Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1
 

26 страниц

Купить ГОСТ 33680-2015 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Цена на этот документ пока неизвестна. Нажмите кнопку "Купить" и сделайте заказ, и мы пришлем вам цену.

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Распространяется на продовольственное сырье, пищевые продукты, пищевые и вкусовые добавки и устанавливает методы определения бенз(а)пирена с применением спектрофлуориметрии при низкой и комнатной температуре и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

  Скачать PDF

Оглавление

1 Область применения

2 Нормативные ссылки

3 Отбор проб

4 Метод низкотемпературной спектрофлуориметрии

5 Методы высокоэффективной жидкостной хроматографии и спектрофлуориметрии при комнатной температуре

6 Требования безопасности

7 Требования к квалификации оператора

Показать даты введения Admin

Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9
Стр. 10
стр. 10
Стр. 11
стр. 11
Стр. 12
стр. 12
Стр. 13
стр. 13
Стр. 14
стр. 14
Стр. 15
стр. 15
Стр. 16
стр. 16
Стр. 17
стр. 17
Стр. 18
стр. 18
Стр. 19
стр. 19
Стр. 20
стр. 20
Стр. 21
стр. 21
Стр. 22
стр. 22
Стр. 23
стр. 23
Стр. 24
стр. 24
Стр. 25
стр. 25
Стр. 26
стр. 26

ЕВРАЗИЙСКИЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(ЕАСС)

EURO-ASIAN COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

(EASC)



МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ


ГОСТ

33680—

2015


ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ


Определение бенз(а)пирена в зерне, копченых мясных и рыбных продуктах методом ТСХ и ВЭЖХ


Издание официальное



Зарегистр|/Ыван|||||[ № 11779 Щ мге

ш.

24 ноября 201


Минск

Евразийский совет по стандартизации, метрологии и сертификации


Предисловие

Евразийский совет по стандартизации, метрологии и сертификации (ЕАСС) представляет собой региональное объединение национальных органов по стандартизации государств, входящих в Содружество Независимых Государств. В дальнейшем возможно вступление в ЕАСС национальных органов по стандартизации других государств.

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены».

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН Республиканским государственным предприятием «Казахстанский институт стандартизации и сертификации» и Межгосударственным техническим комитетом МТК 534 «Обеспечение безопасности сельскохозяйственной продукции и продовольственного сырья на основе принципов НАССР»

2    ВНЕСЕН Комитетом технического регулирования и метрологии Министерства по инвестициям и развитию Республики Казахстан

3 ПРИНЯТ Евразийским советом по стандартизации, метрологии и сертификации по результатам голосования в АИС МГС (протоколом от 12 ноября 2015 г. №82-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004—97

Код страны по МК (ИСО 3166) 004—97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Армения

AM

Минэкономики Республики Армения

Беларусь

BY

Госстандарт Республики Беларусь

Казахстан

KZ

Госстандарт Республики Казахстан

Кыргызстан

KG

Кыргызстандарт

Таджикистан

TJ

Таджикстандарт

Украина

UA

Минэкономразвития Украины

Настоящий стандарт разработан на базе национального стандарта Республики Казахстан СТ РК 1502-2006 «Продукты пищевые. Определение бенз(а)пирена в зерне, копченых мясных и рыбных продуктах методом ТСХ».

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных (государственных) стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.

В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация также будет опубликована в сети Интернет на сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге «Межгосударственные стандарты».

Исключительное право официального опубликования настоящего стандарта на территории указанных выше государств принадлежит национальным (государственным) органам по стандартизации этих государств.

отношения (К) интенсивности линии бенз(а)пирена (Hi) к интенсивности линии 1,12-бензперилена (Н2), К =HilH2.

Далее определяют этот коэффициент для стандартных растворов бенз(а)пирена (Кст)- Для этого в две пробирки наливают по 3 см3 стандартных растворов бенз(а)пирена с массовой концентрацией 0,02 и 0,04 мкг/см3. В каждую из пробирок наливают такое же количество 1,12-бензперилена, что и в пробирку с пробой. Проводят дважды запись спектров каждого раствора в интервале длин волн от 401 до 409 нм.

При этом обязательно следят за тем, чтобы положение пера самописца при длине волны 401 нм во всех случаях фиксировалось на одном уровне.

Далее по спектрограммам определяют интенсивность характеристических линий бенз(а)пирена при 403 нм и 1,12-бензперилена при 406,3 нм (Hi и Hi соответственно). В расчетах принимают среднее значение. Рассчитывают Кст = HilH2 для каждой концентрации бенз(а)пирена.

