МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
Единая система защиты от коррозии и старения
МАСЛА И СМАЗКИ
Методы лабораторных испытаний на стойкость
к воздействию плесневых грибов
Unified system of corrosion and ageing
protection. Oils and greases.
Laboratory test methods for
mould resistance
|
ГОСТ
9.052-88
|
Дата введения 01.01.89
Настоящий стандарт распространяется на масла и смазки
и устанавливает методы лабораторных испытаний на стойкость к воздействию
плесневых грибов:
1 - для установления грибостойкости масел и смазок при
отсутствии минеральных и органических загрязнений;
2 - для установления грибостойкости смазок в условиях,
имитирующих минеральные загрязнения;
3 - для установления грибостойкости масел в условиях,
имитирующих минеральные загрязнения;
4 - для установления грибостойкости масел и смазок в
условиях, имитирующих минеральные и органические загрязнения.
Смазки, применяемые для оптических приборов,
испытывают только методом 1.
Методы применяют при испытании масел и смазок, к
которым в стандартах или технических условиях предъявляют требования
грибостойкости.
1. МЕТОД 1
1.1. Сущность метода заключается в выдерживании
образцов зараженных водной суспензией спор грибов, в условиях оптимальных для
развития грибов, без дополнительного источника минерального и органического
питания.
1.2. Отбор образцов
1.2.1. Масла и смазки отбирают по
ГОСТ
2517 массой 10 - 15 г.
1.2.2. Образцами являются масла и смазки в состоянии
поставки, без специальной очистки и стерилизации.
1.2.3. Количество параллельных образцов должно быть не
менее пяти.
1.3. Виды грибов
1.3.1. Для испытаний применяют
чистые культуры следующих видов плесневых грибов:
Aspergillus niger van Tieghem
Penicillium chrysogenum Thorn
Penicillium cyclopium Westling
Scopulariopsis brevicaulis (Sacc.) Bainier
Paecilomyces varioti Bainier
1.3.2. Культуры грибов получают в Институте биохимии и
физиологии микроорганизмов АН СССР, поддерживают периодическим пересевом и
выращивают непосредственно перед испытаниями.
1.3.3. Пересев, выращивание и
хранение культур грибов - по ГОСТ 9.048.
1.4. Аппаратура, материалы и
реактивы - по ГОСТ 9.048.
1.5. Подготовка к испытаниям
1.5.1. Посуду и материалы готовят
по ГОСТ 9.048.
1.5.2. Среды для выращивания,
хранения культур грибов и для испытаний готовят по ГОСТ 9.048.
Рецептура сред приведена в таблице.
Наименование
реактива
|
Среда 1
(Чапека-Докса с агаром)
|
Среда 2
(Чапека-Докса с агаром без сахарозы)
|
Среда 3
(выщелоченный агар)
|
Среда 4 (сусло-агар)
|
Среда 5
(минеральная без сахарозы)
|
Однозамещенный фосфорнокислый
калий, г
|
0,7
|
0,7
|
-
|
-
|
1,0
|
Двузамещенный фосфорнокислый
калий, г
|
0,3
|
0,3
|
-
|
-
|
-
|
Сернокислый магний, г
|
0,5
|
0,5
|
-
|
-
|
0,5
|
Азотнокислый натрий, г
|
2,0
|
2,0
|
-
|
-
|
3,0
|
Хлористый калий, г
|
0,5
|
0,5
|
-
|
|
2,0
|
Сернокислое железо, г
|
0,01
|
0,01
|
-
|
-
|
-
|
Сахароза, г
|
30,0
|
-
|
-
|
-
|
-
|
Агар-агар, г
|
30,0
|
Выщелоченный 30,0
|
Выщелоченный 30,0
|
30,0
|
-
|
Четырехбаллинговое неохмеленное
пивное сусло (4 % сахара), см3
|
-
|
-
|
-
|
До 1000
|
-
|
Дистиллированная вода, см3
|
До 1000
|
-
|
-
|
Водопроводная вода, см3
|
-
|
-
|
-
|
-
|
До 1000
|
|
|
|
|
|
|
|
1.5.3. Чистые культуры грибов
пересевают и выращивают по ГОСТ 9.048,
используя грибы, приведенные в п. 1.3.1
1.5.4. Для размещения образцов
масел в чашку Петри наливают 20-30 см3 среды 3 и дают ей застыть. В
застывшей среде просверливают пять лунок глубиной около 5 мм с помощью
стерильного сверла диаметром 10 мм и наливают образцы масел на 1 мм ниже уровня
среды.
