государственный стандарт

РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

ПРОДУКЦИЯ КОСМЕТИЧЕСКАЯ

Обнаружение и определение содержания N-нитрозодиэтаноламина (NDELA) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (HPLC-MS-MS)

ПРАДУКЦЫЯ КАСМЕТЫЧНАЯ

Выяуленне i вызначэнне змяшчэння 1\1-нпрозадыэтаноламшу (NDELA) метадам высокаэфектыунай вадкаснай храматаграфМ з тандэмнай мас-спектраметрыяй (HPLC-MS-MS)

(ISO 15819:2014, ЮТ)

Издание официальное

Г осстандарт Минск

Предисловие

Евразийский совет по стандартизации, метрологии и сертификации (ЕАСС) представляет собой региональное объединение национальных органов по стандартизации государств, входящих в Содружество Независимых Государств. В дальнейшем возможно вступление в ЕАСС национальных органов по стандартизации других государств.

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН научно-производственным республиканским унитарным предприятием «Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации» (БелГИСС)

2    ВНЕСЕН Госстандартом Республики Беларусь

3    ПРИНЯТ Евразийским советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол № 88-П от 25 мая 2016 г.)

За принятие стандарта проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004—97 Код страны по МК (ИСО 3166) 004—97 Сокращенное наименование национального органа по стандартизации Армения AM Минэкономики Республики Армения Беларусь BY Госстандарт Республики Беларусь Казахстан KZ Госстандарт Республики Казахстан Кыргызстан KG Кыргызстан дарт Российская Федерация RU Росстандарт Таджикистан TJ Т аджикстандарт

4 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 15819:2014 Cosmetics — Analytical methods — Nitrosamines. Detection and detemiination of N-nitrosodiethanolamine (NDELA) in cosmetics by HPLC-MS-MS (Обнаружение и определение содержания N-нитрозодиэтаноламина (NDELA) в косметической продукции методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной м асс-сп екгром етр ией (Н Р LC-MS-MS)).

Международный стандарт разработан техническим комитетом по стандартизации ISO/TC 217 «Косметика» Международной организации по стандартизации (ISO).

В стандарт внесено следующее редакционное изменение: наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования международного стандарта с целью применения обобщающего понятия в наименовании стандарта в соответствии с ГОСТ 1.5-2001.

Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий государственный стандарт, и международных стандартов, на которые даны ссылки, имеются в Национальном фонде ТИПА.

В разделе «Нормативные ссылки» и тексте стандарта ссылки на международные стандарты акгуап и зи р ованы.

Сведения о соответствии межгосударственного стандарта ссылочному международному стандарту приведены в дополнительном приложении Д.А.

Степень соответствия — идентичная (IDT)

© Госстандарт, 2016

Настоящий стандарт не может быть воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Госстандарта Республики Беларусь

ГОСТ ISO 15819-2016

8.3 Процедура проверки достоверности и ее критерии

Относительные интенсивности двух ионов (104 и 74), обнаруженных в подготовленных пробах, выраженные в виде процента интенсивности наиболее интенсивного иона, должны соответствовать интенсивности стандартных растворов, используемых для калибровки, при соизмеримых концентрациях, измеренных в одинаковых условиях, с учетом допустимых отклонений, приведенных в таблице 1.

Достоверность результатов проверяют для каждого измерения пробы, при котором концентрация NDELA выше предела обнаружения (см. [1]).

Таблица 1 — Максимальные допустимые отклонения для относительных интенсивностей иона

Относительная интенсивность (% интенсивности основного иона) Относительный диапазон чувствительности > 50 % ±20 % свыше 20 % по 50 % ±25 % Свыше 10 % по 20 % ±30 % < 10 % ±50 %

8.4 Вычисление концентраций

Вычисляют концентрации, с, нг/см³, экстрактов проб, используя калибровочную кривую и значения R, рассчитанные ранее для каждой пробы.

Концентрации NDELA проб неизвестного состава вычисляют по формуле (1):

W=c*Vlm,    (1)

где W — массовая доля NDELA в пробе косметической продукции, нг/г; с — концентрация NDELA, определенная в экстрактах, нг/см³; т — масса пробы косметической продукции, г;

V — объем разбавителя косметической продукции, см³ (пример: 20 см³ для извлечения ТФЭ, 4 см³ для извлечения ДХМ).