Массовую концентрацию бенз(а)пирена в анализируемом растворе (с), мкг/см3, вычисляют по формуле

С= Ccm К/Кст,    (1    )

где сСт - концентрация бенз(а)пирена в стандартном растворе, мкг/см3;

К - коэффициент, найденный по спектрограмме анализируемого раствора с добавкой 1,12-бензперилена;

Кст - коэффициент, найденный по спектрограммам стандартного раствора

бенз(а)пирена с добавкой 1,12-бензперилена, значение которого ближе по значению к коэффициенту анализируемого раствора с соответствующей добавкой 1,12-бензперилена.

Примечание - Проводят два параллельных определения и одновременно контрольный опыт, который проводят через все стадии анализа с использованием всех реактивов согласно методике, но без навески продукта.

4.4 Обработка результатов

(с-с о)-У-пч т2

Массовую долю бенз(а)пиренаХ?, %, иХ2, мг/кг, вычисляют по формулам X _ (c-co)-m1-V-100 _ (с-с0)-тгУ ^ ^_1    т2-т-1000-1000    т2

(3)

х2

где с - концентрация бенз(а)пирена, установленная по 4.3.2 или 4.3.3 в растворе (экстракте) анализируемого продукта, полученного по 4.3.1, мкг/см3;

Со - концентрация бенз(а)пирена в растворе контрольного опыта, установленная

4.3.2 или 4.3.3, мкг/см3;

V- объем раствора бенз(а)пирена, выделенного из анализируемой пробы продукта, см3,

mi - масса экстракта, выделенного из анализируемого продукта, г; т2 - масса экстракта, нанесенного на широкую полосу пластины, г; т - масса навески продукта, г.

Результаты округляют до второго десятичного знака.

За окончательный результат определения принимают среднее арифметическое двух параллельных определений X с тем же округлением.

Если расхождение между результатами параллельных определений не превышает


|Х*-Хг| <0,01оХ,

где Xi, Х2 и X- результаты первого и второго параллельных определений и их среднее арифметическое, d- норматив контроля сходимости, то среднее арифметическое X принимают за результат анализа.

В противном случае анализ повторяют. Значение норматива контроля сходимости d приведено в таблице 1.

По полученному результату анализа X и значению относительной погрешности 5, приведенной в таблице 1, рассчитывают абсолютную погрешность Д = 0,016Х, мг/кг или %.

Результат анализа представляют в виде (X ± Д), мг/кг или % при Р = 0,95.

4.5 Контроль точности результатов анализа

Внутренний оперативный контроль (далее - ВОК) качества результатов анализа включает контроль сходимости, воспроизводимости и точности результатов анализа.

4.5.1    Сходимость параллельных определений контролируют для каждой анализируемой пробы согласно 4.4.

4.5.2    Для проведения внутреннего контроля воспроизводимости пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой в разных лабораториях или в одной лаборатории, максимально варьируя условия проведения анализа, то есть используют разные наборы мерной посуды, анализы выполняют в разные дни или два различных аналитика.

Воспроизводимость контрольных анализов признают удовлетворительной, если

|X?-X2|<0,01DX,

где Xi, Х2 и X- результаты анализа одной и той же пробы, полученные в разных

лабораториях или при варьирующих условиях в одной лаборатории и их среднее арифметическое значение,

D - значение норматива внутреннего оперативного контроля воспроизводимости.

Значение норматива D приведено в таблице 1.

Периодичность проведения контроля воспроизводимости - не реже одного раза в две недели.

Таблица1- Диапазон измерений, значение характеристики относительной погрешности и нормативы оперативного контроля случайной составляющей относительной погрешности (сходимости и воспроизводимости) при доверительной вероятности Р = 0,95___

Диапазон измерений, мг/кг

Характеристика погрешности (граница интервала, в котором погрешность находится с заданной вероятностью) ±5, %

Норматив оперативного контроля сходимости d0TH, % (для двух результатов параллельных определений, п = 2)

Норматив оперативного контроля воспроизводимости D0TH, % (ДЛЯ ДВуХ результатов измерений, m = 2)

От 0,0002 до 0,001 включ.

42

40

60

Св. 0,001 до 0,005 включ.

32

30

45

4.5.3 Для проведения контроля точности пробу делят на две равные части, одну из которых анализируют в соответствии с методикой; во вторую - вводят известную добавку бенз(а)пирена и затем также анализируют в соответствии с методикой. Величина добавки должна составлять от 50 % до 150 % содержания бенз(а)пирена в анализируемой пробе.

Точность контрольных анализов признают удовлетворительной, если

\Xi-X- с\ < 0,01 К,

где Xi, X и с - результаты контрольных анализов пробы с добавкой бенз(а)пирена,

реальной пробы и величина добавки бенз(а)пирена, соответственно; К - норматив оперативного контроля точности.

Норматив оперативного контроля точности рассчитывают по формулам (4) и (5): при проведении внутрилабораторного контроля (Р= 0,90)

К = 0,84 J (AXt)2 + (Дх)2,    (4)

при проведении внешнего контроля (Р = 0,95):

К = J(AXJ2 + (Дх)2 ,    (5)

где ДХ1и Дх - значения характеристики погрешности, соответствующие массовой концентрации бенз(а)перена в пробе с добавкой и в реальной пробе соответственно;

ДХ1= 0,018XlXi и Д-= 0,015хХ, где Xi и X- массовая доля бенз(а)пирена в пробе с добавкой и в реальной пробе соответственно, в процентах или мг/кг.