Образцы смазок наносят на предметные стекла, покрывая
всю поверхность слоем 1,5-2,0 мм, и помещают в чашки Петри.
1.5.5. Контроль жизнеспособности
спор грибов проводят по ГОСТ 9.048.
Для контроля жизнеспособности спор грибов в чашку
Петри наливают среду 1 или 4 в количестве 20-30 см3 и дают ей
застыть
1.6. Проведение испытаний
1.6.1. Водную суспензию спор
грибов готовят по ГОСТ 9.048,
используя грибы, выращенные, как указано в п. 1.5.3.
1.6.2. Предметные стекла в чашках
Петри, чашки Петри с образцами масел помещают в бокс. Поверхность образцов
заражают водной суспензией спор грибов с помощью пульверизатора, не допуская
слияния капель.
1.6.3. Образцы масел и смазок после заражения
выдерживают 1-2 ч при температуре (25 ± 10) °С.
1.6.4. Предметные стекла в чашках
Петри и чашки Петри с зараженными образцами и средами помещают в эксикатор, на
дно которого налита вода. Эксикатор устанавливают в термостат с температурой
(29 ± 2) °С.
1.6.5. Образцы выдерживают в термостате 56 сут.
1.6.6. Через 3-7 сут после начала
испытаний осматривают контрольную чашку Петри. Если на поверхности среды
развитие грибов не наблюдается, споры грибов считают нежизнеспособными.
Испытания прекращают и повторяют их на новых образцах с вновь приготовленной
суспензией спор из новой партии грибов.
1.6.7. Через 28 сут производят промежуточный осмотр
образцов. Испытания образцов, на которых обнаруживают развитие грибов,
прекращают.
1.6.8. По окончании испытаний
предметные стекла в чашках Петри и чашки Петри извлекают из эксикатора и
осматривают образцы.
1.7. Обработка результатов
1.7.1. Образцы смазок и масел
осматривают под микроскопом при 50-60-кратном увеличении.
1.7.2. Масла и смазки считают
грибостойкими при отсутствии развития грибов на всех испытанных образцах.
2. МЕТОД 2
2.1. Сущность метода заключается в выдерживании
образцов, зараженных суспензией спор грибов в водном растворе минеральных
солей, в условиях, оптимальных для развития грибов, на среде с дополнительным
источником минерального питания.
2.2. Отбор образцов - по п. 1.2.
2.3. Виды грибов - по п. 1.3.
2.4. Аппаратура, материалы и
реактивы - по ГОСТ 9.048.
2.5. Подготовка к испытаниям - по пп. 1.5.1-1.5.3, 1.5.5.
2.5.1. Для размещения образцов
смазок среду 2 наливают в чашку Петри в количестве 20-30 см3 и дают
ей застыть.
2.6. Проведение испытаний.
2.6.1. Суспензию спор грибов в
среде 5 готовят по ГОСТ 9.048.
2.6.2. Смазки наносят скальпелем в количестве пяти
образцов размером 10×10 мм толщиной 1,5-2,0 мм на поверхность среды в
чашку Петри, подготовленную, как указано в п. 2.5.1.
2.6.3. Дальнейший порядок проведения испытаний
соответствует требованиям пп. 1.6.2-1.6.4.
2.6.4. Образцы выдерживают в течение 28 сут.