Примечание — Значения V корректируют в случае использования отличающихся объемов (если это допускается, см. примечания в 6.3.1 и 6.3.2).

9 Протокол испытания

Протокол испытания должен содержать следующую информацию:

a)    идентификационные данные испытуемой продукции;

b)    и д енти фи каци онныеданныелабор атор ии, провод и вшей и сп ытани е;

c)    ссылку на настоящий стандарт;

d)    дату и способ отбора проб (если эта информация известна);

e)    дату получения пробы лабораторией;

f)    дату проведения испытания;

д) результаты испытания и единицы, в которых выражены эти результаты;

h)    метод экстрагирования;

i)    любые особенности, наблюдаемые при испытании;

j)    все операции, не предусмотренные данным методом или рассматриваемые как необязательные, которые могли повлиять на результат;

k)    идентификационные данные и подпись специалиста, ответственного за подготовку протокола.

7

ГОСТ ISO 15819-2016

Приложение А (справочное)

Примеры калибровочной кривой и хроматограмм

Ось X — концентрация NDELA в стандартных растворах (нг/см );

Ось Y — значение R

Рисунок А.1 — Пример калибровочной кривой для NDELA

8

ГОСТ ISO 15819-2016

Библиография

[1] Commission Decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results

(Решение Комиссии от 14 августа 2002 г., реализующее Директиву Совета 96/23/ЕС относительно осуществления аналитических методов и толкования результатов)

10

Приложение Д.А (справочное)

Сведения о соответствии межгосударственного стандарта ссылочному

международному стандарту

Таблица Д.А.1 — Сведения о соответствии мехгосударственного стандарта ссылочному меходународному стандарту

Обозначение и наименование международного стандарта Степень соответ ствия Обозначение и наименование межгосударственного стандарта ISO 3696:1987 Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний ют ГОСТ ISO 3696-2013 Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы контроля

11

УДК 665.58.014:543.544.5.068.7(083,74)(476)    МКС 75.080    ЮТ

Ключевые слова: парфюмерно-косметическая продукция, N-нитрозамины, N-нитрозод и этанол амин, хроматография, масс-спектр оскопи я

12

Ответственный за выпуск Н. А. Баранов

Сдано в набор 07.10.2016. Подписано в печать 21.10.2016. Формат бумаги 60x64/8. Бумага офсетная. Гарнитура Arial. Печать ризографическая. Уел. печ. л. 2,09 Уч.-изд. л. 0,78 Тираж2 экз. Заказ 1917

Издатель и полиграфическое исполнение:

Научно-производственное республиканское унитарное предприятие «Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации» (БелГИСС) Свидетельство о государственной регистрации издателя, изготовителя, распространителя печатных изданий

№ 1/303 от 22.04.2014 ул. Мел ежа, 3, комн. 406, 220113, Минск.

ГОСТ ISO 15819-2016

5ВВЕДЕН ВДЕЙСТВИЕ постановлением Госстандарта Республики Беларусь от 19 августа 2016 г. № 66 непосредственно в качестве государственного стандарта Республики Беларусь с 1 апреля 2017 г.

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных (государственных) стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных (государственных) органов по стандартизации.

Введение

Окружающая среда, продукты питания, средства личной гигиены могут выступать в качестве источников N-нитрозаминов, с которыми непосредственно взаимодействует человек. В ходе исследований было выявлено, что N-нитрозамины проявляют потенциальную канцерогенную активность в отношении некоторых видов животных, в связи с чем минимизация воздействия N-нитрозаминов на организм человека признана одной из важнейших целей сохранения здоровья людей. Среди N-нитрозаминов N-нитрозоди этанол амин (NDELA) признан в качестве потенциального загрязнителя косметической продукции.