Значение относительной погрешности 5x(8Xl) приведены в таблице 1.

Контроль точности анализа проводят не реже одного раза в месяц, а также при смене реактивов или после длительного перерыва в работе.

При превышении нормативов оперативного контроля точности проводят повторные анализы.

При повторном превышении указанных нормативов анализы приостанавливают, выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их. Результаты ВОК заносят в специальный журнал.

5 Методы высокоэффективной жидкостной хроматографии и спектрофлуориметрии при комнатной температуре

Сущность метода заключается в экстракции углеводородов, в том числе бенз(а)пирена, гексаном из продукта, предварительно обработанного спиртовым раствором едкого калия, выделении фракции полициклических ароматических углеводородов, содержащей бенз(а)пирен, очистке полученной фракции от мешающих примесей на колонке с сефадексом или на пластинке в тонком слое ацетилированной целлюлозы с последующим количественным определением выделенного бена(а)пирена высокоэффективной жидкостной хроматографией или спектрофлуориметрией при комнатной температуре.

Диапазон определяемых величин массовой доли бенз(а)пирена в анализируемых

ГОСТ 33680-2015

продуктах при использовании метода высокоэффективной жидкостной хроматографии и метода спектрофлуориметрии при комнатной температуре от 0,0001 до 0,002 мг/кг или от 0,Т10"' до 2,0-10"' %. Оптимальный диапазон определяемых массовых концентраций бенз(а)пирена в растворе при использовании метода высокоэффективной жидкостной хроматографии составляет от 0,01 до 0,02 мкг/см3, при использовании метода спектрофлуориметрии от 0,02 до 0,2 мкг/см3.

5.1 Аппаратура, материалы и реактивы

Флуоресцентный спектрометр со спектральным диапазоном длин волн от 300 до 460 нм с кюветами вместимостью 0,4 см3.

Хроматограф жидкостный с флуориметрическим детектором со спектральным диапазоном длин волн от 300 до 420 нм.

Колонка хроматографическая стальная или стеклянная длиной 150 мм и диаметром 6 мм, заполненная сорбентом с привитой обращенной фазой (например, Supersosil LC-PAH).

Весы лабораторные второго класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Весы лабораторные общего назначения второго класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г по ГОСТ 24104.

Испаритель ротационный с температурой нагрева до 180 °С.

Насос водоструйный лабораторный по ГОСТ 25336.

Баня водяная.

Мешалка магнитная типа ММ-3 М с электроподогревом.

Осветитель ультрафиолетовый типа «Хроматоскоп» со спектральным диапазоном от 250 до 700 нм и лампой типа БУВ-15 в качестве источника УФ-излучения.

Пластинки стеклянные для тонкослойной хроматографии 5x20 см и 20x20 см.

Колонка стеклянная хроматографическая длиной 500 мм и диаметром 20 мм с оттянутым внизу концом и резервуаром вместимостью от 50 до 60 см3 ПШ 14/23.

Холодильник ХПТ-2-400-29/32 ХС или ХШ-1-400-29/32 ХС по ГОСТ 25336.

Аллонж типа АИО-14/23-50 ТС или АИО-14/23-14/23-65 ТС по ГОСТ 25336.

Линейка измерительная с ценой деления 0,1 см по ГОСТ 427.

Дефлегматор 250-19/26-29/32 ТС или 300-19/26-29/32 по ГОСТ 25336,

Насадка П-1-19/26-14/23-14/23 ТС или Н-2-19/26-14/23 ТС по ГОСТ 25336.

Воронка делительная ВД-1 -500 или ВД-3-500 по ГОСТ 25336.

Воронка ВФО-32-ПОР 100-14/23 ХС или ВФО-32-ПОР 160-14/23 ХС по ГОСТ 25336.

Цилиндры мерные 1-100,1-250 или 3-100, 3-250 по ГОСТ 25336.

Стакан химический В-1-100 или В-1-150 по ГОСТ 25336.

Колба 1-500 по ГОСТ 25336.

Колба Гр 50-14/23 по ГОСТ 25336.

Колбы К-1-100-29/32 ТХС, К-1-25Р-29/32 ТХС, К-1-500-29/32 ТХС или П-1-500-29/32 ТХС по ГОСТ 25336.

Колбы Кн-1000-29/32 ТХС по ГОСТ 25336, Кн-250-34 ТХС по ГОСТ 25336.

Колбы мерные 2-100-2 по ГОСТ 25336.

Воронка Бюхнера 1, 2, или 3 по ГОСТ 9147.