2.6.5. Дальнейший порядок проведения испытаний - по
пп. 1.6.6-1.6.8 с
промежуточным осмотром образцов через 14 сут.
2.7. Обработка результатов - по пп. 1.7.1, 1.7.2.
3. МЕТОД 3
3.1. Сущность метода заключается в выдерживании
образцов, зараженных суспензией спор грибов в водном растворе минеральных
солей, в условиях, оптимальных для развития грибов, на среде с дополнительным
источником минерального питания.
3.2. Отбор образцов - по п. 1.2.
3.3. Виды грибов - по п. 1.3.
3.4. Аппаратура, материалы и
реактивы - по ГОСТ 9.048.
3.5. Подготовка к испытаниям - по пп. 1.5.1 -1.5.3 и
1.5.5.
3.5.1. Для размещения образцов
масел готовят пробирки с 2-3 см3 суспензии спор грибов в среде 5.
3.5.2. Контролем служит суспензия спор грибов в среде
5.
3.6. Проведение испытаний.
3.6.1. Суспензию спор грибов в
среде 5 готовят по ГОСТ 9.048.
3.6.2. Образцы масел в количестве 2 см3
вносят не менее чем в пять пробирок, приготовленных, как указано в п. 3.5.1.
3.6.3. Пробирки помещают в наклонном положении под
углом 30° и выдерживают в термостате при температуре (29 ± 2) °С.
3.6.4. Пробирки с образцами выдерживают в термостате
10 сут.
3.6.5. Через 5 и 7 сут
осматривают образцы. Допускается отбирать пробы минеральной среды из пробирок
для оценки грибостойкости биолюминесцентным методом, при этом пробирки с
образцами выдерживают в термостате 3 и 5 сут.
При появлении признаков развития грибов в образцах
испытания прекращают.
3.6.6. По окончании испытаний пробирки с образцами
извлекают из термостата и осматривают невооруженным глазом или с помощью лупы
при 2,5-5,0-кратном увеличении.
3.7. Обработка результатов.
3.7.1. Масла считаются грибостойкими, если отсутствует
развитие грибов на всех испытанных образцах (отсутствует пленка на границе
раздела среда - масло, в пробирках среда прозрачна и не пигментирована, нет
осадка).
3.7.2. Масла считаются не стойкими к плесневым грибам,
если на образцах наблюдается развитие грибов, признаком которого служит
образование пленки на границе раздела среда - масло, помутнение и пигментация
среды, образование осадка.
3.7.3. Допускается оценивать грибостойкость масел
биолюминесцентным методом, приведенным в приложении.
4. МЕТОД 4
4.1. Сущность метода заключается в выдерживании
образцов, зараженных суспензией спор грибов в водном растворе минеральных
солей, в условиях, оптимальных для развития грибов, на среде с дополнительным источником
минерального и органического питания.
4.2. Отбор образцов - по п. 1.2.
4.3. Виды грибов - по п. 1.3.
4.4. Аппаратура, материалы и
реактивы - по ГОСТ 9.048.
4.5. Подготовка к испытаниям - по пп. 1.5.1 -1.5.3, 1.5.5.
4.5.1. Для размещения образцов смазок готовят чашки
Петри, как указано в п. 2.5.1, используя среду 1 или 4.
4.5.2. Для размещения образцов масел готовят лунки,
как указано в п. 1.5.4, используя среду 1 или 4.
4.6. Проведение испытаний - по п. 2.6.
4.6.1. Образцы выдерживают в термостате в условиях,
приведенных в п. 1.6.4, 14 сут.
4.6.2. Промежуточный осмотр образцов производят через
7 сут после начала испытаний.
4.7. Обработка результатов - по пп. 1.7.1.
и 1.7.2.
5. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ - по ГОСТ
9.048.