В связи с этим было разработано несколько аналитических методов обнаружения и определения присутствия NDELA в косметической продукции. Примерами таких методов являются метод газовой хроматографии/гермоэнергетический анализ, высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании либо с фотолизом и колориметрическим количественным определением, либо с последующим масс-спекгрометрическим определением. В последнем методе применяются новейшие технологии, обеспечивающие максимальную точность определения NDELA, позволяющие минимизировать риск искусственного образования NDELA в анализируемой продукции и провести точное количественное определение.

Данный метод включает в себя обнаружение и определение содержания N-нитрозодиэтано-л амин a (NDELA) в косметической продукции и ингредиентах косметической продукции при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией.

IV

_ГОСУДАРСТВЕННЫЙ    СТАНДАРТ    РЕСПУБЛИКИ    БЕЛАРУСЬ_

ПРОДУКЦИЯ КОСМЕТИЧЕСКАЯ Обнаружение и определение содержания N-нитрозодиэтаноламина (NDELA) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (HPLC-MS-MS)

ПРАДУКЦЫЯ КАСМЕТЫЧНАЯ Выяуленне i вызначэнне змяшчэння N-штрозадыэтаноламшу (NDELA) метадам высокаэфектыунай вадкаснай храматаграфМ з тандэмнай мас-спектраметрыяй (HPLC-MS-MS)

Cosmetics

Detection and determination of N-nitrosodiethanolamine (NDELA) by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS)

Дата введения — 2017-04-01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод обнаружения и определения содержания N-нитрозоди-этаноламина (NDELA) в косметической продукции и сырье для ее изготовления.

Данный метод не применяется для обнаружения и/или определения содержания других нитроза-минов, а также для обнаружения и/или определения содержания NDELA в продукции, не являющейся косметической продукцией или сырьем для ее изготовления.

Если загрязнение продукции NDELA возможно посредством ингредиентов, либо образование NDELA возможно в результате смешения ингредиентов, метод может применяться для количественного определения NDELA. Вместе с тем данный метод не является стандартным для косметической продукции, поскольку область применения настоящего стандарта охватывает большое количество разнообразной косметической продукции и может потребоваться адаптация данного метода к некоторым матрицам (см. ISO 12787).

В связи с этим стандарты, устанавливающие альтернативные методы определения нитрозами-нов в косметической продукции, разрабатываются отдельно. Другие методы могут быть применены при условии, что они прошли проверку на способность обнаруживать NDELA и валидированы в условиях воспроизводимости и количественного определения.

2    Нормативные ссылки

Для применения настоящего стандарта необходимы следующие ссылочные стандарты. Для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного документа, для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта (включая все его изменения).

ISO 3696:1987 Water for analytical laboratory use — Specification and test methods (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)

ISO 12787:2011 Cosmetics — Analytical methods — Validation criteria for analytical results using chromatographic techniques (Косметика. Аналитические методы. Критерии валидации аналитических результатов с использованием методов хроматографии)

3    Сущность метода

Экстрагируют NDELA из проб косметической продукции при помощи воды, содержащей дейтериро-ванный d8-NDELA, применяемый в качестве внутреннего стандарта (IS). Если пробы не диспергируются в воде, извлечение выполняют посредством твердофазной экстракции (ТФЭ, см. 6.3.1) с использованием картриджа С18, либо жидкостной экстракции, используя дихлорметан в качестве растворителя (извлечение ДХМ, см. 6.3.2). Экстракты анализируют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (HPLC-MS-MS).

Издание официальное

Идентификацию NDELA проводят при помощи молекулярного иона и двух диагностических ионов. Осуществляют количественное определение NDELA путем сравнения соотношения основных фрагментарных ионов NDELA и d8-NDELA с калибровочной кривой.

В соответствии с ISO 12787 отсутствие NDELA в пробе может быть подтверждено путем проведения дополнительного анализа. Меченый препарат с известным количеством определяемого вещества может быть приготовлен для оценки предела обнаружения NDELA в пробе.

Если наблюдается матричный эффект, оказывающий существенное воздействие на характеристики метода (чувствительность, точность и т. д.) при испытании определенной косметической продукции, калибровка может проводиться методом стандартных добавок (см. ISO 12787).

4    Реактивы

При проведении анализа, если не указано иное, должны применяться реактивы только аналитической степени чистоты и только дистиллированная вода или вода первой степени чистоты в соответствии с ISO 3696:1987. Растворители должны бьпъ пригодны для HPLC-MS анализа.