Стаканчики для взвешивания (бюксы) СВ-14/8 или СВ-19/9, или СВ-24/10, или СВ-34/12 по ГОСТ 25336.

Микрошприцы типов MLU-10, стеклянные капилляры.

Пипетки 1-1-1,1-1-2, 2-1-5, 8-2-0,2 по ГОСТ 29228 или ГОСТ 29229.

11

ГОСТ 33680-2015

Бумага индикаторная универсальная.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

Скальпель или тонкий шпатель по действующим нормативным документам, н-гексан, ч., по действующим нормативным документам.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962 или спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300.

Спирт этиловый, водный раствор объемная доля спирта 92 % .

Бензол по ГОСТ 5955.

Толуол по ГОСТ 5789.

Кислота серная по ГОСТ 4204.

Ацетон по ГОСТ 2603, ч. или ос. ч.

Ангидрид уксусный по ГОСТ 5815, ч.

Диметилформамид по ГОСТ 20289, ч. д. а.

Ацетонитрил по действующим нормативным документам.

Калия гидроксид по ГОСТ 24363.

Целлюлоза микрокристаллическая порошковая по действующим нормативным документам.

Бенз(а)пирен, содержание основного вещества не менее 98 %.

Бенз(в)хризен, содержание основного вещества не менее 98 %.

Сефадекс LH-20.

Силикагель АСКГ по ГОСТ 3956.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечание - Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками, а также реактивов и материалов по качеству не ниже вышеуказанных.

5.2 Подготовка к испытанию

5.2.1    Подготовка растворителей

Растворители (н-гексан, этиловый спирт, ацетон, бензол) перегоняют общепринятым способом с дефлегматором.

Диметилформамид перегоняют, добавив в перегонную колбу 120 см3 бензола и 36 см3 воды на 1 дм3 растворителя.

5.2.2    Приготовление ацетилированной целлюлозы

(50,0±2,0) г микрокристаллической целлюлозы помещают в плоскодонную колбу вместимостью 500 см3, добавляют приготовленную в отдельной колбе смесь 150 смбензола или толуола, 70 см3 уксусного ангидрида и 0,3 см3 серной кислоты. Реакционную смесь перемешивают магнитной мешалкой в течение от 6 до 8 часов, оставляют без перемешивания еще на 18 часов, после чего декантируют жидкую фазу, а остаток заливают 300 см3 этилового спирта, перемешивают, оставляют в спирте на 24 часа, затем целлюлозу отфильтровывают на воронке Бюхнера, промывают 100 смэтилового спирта и дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод (по индикаторной бумаге).

Затем проверяют хроматографическую активность ацетилированной целлюлозы. Для этого за время от 3 до 4 часов до проведения анализа готовят смесь этилового спирта, ацетона и воды, взятых в объемном отношении 60:25:15, и выливают ее в выстланную полосками фильтровальной бумаги хроматографическую камеру. Высота слоя растворителя должна составлять от 1,5 до 2 см. 1,5 г ацетилированной целлюлозы суспендируют в 7 см этилового спирта и выливают суспензию ровным слоем на стеклянную пластину 5x20 см, дают растворителю полностью испариться на воздухе и

12

ГОСТ 33680-2015

наносят на пластинку микрошприцем или стеклянным капилляром в точку 5 мкп раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 1 мкг/см3. Пластину помещают в хроматографическую камеру и оставляют в камере до тех пор, пока уровень растворителя поднимется не менее, чем на 100 мм от линии старта. По окончании хроматографирования пластину вынимают, высушивают на воздухе и под лампой ультрафиолетового облучателя отмечают флуоресцирующее голубым цветом пятно бенз(а)пирена. Измеряют расстояние от стартовой линии до фронта растворителя и до середины пятна бенз(а)пирена, рассчитывают значение Rf оценивающее скорость перемещения бенз(а)пирена по пластинке, по формуле

)    _    LBn

где Lsn- расстояние от стартовой линии до середины пятна бенз(а)пирена, мм; L - расстояние от стартовой линии до фронта растворителя, мм.

Значение Rf бенз(а)пирена должно составлять 0,1.

5.2.3 Приготовление рабочих пластин

5.2.3.1 Первый способ

Для приготовления рабочей пластины 5 г ацетилированной целлюлозы суспендируют в 20 см3 этилового спирта и выливают ровным слоем на пластину 20x20 см.

5.2.3.2 Второй способ

Для приготовления рабочей пластины 16 г ацетилированной целлюлозы, 8 г оксида алюминия и 20 см3 метанола интенсивно перемешивают в течение одной минуты и наносят кашеобразный раствор на пластинку 20x20 см слоем 0,25 мм.

Пластинки высушивают сначала на воздухе, а затем 2 часа в сушильном шкафу при температуре 60 °С и хранят в эксикаторе.