ПРИЛОЖЕНИЕ
Обязательное
БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД ОЦЕНКИ ГРИБОСТОЙКОСТИ
Сущность метода заключается в определении количества
внутриклеточной аденозин-5-трифосфорной кислоты динатриевой соли (АТФ) в
минеральной среде после испытания масел на грибостойкость (п. 3.6.5)
с помощью специфической ферментативной хемилюминесцентной реакции с
использованием люциферин-люци-феразной системы светляков. Интенсивность
излучаемого свечения прямо пропорциональна концентрации АТФ. Концентрация АТФ
пропорциональна количеству живых клеток, так как ее содержание во всех типах
живых клеток примерно одинаково и составляет 1 -10 мг/г сухого веса. Этот факт
является основой биолюминесцентного метода определения биомассы.
1. Аппаратура, материалы и реактивы
Хемилюминометр медицинский ДЛИ 31.560.000,
предназначенный для измерения интенсивности сверхслабого свечения в области
спектра 400-600 нм. Допускается использовать другие приборы аналогичного
назначения, обеспечивающие измерение световых потоков от 104 до 108
квант/с.
Весы для статического взвешивания по ГОСТ 29329.
Термостат, обеспечивающий температуру нагрева до 200 °С.
Холодильник бытовой электрический по ГОСТ
16317.
Дозатор для отбора проб 0,1 см3.
Лабораторный рН-метр.
Пробирки стеклянные по ГОСТ
25336.
Колбы цилиндрические мензурные вместимостью 25 см3
по ГОСТ
1770.
Пипетки вместимостью 1, 10 см3.
Аденозин-5-трифосфорной кислоты динатриевая соль,
3-водная (АТФ).
Люцифераза светляков.
Люциферин.
Диметилсульфоксид (ДМСО), х.ч.
Трис- (оксиметил) - аминометан, х.ч.
Кислота уксусная, х.ч. по ГОСТ 61.
Магний сернокислый, 7-водный, х.ч. по ГОСТ 4523.
Соль динатриевая этилендиамин - N,
N, N´, N΄ - тетрауксусной кислоты, 2-водная (трилон Б) (ЭДТА) по ГОСТ
10652.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
2. Подготовка к испытаниям
2.1. Стерилизуют посуду по ГОСТ
9.048.
2.2. Готовят раствор АТФ 1
ммоль/дм3: 13,8 мг АТФ помещают в мерную колбу вместимостью 25 см,
доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают до полного растворения.
Раствор АТФ 1 ммоль/дм3 разливают на порции объемом 1 см3
и хранят при температуре минус 20 °С. В замороженном виде раствор АТФ допускается хранить не более
3 месяцев.
2.3. Готовят стандартный раствор
АТФ 10 мкмоль/дм3: порцию раствора АТФ 1 ммоль/дм3 (по п.
2.2) размораживают, отбирают с помощью дозатора 0,1 см3
раствора и помещают его в пробирку, содержащую 10 см3
дистиллированной воды. Раствор АТФ 10 мкмоль/дм3 готовят
непосредственно перед применением.
2.4. Готовят 20 %-ный раствор уксусной кислоты: 10 см3
уксусной кислоты разбавляют 40 см3 дистиллированной воды.
2.5. Готовят 0,1 моль/дм3
трис-ацетатный буферный раствор с рН-7, 6, содержащий 10 ммоль/дм3
сернокислого магния, 2 ммоль/дм3 ЭДТА: в мерную колбу вместимостью
50 см3 загружают 0,605 г трис-(оксиметил)-аминометана, 0,123 г
сернокислого магния, 0,036 г ЭДТА, доводят до метки дистиллированной водой и
перемешивают до полного растворения. Затем все содержимое колбы переносят в
стакан вместимостью 100 см3 и титруют 20 %-ным раствором уксусной
кислоты до рН-7,8.
2.6. Готовят раствор люциферазы: 10 мг люциферазы
растворяют в 10 см3 0,1 моль/дм3 трис-ацетатном буферном
растворе (п. 2.5).
Приготовленный раствор люциферазы хранят во льду.