4.1    Метанол (МеОН), пригодный для HPLC-MS анализа.

4.2    Этанол (ЕЮН), пригодный для HPLC-MS анализа.

4.3    Дихлорметан (ДХМ), пригодный для HPLC-MS анализа.

4.4    N-Нитрозодиэтаноламин, известной степени чистоты, превышающей 95 %.

4.5    d8-N-Нитрозодиэтаноламин, известной степени чистоты, превышающей 95 %.

4.6    Ацетат аммония (CH₃COONH₄), аналитической степени чистоты, пригодный для HPLC-MS анализа.

4.7    Раствор ацетата аммония концентрацией 1 моль/дм³, для приготовления 1,0 дм³ раствора растворяют 77,08 г CH₃COONH₄ в 1,0 дм³ воды.

4.8    Элюент А: раствор CH₃COONH₄ концентрацией 2 ммоль/ дм³, для приготовления 1,0 дм³ раствора берут 2 см³ раствора CH₃COONH₄ концентрацией 1 моль/дм³ (4.7) и доводят объем водой до 1 дм³.

4.9    Элюент В: раствор CH₃COONH₄ концентрацией 2 ммоль/дм³ в смеси МеОН и воды, взятых в соотношении 90:10 (по объему), для приготовления 1,0 дм³ элюента В берут 2 см³ раствора CH₃COONH₄ концентрацией 1 моль/дм³ (4.7) и доводят объем раствора до 1 дм³ смесью МеОН и воды, взятых в соотношении 90:10 (v/v).

5    Аппаратура

Используется стандартное лабораторное оборудование, а также:

5.1    Вихревой смеситель.

5.2    Система для проведения твердофазной экстракции, система применяется для проведения твердофазной экстракции (ТФЭ) проб [например Vacmaster®^{1 2}].

5.3    Высокоскоростная центрифуга (максимальное ускорение 20000 д).

Примечание — Если применяется центрифуга с максимальным ускорением менее 20000 д, повышенное внимание дол>то быть уделено возмо>тости засорения во время извлечения анализируемого вещества в процессе ТФЭ. При необходимости в процесс может быть включен дополнительный этап фильтрации через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм.

5.4    Колонки для твердофазной экстракции, например, Bakerbond® ¹С18-6 см³, 500 мг обращенно-фазного октадецилсилана, привитого на силикагель, 40 мкм APD (средний диаметр частиц), 60А.

5.5    Оборудование для HPLC-MS-MS.

5.5.1    Аппаратура для жидкостной хроматографии высокого разрешения, включающая: резервуар для элюирования, насос, систему ввода пробы в сочетании с тандемной масс-спектрометр и ей с электрораспылением, систему обработки данных, например, компьютер.

5.5.2    Хроматографическая аналитическая колнка с обращенной фазой С18, например, Spherisorb®¹ ODS II (октадецил силан), с пред кол он кой, размеры данных колонок следующие:

- хроматографическая колонка:

-    длина: 100 мм;

-    внутренний диаметр: 2,1 мм;

ГОСТ ISO 15819-2016

-    размер частиц: 5 мкм;

- предколонка:

-длина: 10 мм;

-    внутренний диаметр: 2,1-3,0 мм;

-    размер частиц: 5 мкм.

Использование предколонки не является обязательным. Если же предколонка используется, то желательно, чтобы ее внутренний диаметр был равен внутреннему диаметру разделительной колонки. Условия хроматографирования выбирают в зависимости от марки используемой в обращенно-фазной HPLC разделительной аналитической колонки.

6 Приготовление и хранение проб

6.1    Общие положения

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Большинство N-нитроз аминов являются потенциальными канцерогенами, необходимо предпринять все возможные меры предосторожности во избежание воздействия их на человека

Все операции, связанные с использованием N-нитрозаминов или их растворов, должны выполняться в хорошо вентилируемом вытяжном шкафу или ламинарном боксе.

Часто применяемые резиновые хирургические перчатки не обеспечивают достаточной защиты. Их необходимо снимать и выбрасывать сразу же после использования и не носить в течение длительного периода времени.