5.2.4    Приготовление стандартных растворов бенз(а)пирена и бенз(в)хризена

В стаканчики для взвешивания (бюксы) отвешивают по (10,0 ± 0,2) мг бенз(а)пирена и бенз(в)хризена. Навески количественно переносят в мерные колбы вместимостью 100 см3: бенз(а)пирен - бензолом, бенз(в)хризен - ацетонитрилом, затем объем раствора бенз(а)пирена доводят до метки бензолом, объем раствора бенз(в)хризена -ацетонитрилом. Полученные растворы имеют массовую концентрацию 100 мкг/см3. Растворы хранят в холодном темном месте не более трех месяцев.

5.2.5    Приготовление рабочих растворов бенз(а)пирена и бенз(в)хризена Рабочие растворы готовят разведением стандартных растворов, используя пипетки

вместимостью 1,5 и 10 см3 и мерные колбы вместимостью 100 см3, объем раствора доводят до метки соответствующим растворителем, перемешивают и хранят в холодном темном месте не более одного месяца.

Приготовление раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 1,0 мкг/см3 (для определения методом спектрофлуориметрии): из стандартного раствора отбирают

1.0    см3 и переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3; объем раствора доводят до метки бензолом.

Приготовление раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 0,25; 1,0 и

5.0    мкг/см3 (для определения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии): из стандартного раствора отбирают 0,25; 1,0; 5,0 см3, соответственно, и переносят в мерные колбы вместимостью 100 см3; объем растворов доводят до метки ацетонитрилом.

Приготовление растворов бенз(в)хризена массовой концентрации 0,5 и

13

10 мкг/см3: из стандартного раствора отбирают 0,5 и 10 см3, соответственно, и переносят в мерные колбы вместимостью 100 см3; объем каждого раствора доводят до метки ацетонитрилом.

5.2.6 Приготовление градуировочных растворов

Для приготовления градуировочных растворов смеси бенз(а)пирена и бенз(в)хризена в мерные колбы вместимостью 250 см3 пипеткой вместимостью 1 смпереносят приведенные в таблице 2 объемы стандартного раствора бенз(а)пирена массовой концентрацией 100 мкг/см3 и рабочего раствора бенз(в)хризена массовой концентрацией 10 мкг/см3, доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученные растворы перемешивают и хранят в темном холодном месте не более одного месяца.

Таблица2

Номер

раствора

Объем исходного раствора, см3

Массовая концентрация в градуировочном растворе, мкг/см3

Бенз(а)пирена мас

Бенз(в)хризена

совой концентрации 100 мкг/см3

массовой концентрации 10 мкг/см3

Бенз(а)пирена

Бенз(в)хризена

1

1,00

1,00

0,40

0,04

2

0,50

0,50

0,20

0,02

3

0,25

0,25

0,30

0,01

4

0,10

0,10

0,04

0,004

5.3 Проведение испытания

5.3.1 Выделение бенз(а)пирена из продукта

В круглодонную или плоскодонную колбу вместимостью 100 см3 помешают навеску продукта массой 10 г, добавляют раствор, состоящий из 4 г гидроксида калия в 50 см3 водного раствора этилового спирта (объемная доля спирта 92 %). Содержимое колбы перемешивают встряхиванием. Колбу соединяют с обратным холодильником и нагревают на водяной бане или на магнитной мешалке при кипении реакционной смеси в течение 3 часов. Затем в колбу через холодильник добавляют 100 смдистиллированной воды. Реакционную массу охлаждают до комнатной температуры. После охлаждения реакционную массу переносят в делительную воронку вместимостью 500 см3. В случае, если после гидролиза в реакционной массе остался твердый остаток, его отделяют на воронке Бюхнера, промывая остаток на фильтре 30 см3 горячего этилового спирта. Жидкую фазу реакционной массы используют для экстракции. В делительную воронку добавляют 30 см3 н-гексана. Содержимое воронки встряхивают и оставляют для расслаивания жидкостей. В случае образования эмульсии к смеси в делительной воронке добавляют 20 см3 этилового спирта. После расслаивания нижнюю водно-спиртовую фазу сливают в колбу, а гексановый экстракт переливают в другую делительную воронку. Такую обработку реакционной массы проводят еще два раза, используя для экстракции н-гексан по 30 см3 и этиловый спирт для расслаивания эмульсии порциями по 20 см3.

По окончании экстракции объединенный гексановый экстракт промывают в делительной воронке дистиллированной водой три раза по 30 см3, переносят экстракт в круглодонную колбу вместимостью 100 см3, фильтруя через слой безводного сульфата натрия на воронке с пористым фильтром. Раствор упаривают на ротационном испарителе до объема 50 см3 при температуре водяной бани не выше 60 °С.

