистого хлороформа, а затем 20 мл ацетона (для удаления коэкстрактивных веществ). Зоокумарин.элюируют 50 мл смеси ацетона и 2%-ного раствора гидрата окиси натрия (47:3). Элюат собирают в фарфоровую чашку № 10, добавляют 0,2 мл ледяной уксусной кислоты и выпаривают досуха на кипящей водяцой бане.

/6/

Для определения зоокумарина на спектрооютометре уксусную кислоту не добавляют.

6.1.2.    Извлечение зоокумарина из препарата пекокумарин.

После 2-х минутного энергичного встряхивания баллона с

препаратом отбирают около 1 г препарата в колбу Эряеимейера емкостью 10и мл. для хроматографического определения на каждые 20 мг пенокумарина добавляют I мл ацетона. Содержимое колбы перемешивают и выдерживаю? СС минут при комнатной температуре. Затем С,4 мл раствора переносят в фарфоровую чашку Ш 5, добавляют С ,2 мл ледяной уксусной кислоты и выпаривают досуха на кипящей водяной бане.

Для определения зоокумарина на спектрофотометре, отбирают около 1 г препарата в колбу Зрленмейера емкостью 100 мл* Пенокумарин растворяют в 2/£-ном растворе гидроокиси натрия из расчета i мл растворителя на 20 мг образца. Содержимое колбы перемешивают и выдерживают на водяной бане при 60° до исчезновения пены. Затем раствор фильтруют через бумажный фильтр.

6.1.3.    Извлечение зоокумарина из кормов (приманок).

0,5 г корма (приманки - в зернах целых или размолотых)

помещают в колбу Эрленмейера емкостью 100 мл, куда вносят 3 ч/ 1 н серной кислоты. Содержимое перемешивают, добавляют 25 мл хлороформа и встряхивают, на шуттель-аг.парате 40 минут. Затем в колбу вносят через фильтровальную воронку небольшими порциями 8-10 г сульфата натрия. Отделившийся хлороформный экстракт фильтруют через ватный тампон в колбочку емкостью 5С мл. Извлечение повторяют еще раз, добавляя 15 мл хлороформа и встряхивая образец в течение 15 минут.

‘Экстракт фильтруют через ватный тампон и полученную

порцию фильтрата соединяют с первой фракцией, а затеи пропускают черев колонку, которую готовят как и при исследовании мышечной ткани или крови. Через колонку пропускают 20 мл хлороформа, (промывают). После того , как весь экстракт опустится до адсорбента, колонку промывают последовательно 50 мл хлороформа и 20 мл ацетона. Зоокумарин элюируют 50 мл смеси ацетона и 2^-ного раствора гидроокиси натрия (47:3). Злюат собирают в фарфоровую чашку № 10, добавляют 0,2 мл ледяной уксусной кислоты и выпаривают досуха на кипящей водяной бане.

При спектрофотометрическом определении эоокумарина уксусную кислоту не добавляют.

6.2. XР0;А4Т0ГРАФИ.ЧШхО£ ШРЕАЫ»£НИЕ SGGJCyЛАРИНА

0.2.1. Тонкослойная хроматография

Полученный после выпаривания остаток растворяют в 0,5 мл ацетона и полностью наносят на пластинку микропипеткой или пипеткой Пастера. Одновременно готовят свидетели, внося в фарфоровую чашку 5-10 мкг вещества, что соответствует 0 ,5 -1,0 мл рабочего раствора зоокумарина. Образцы наносят на пластинки в следующей последовательности: свидетель (5 мкг), образец ( 1 повторность), образец (П повторность), свидетель (10 мкг). Размер пятна не должен превышать 0,5 см. Места нанесения проб располагают на расстоянии 1,5 - 2,0 ем друг от друга и от нижнего и боковых краев пластинки; пятна не должны погружиться в растворитель. В химеру для хроматсграфиро-вания ( эксикатор ) наливают 60 мл смеси гексана и анетона (3:1) и через 2С минут помещают пластинку в вертикальном положении. Камеру, гермитичпо закрывают. Хроматографирование проводят при температуре не ниже 20^е. После того как растворитель* поднимется на высоту 6-9 см, пластинку вынимают, от-

/63