Любые растворы, содержащие N-нитрозамины, должны удаляться безопасным способом (например, помещаться в жестяные банки или ведра для опасных химических отходов).

N-нитрозодиэтаноламин должен храниться в защищенном от света месте при температуре 2 °С-^8 °С.

Ультрафиолетовые (УФ) лучи разлагают N-нитрозамины, поэтому все растворы N-нитрозаминов (стандартные/экстракты) должны храниться таким образом, чтобы предотвратить их порчу и изменение состава.

Анализ методом HPLC-MS-MS проводят, как правило, в течение 30 мин после приготовления экстрактов проб. Если проведение испытания откладывают, следует проверить стабильность всех стандартных растворов и экстрактов.

6.2    Приготовление стандартных растворов

6.2.1    Готовят исходный раствор (A) NDELA, содержащий приблизительно 1,0 мг NDELA/cm³ этанола, соблюдая все правила техники безопасности, и хранят в защищенном от света месте при температуре ниже минус 18 °С. Записывают точную концентрацию раствора.

6.2.2    Готовят исходный раствор (d8A) d8-NDELA, содержащий приблизительно 1,0 мг dS-NDELA/см³ этанола, соблюдая все правила техники безопасности, и хранят в защищенном от света месте при температуре ниже минус 18 °С. Записывают точную концентрацию раствора.

6.2.3    Готовят рабочие растворы (В, С, D, Е и F) последовательным разбавлением исходного раствора (А). Все растворы хранят в защищенном от света месте при температуре 2 °С^8 °С.

Рабочие растворы	Объем исходного или рабочего раствора	Объем воды	Конечная концентрация	Период стабильности
Рабочий раствор В	100 ммл А	900 ммл	100,0 мкг/смл	1 сут
Рабочий раствор С	100 ммл В	900 ммл	10,0 м кг/см J	1 сут
Рабочий раствор D	100 ммл С	900 ммл	1,0 мкг/см л	1 сут
Рабочий раствор Е	100 ммл D	900 ммл	100,0 нг/смл	1 сут
Рабочий раствор F	100 ммл Е	900 мм"	10,0 нг/смл	1 сут

Примечание — Пользователи данного стандарта могут регулировать фактический объем приготавливаемого раствора при условии, что будет обеспечена конечная концентрация.

6.2.4 Готовят рабочие растворы d8 (d8B и d8C), последовательно разбавляя исходный раствор (d8A). Все растворы хранят в защищенном от света месте при температуре 2 °С^8 °С.

Рабочие растворы d8	Объем исходного или рабочего раствора	Объем воды	Конечная концентрация	Стабильность
Рабочий раствор d8B	20 ммл d8A	20 см J	1,0 м кг/смл	1 сут
Рабочий раствор d8C	200 ммл d8B	1800 ммл	100,0 нг/смJ	1 сут

Примечание — Пользователи данного стандарта могут регулировать фактический объем приготавливаемого раствора при условии, что будет обеспечена конечная концентрация.

6.2.5 Готовят стандартные растворы путем разбавления рабочих растворов. Строят стандартную калибровочную кривую для диапазона концентраций от 1,0 нг/см³ до 80,0 нг/см³, используя не менее пяти из семи стандартных растворов, приведенных в таблице ниже. Стандартный раствор, концентрация которого соответствует установленным пределам количественного определения (или более низкой), также должен быть включен. Концентрация внутреннего стандарта d8-NDELA составляет 20 нг/см³ в каждом растворе. Все растворы хранят в защищенном от света месте при температуре 2 °С-8 °С.