Упаренный экстракт переносят в делительную воронку вместимостью 500 см3 и добавляют к нему 50 см3 смеси диметилформамида и воды в объемном соотношении 9:1. Интенсивно встряхивают смесь в течение 1 минуты, после расслаивания фаз

ГОСТ 33680-2015

нижнюю сливают в плоскодонную колбу вместимостью 200 см3, а из верхнего гексанового слоя снова проводят экстракцию 50 см3 смеси диметилформамида и воды. Гексановый слой отбрасывают, объединенный в плоскодонной колбе диметилформамидный экстракт переносят в делительную воронку, добавляют 100 смдистиллированной воды и проводят экстракцию из водной фазы гексаном трижды по 50 см3. Водную фазу отбрасывают, а гексановый экстракт промывают водой трижды по 30 см3, переносят в плоскодонную колбу, добавляют 10 г безводного сульфата натрия и выдерживают в течение одного часа, н-гексан упаривают на ротационном испарителе до объема от 1,5 до 2,0 см3, оставшийся растворитель удаляют потоком воздуха через вакуумный аллонж, соединенный с водоструйным насосом, остаток в колбе растворяют в 0,5 см3 этилового спирта.

В стакан вместимостью 100 см3 отвешивают (2,5±0,2) г сефадекса LH-20, добавляют 20 см3 этилового спирта и оставляют для набухания на время от 3 до 4 часов. Затем гель переносят, смывая небольшим количеством спирта, в стеклянную хроматографическую колонку, дают растворителю стечь таким образом, чтобы слой спирта над слоем сорбента оставался не ниже 2 мм. В подготовленную колонку вносят пипеткой остаток экстракта из колбы, трижды смывая его из колбы этиловым спиртом порциями по 0,5 см3. Элюирование из колонки полициклических ароматических углеводородов, в том числе бенз(а)пирена, проводят 40 см3 этилового спирта, первую фракцию вместимостью 12 см3 отбрасывают, собирают вторую фракцию вместимостью 25 см3. Скорость элюирования растворителя 0,5 см3/мин обеспечивают, создавая небольшое избыточное давление потоком воздуха или азота через насадку, соединенную с воздуходувкой или газовым баллоном. Газ следует подавать через стеклянную трубку, заполненную силикагелем.

Колонку с сефадексом LH-20 можно использовать многократно. Для этого, не допуская высыхания сорбента после фракционирования, колонку промывают 25 смэтилового спирта и наносят следующую пробу.

Раствор второй фракции переносят в грушевидную колбу вместимостью 50 см3, растворитель упаривают до объема от 0,5 до 1,0 см3, его остаток удаляют в потоке воздуха или азота.

Полученную фракцию, содержащую бенз(а)пирен, далее анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии или спектрофлуориметрическим методом.

Одновременно проводят контрольный опыт, проводя все стадии анализа с использованием реактивов согласно методике, но без навески продукта.

5.3.2 Определение содержания бенз(а)пирена методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

5.3.2.1 Условия хроматографирования

Условия хроматографирования подбираются в зависимости от вида применяемого жидкостного хроматографа и хроматографической колонки.

В качестве примера могут быть приведены следующие условия хроматографического определения бенз(а)пирена.

Жидкостный хроматограф «Altex-334» с флуоресцентным детектором «Krato3 FS-970».

Колонка Supelcosil LC-PAM зернением 5 мк, длиной 150 мм, диаметром 4,6 мм.

Флуориметрический детектор: длина волны возбуждающего света 300 нм, эмиссионный фильтр - 418 нм.

Подвижная фаза: ацетонитрил и вода в объемном соотношении 8:2,

Скорость элюирования - 2,0 см3/мин.

Объем вводимой пробы - 20 мкл.

Чувствительность усилителя подбирают таким образом, чтобы интенсивность сигналов бенз(а)пирена и внутреннего стандарта - бенз(в)хризена не превышала 95 % шкалы.

15

Время анализа - 15 минут; время удерживания бенз(а)пирена - 5 минут, бенз(в)хризена -13 минут.

Анализируемые растворы хроматографируют дважды в одинаковых условиях. Площади пиков измеряют с помощью интегратора или вручную как произведение высоты пика и его ширины на половине высоты.

Определение содержания бенз(а)пирена проводят методом внутреннего стандарта или методом добавок.

5.3.2.2 Определение содержания бенз(а)пирена в растворе (экстракте), полученном по 5.3.1 методом внутреннего стандарта

При использовании такого способа количественной оценки предварительно проводят градуировку хроматографа, используя градуировочные растворы, приготовленные по 5.2.6.

В условиях, указанных в 5.3.2.1, записывают по три хроматограммы для каждого из приготовленных растворов и измеряют площади пиков бенз(а)пирена и бенз(в)хризена. Определяют среднее арифметическое значение площади пиков бенз(а)пирена и бенз(в)хризена, рассчитанное из трех хроматограмм.

Градуировочный коэффициент К вычисляют по формуле

_ Ttii 'S2

m2-S1

где m-j и /т?2 — массы введенных в хроматограф бенз(а)пирена {mi) и бенз(в)хризена {m2), мкг;

Si и S2- площади пиков бенз(а)пирена {Si) и бенз(в)хризена (S2), см.