2.7. Готовят раствор люциферина: 3 мг люциферина
растворяют в 10 см3 0,1 моль/дм3 трис-ацетатного
буферного раствора (п. 2.5).
2.8. Готовят экстракт клеток:
отбирают из пробирок с образцами после выдержки их в термостате 3 и 5 сут (п. 3.6.5) пробу минеральной среды объемом 0,1 см3 и
добавляют ее в пробирку к 0,9 см3 диметилсульфоксида (ДМСО). Смесь
перемешивают встряхиванием в течение 1-2 мин. Экстракт пригоден для анализа в
течение 1 сут.
3. Проведение испытаний
3.1. Помещают в кювету люминометра с помощью дозатора
последовательно 0,1 см3 раствора люциферина, 0,1 см3
раствора люциферазы, 0,7 см3 трис-ацетатного буферного раствора и
регистрируют интенсивность фонового свечения Iфон в милливольтах.
3.2. Добавляют в ту же кювету дозатором 0,1 см3
экстракта клеток (п. 2.8), перемешивают и регистрируют сигнал
интенсивности люминесценции I1.
3.3. Добавляют в ту же кювету 0,02 см3
стандартного раствора АТФ (п. 2.3) и регистрируют сигнал интенсивности
люминесценции I2.
4. Обработка результатов
4.1. Интенсивность люминесценции образца (Iобр) в милливольтах
вычисляют по формуле
(1)
4.2. Интенсивность люминесценции стандартного раствора
АТФ (Iст) милливольтах
вычисляют по формуле
(2)
4.3. Концентрации АТФ [АТФ]обр в микромолях
в образце вычисляют по формуле
(3)
где V - объем экстракта клеток, равный 0,1 см3;
V1 - объем реакционной смеси до добавления стандартного
раствора АТФ, равный 1 см3;
V2 - объем реакционной смеси после добавления
стандартного раствора АТФ, равный 1,02 см3;
Vст - объем добавленного
стандартного раствора АТФ, равный 0,02 см3;
[АТФ]ст - концентрация АТФ в стандартном
растворе, равная 10 мкмоль;
10 - коэффициент, учитывающий разбавление пробы
образца при экстракции клеток диметилсульфоксидом в 10 раз.
При упрощении формула (3) приобретает вид:
4.4. Масла являются грибостойкими, если концентрация
АТФ меньше или равна 10-7 моль, масла не грибостойки, если
концентрация АТФ в образцах больше 10-7 моль.
ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ
1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Министерством высшего и
среднего специального образования СССР
2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением
Государственного комитета СССР по стандартам от 25.03.88 № 754
3. ВЗАМЕН ГОСТ 9.052-75
4. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
Обозначение НТД,
на который дана ссылка
|
Номер пункта,
подпункта, приложения
|
ГОСТ
9.048-89
|
1.3.3,
1.4,
1.5.1,
1.5.2,
1.5.3,
1.6.1,
2.4,
2.6.1,
3.4,
3.6.1,
4.4,
приложение
|
ГОСТ 61-75
|
Приложение
|
ГОСТ
1770-74
|
»
|
ГОСТ 2517-85
|
1.2.1
|
ГОСТ 4523-77
|
Приложение
|
ГОСТ 6709-72
|
»
|
ГОСТ
10652-73
|
»
|
ГОСТ
16317-87
|
»
|
ГОСТ
25336-82
|
»
|
ГОСТ
29169-91
|
»
|
ГОСТ
29329-92
|
»
|
6. Ограничение срока действия снято по решению
Межгосударственного Совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС
5-6-93)
7. ПЕРЕИЗДАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ
1. Метод 1. 1
2. Метод 2. 3
3. Метод 3. 3
4. Метод 4. 4
5. Требования безопасности. 4
Приложение Биолюминесцентный метод
оценки грибостойкости. 5
1. Аппаратура, материалы и
реактивы.. 5
2. Подготовка к испытаниям.. 5
3. Проведение испытаний. 6
4.
Обработка результатов. 6
|