Стандартные растворы	Объем рабочего раствора	Объем рабочего раствора d8C	Объем во-ды	Конечная концентрация		Период стабильности
				NDELA	d8-NDELA
Стандартный раствор 1	800 мм3 Е	200 мм3	-	80,0 нг/см3	20 нг/см3	1 сут
Стандартный раствор 2	400 мм3 Е	200 мм3	400 мм3	40,0 нг/см3	20 нг/см3	1 сут
Стандартный раствор 3	200 мм3 Е	200 мм3	600 мм3	20,0 нг/см3	20 нг/см3	1 сут
Стандартный раствор 4	100 мм3 Е	200 мм3	700 мм3	10,0 нг/см3	20 нг/см3	1 сут
Стандартный раствор 5	500 мм3 F	200 мм3	300 мм3	5,0 нг/см3	20 нг/см3	1 сут
Стандартный раствор 6	250 мм3 F	200 мм3	550 мм3	2,5 нг/см3	20 нг/см3	1 сут
Стандартный раствор 7	100 мм3 F	200 мм3	700 мм3	1,0 нг/см3	20 нг/см3	1 сут

Примечание 1 — В зависимости от чувствительности измерительных приборов стандартная калибровочная кривая и процедура приготовления проб могут быть адаптированы с целью сведения к минимуму возможного матричного эффекта (см. 6.3.3).

Примечание 2 — Пользователи данного стандарта могут регулировать фактический объем приготавливаемого раствора при условии, что будет обеспечена конечная концентрация.

6.3 Подготовка пробы

6.3.1 Извлечение посредством твердофазной экстракции (ТФЭ)

Аккуратно взвешивают приблизительно 1,0 г пробы (записывают точную массу), добавляют 400 мм^трабочего раствора d8B и доводят объем водой до 20,0 см³. Встряхивают полученную смесь в течение 15 мин. При необходимости используют проявляя надлежащую осторожность, ультразвуковую ванну и/или центрифугируют в течение 10 мин. Для исключения дальнейшего образования нитрозам и нов ультразвуковую обработку следует минимизировать.

Примечание — В том случае, если метод HPLC-MS-MS обладает достаточной чувствительностью, может быть использована меньшая масса пробы и/или больший начальный объем воды для адаптации к определенным матрицам, а также для уменьшения возмо>тости подавления ионизации вследствие совместного элюирования компонентов матрицы. При изменении начального объема воды необходимо, чтобы концентрация внутреннего стандарта оставалась стабильной как в стандартном растворе, так и в растворе пробы. В противном случае корректные вычисления осуществить невозможно.

Кондиционируют колонку С18 для твердофазной экстракции 3,0 см³ метанола, а затем 3,0 см³ воды при скорости потока приблизительно 3,0 см³/мин. Колонка не должна высыхать.

ГОСТ ISO 15819-2016

Помещают около 5 см³ пробы, подготовленной для экстрагирования, в вышеупомянутую колонку С18 для твердофазной экстракции, первые приблизительно 3 см³ извлеченного раствора удаляют. Собирают в пробирку следующие извлекаемые приблизительно 2 см³ раствора (при скорости потока приблизительно 3,0 см³/мин).

При необходимости пробу готовят в трех повторностях.

6.3.2    Альтернативный способ подготовки недиспергируемых в воде проб (извлечение ДХМ)

Взвешивают аккуратно приблизительно 0,2 г пробы в пробирке для центрифугирования (записывают точную массу), добавляют 800 мм³ рабочего раствора d8C и встряхивают в течение 1 мин. Добавляют 4 см³ ДХМ и встряхивают в течение 1 мин. Добавляют 3,2 см³ воды и встряхивают в течение 5 мин.

Примечание — В том случае, если метод HPLC-MS-MS обладает достаточной чувствительностью, может быть использована меньшая масса пробы и/или больший начальный объем воды для адаптации к определенным матрицам, а также для уменьшения возможности подавления ионизации вследствие совместного элюирования компонентов матрицы. При изменении начального объема воды необходимо, чтобы концентрация внутреннего стандарта оставалась стабильной как в стандартном растворе, так и в растворе пробы. В противном случае корректные вычисления осуществить невозможно.

Центрифугируют полученную смесь при максимально возможном ускорении (предпочтительно 20 000 д) в течение 5 мин. Порцию верхнего водного слоя используют для хроматографического анализа.

При необходимости фильтруют отобранный раствор, используя подходящий фильтр.

При необходимости пробу готовят в трех повторностях.