Г радуировочный коэффициент К рассчитывают для каждого раствора.

Его значения не должны отличаться от среднего арифметического значения градуировочного коэффициента из всех результатов более чем на 10 %.

При длине волны возбуждающего света 300 нм и эмиссионном фильтре 418 нм значение градуировочного коэффициента составляет 9,5.

Перед началом анализа на стадии подготовки проб к щелочному гидролизу в пробу продукта и пробу контрольного опыта вносят по 50 мкл раствора бенз(в)хризена массовой концентрации 0,5 мкг/см3. Обе пробы проводят через все стадии испытания, указанные в 5.3.1. Сухой остаток растворяют в 200 мкл ацетонитрила.

В условиях, указанных в 5.3.3.1, записывают хроматограммы раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 100 мкг/см3 и раствора бена(в)хризена массовой концентрации 100 мкг/см3, отмечают время выхода бенз(а)пирена и бенз(в)хризена. Затем записывают хроматограммы пробы контрольного опыта с добавкой бенз(в)хризена и пробы продукта с такой же добавкой бенз(в)хризена. Измеряют площади пиков бенз(а)пирена и бенз(в)хризена на хроматограммах пробы продукта и пробы контрольного опыта.

Для каждой пробы записывают по две хроматограммы. Из двух хроматограмм рассчитывают среднее арифметическое значение площади пиков бенз(а)пирена и бенз(в)хризена.

На основании полученных данных определяют массу бенз(а)пирена, мкг, в пробе продукта mi и пробе контрольного опыта /г?2 по формулам (8) и (9) соответственно:

(7)

TTIct'Si


(8)


т1



___     rnCT-S2-K'

(9)

т2 — ---:

где mi - масса бенз(а)пирена в пробе продукта, мкг;

/772 - масса бенз(а)пирена в пробе контрольного опыта, мкг;

/7?ст- масса бенз(в)хризена, введенного в пробу продукта и пробу контрольного опыта, мкг;

Si и S2 - площади пиков бенз(а) пирена на хроматограммах пробы продукта (Si) и пробы контрольного опыта (S2), см,

S3 и S4- площади пиков бенз(в)хризена на хроматограммах пробы продукта (S3) и пробы контрольного опыта (S4), см,

К-градуировочный коэффициент, установленный по 5.3.2.2.

5.3.2.3 Определение содержания бенз(а)пирена в растворе (экстракте), полученном по 5.3.1 методом добавок

Для количественной оценки при использовании метода добавок одновременно с пробой продукта анализируют пробу контрольного опыта. Фракции, выделенные из проб продукта и контрольного опыта по 5.3.1, растворяют в 400 мкп ацетонитрила. Полученные растворы делят на две неравные части, отбирая меньшую часть (40 мкп) в пробирку или грушевидную колбу.

Записывают хроматограммы пробы продукта, пробы контрольного опыта и хроматограмму раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 0,25 мкг/см3. Отмечают время выхода бенз(а)пирена.

В оставшиеся части пробы продукта и контрольного опыта (360 мкп) делают добавку от 10 до 20 мкп раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 5 мкг/см3. Полученные растворы вновь вводят в хроматограф.

Все хроматограммы записывают дважды. Измеряют площади пиков бенз(а)пирена. Из двух хроматограмм рассчитывают среднеарифметическое значение площади пика бенз(а)пирена.

На основании полученных данных определяют массу бенз(а)пирена, мкг, в пробе продукта mi и пробе контрольного опыта /7?гпо формулам (10) и (11) соответственно

___ _ monSl

1

(10)

- m*-s3

2 S4-0,9S3'

(11)

где топ v\mk- масса бенз(а)пирена, добавленная к части экстракта из пробы продукта (топ) и пробы контрольного опыта (т^), мкг;

Si и S2- площади пиков бенз(а)пирена на хроматограммах пробы продукта (Si) и пробы продукта с добавкой бенз(а)пирена (S2), см2;

S3 и S4- площади пиков бенз(а)пирена на хроматограммах пробы контрольного

опыта (S3) и пробы контрольного опыта с добавкой бенз(а)пирена (S4), см2; 0,9 - доля пробы, к которой делают добавку бенз(а)пирена.

5.3.3 Определение    содержания бенз(а)пирена    методом тонкослойной

хроматографии

5.3.3.1 Качественное    определение содержания    бенз(а)пирена методом

тонкослойной хроматографии

При определении содержания бенз(а)пирена методом тонкослойной

17

ГОСТ 33680-2015

Содержание

1    Область применения.............................................................................. 1

2    Нормативные ссылки.............................................................................. 1

3    Отбор проб............................................................................................. 2

4    Метод низкотемпературной спектрофлуориметрии................................... 2

5    Методы высокоэффективной жидкостной хроматографии и

спектрофлуориметрии при комнатной температуре.................................... 10

6    Требования безопасности....................................................................... 21

7    Требования к квалификации оператора..................................................... 22

III

хроматографии одновременно с пробой продукта анализируют пробу контрольного опыта, в которую добавлено 50 мкл раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 1 мкг/см3 (концентрацию и объем раствора бенз(а)пирена подбирают таким образом, чтобы полученная концентрация соответствовала ПДК бенз(а)пирена в анализируемом продукте).