6.3.3    Дальнейшее разбавление подготовленной пробы и стандартных растворов (в случае необходимости)

Рекомендуется дополнительное разбавление экстрактов проб и (соответственно) стандартных растворов с целью сведения к минимуму потенциального воздействия совместного элюирования компонентов матрицы, которое может подавить ионизацию NDELA, ограничивая тем самым чувствительность метода. Разбавление экстрактов проб и стандартных растворов в воде рекомендуется в зависимости от чувствительности используемой в методе HPLC-MS-MS системы.

6.3.4    Хранение проб

При необходимости пробы можно хранить в защищенном отсвета месте при температуре ниже 8 °С.

7 Процедура

7.1    Общие положения

Анализируют содержание NDELA методом HPLC-MS-MS в полученном одним из двух способов экстракте.

7.2    Условия проведения хроматографии

Подвижная фаза:    Элюент    А    — раствор CH₃COONH₄ концентрацией 2 ммоль/дм³ в воде (4.8)

Элюент В — раствор CH₃COONH₄ концентрацией 2 ммоль/дм³ в смеси МеОН и воды, взятых в соотношении 90:10 (по объему) (4.9).

Интервал, мин	% А	% В
0-1,5	97	3
1,5-1,6	о т 1^ О)	3^100
1,6-4,0	0	100
0 1	0—>97	100^3
о (О 1	97	3

0,4 см³/мин 20 мм³

30 °С

при температуре не выше 8 °С в защищенном от света месте (рекомендуется)

Серия впрыскивания проб:    Каждая серия состоит, по меньшей мере, из пяти точек

калибровки и, по меньшей мере, из одной контрольной пробы (представляющей собой стандартный раствор) на каждые 15 экстрактов проб (для серии, состоящей менее чем из 15 экстрактов проб, необходимо включить, как минимум, одну контрольную пробу). Обычно объем серии включает не более 20 экстрактов проб. Допускается применять серии, содержащие большее количество экстрактов проб, при условии, что была подтверждена достаточная стабильность ввода пробы.

Может потребоваться адаптация условий хроматографирования для определенных матриц при условии надлежащей верификации (см. ISO 12787).

7.3 Условия HPLC-MS-MS

Ионизация электрораспылением с образованием положительно заряженных ионов.

Пример соответствующих параметров для тройного квадрупольного масс-спектрометра [такого какАВ Sciex 5500®⁴].

Параметры источника

-    Напряжение на распылителе (ISV)

-    Потенциал декластеризации (DP)

-    Температура источника (ТЕМ)

-    Газ-распылитель (GS1)

-    Турбо газ (GS2)

-    Газовая завеса (CUR)

Параметры анализатора

-    Режим сканирования

-    Разрешение Q1

-    Разрешение Q3

-    Диссоциированный газ, активированный столкновениями (CAD)

Характеристические ионы 135 (М+Н), 104 и 74 (фрагментарные ионы) идентифицируют присутствие NDELA в пробе.

Количественное определение NDELA осуществляется путем использования отношения интенсивностей двух основных фрагментарных ионов 104 (из NDELA) и 111 [образующегося из 143 (М+Н) иона d8-NDELA],

8 Вычисление результатов

8.1    Определение значения R

Вычисляют значение R, как отношение интенсивности иона 104, образующегося вследствие фрагментации иона NDELA (М+Н), и интенсивности иона 111, образующегося вследствие фрагментации иона d8-NDELA (М+Н) (см. рисунок А.2 как пример), для каждого впрыскивания пробы (точка калибровки, экстракт пробы и контрольная проба).

Вычисленные значения R используют для построения калибровочной кривой и определения концентрации, с, в соответствии с 8.4.

8.2    Калибровочная кривая

Строят калибровочную кривую, нанося на график концентрацию NDELA в стандартных растворах (см. 6.2.5) относительно значения R для данных растворов.

В случае количественного определения коэффициент корреляции калибровочной кривой должен быть выше или равен 0,990 (см. рисунок А.1 как пример).

1

Vacmaster®, Bakerbond® и Spherisorb® являются примером оборудования, имеющегося в продаже. Эта ин

2

формация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой указанного продукта со стороны ISO.

3

4

АВ Sciex 5500 Triple QuacP является примером подходящего изделия, имеющегося в продаже, и соответствующие параметры могут зависеть от системы HPLC-MS-MS. Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего документа и не является одобрением ISO зтих изделий.