Полученные по 5.3.1 фракции, содержащие бенз(а)пирен, из пробы продукта и пробы контрольного опыта с добавкой, растворяют в 0,5 см3 бензола и далее подвергают хроматографированию в тонком слое.

Для этого пластину 20x20 см, подготовленную, как указано в 5.2.2 или пластину для ТСХ, делят на два поля: боковое - шириной от 1,5 до 2 см и основное, проводя по слою сорбента скальпелем или тонким шпателем разделительную полосу. На основное поле сплошной полосой, отступив 2 см от нижнего края пластинки и по 1 см с боковых краев, наносят раствор фракции, выделенной по 5.3.1. Раствор наносят с помощью тонко оттянутого капилляра или микрошприца, диаметр пятен не должен превышать 5 мм. Для количественного переноса вещества его дважды смывают со стенок колбы небольшим количеством бензола (от 0,4 до 0,6 см3). На стартовую линию бокового поля наносят в точку 5 мкл раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 1 мкг/см3. После полного испарения растворителя пластинку помещают в предварительно насыщенную хроматографическую камеру под углом от 70° до 85° и проводят элюирование в смеси этилового спирта, ацетона и воды, взятых в соотношении 60:25:15. Когда фронт растворителя достигнет 2 см от верхнего края пластинки, ее вынимают из камеры, высушивают на воздухе и проявляют хроматографическую зону бенз(а)пирена под лампой ультрафиолетового облучателя при длине волны 366 нм. Оценивают ориентировочное количество бен(а)пирена в пятне экстракта путем сравнения интенсивности его флуоресценции со стандартом. Если в экстракте обнаружен бен(а)пирен, то необходимо провести количественное определение при помощи количественного метода тонкослойной хроматографии (5.3.3.2) или спектрофлуориметрии при комнатной температуре (5.3.4).

5.3.3.2 Количественное определение содержания бенз(а)пирена методом тонкослойной хроматографии.

Пластинку для ТСХ размером 20x20 см размечают тонкими карандашными линиями. В правом нижнем углу пластинки на расстоянии 1,5 см от краев наносят с помощью микрошприца 20 мкл экстракта пробы. В левом нижнем углу пластинки на расстоянии 1,5 см от краев наносят с помощью микрошприца 20 мкл рабочего раствора бенз(а)пирена. В правом верхнем углу пластинки на расстоянии 1, 2 и 3 см от верхнего края пластинки наносят с помощью микрошприца соответственно 2,0, 4,0 и 6,0 мкл стандартного раствора бенз(а)пирена.

Хроматографирование проводят в условиях, аналогичных 5.3.3.1. Сравнивая интенсивность флуоресценции пятна экстракта с интенсивностью флуоресценции различных количеств стандартного раствора бен(а)пирена определяют количество нанограмм (нг) бенз(а)пирена в пятне экстракта.

Проводят два параллельных определения.

Рассчитывают содержание бенз(а)пирена по 5.4.2.

5.3.4 Определение содержания бенз(а)пирена методом спектрофлуориметрии при комнатной температуре.

Сорбент из зоны бенз(а)пирена с основного поля с помощью скальпеля или тонкого шпателя соскабливают с пластинки и переносят на стеклянный фильтр, с которого вещество элюируют в несколько приемов 50 см3 бензола в колбы вместимостью 100 см3, далее растворитель упаривают до небольшого объема, остаток растворителя удаляют потоком воздуха и добавляют в колбу 1 см3 бензола.

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ Определение бенз(а)пирена в зерне, копченых мясных и рыбных продуктах методом ТСХ и ВЭЖХ

Food products

Determination of benz(a)pyrene in grain, smoked meat and fish products by the thin TLC method and HPLC

Дата введения -

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на продовольственное сырье, пищевые продукты, пищевые и вкусовые добавки и устанавливает методы определения бенз(а)пирена с применением спектрофлуориметрии при низкой и комнатной температуре и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия ГОСТ 2603-79 Реактивы. Ацетон. Технические условия ГОСТ 3956-76 Силикагель технический. Технические условия ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия ГОСТ 5777-84 Калий марганцевокислый технический. Технические условия ГОСТ 5789-78 Реактивы. Толуол. Технические условия ГОСТ 5815-77 Реактивы. Ангидрид уксусный. Технические условия ГОСТ 5955-75 Реактивы. Бензол. Технические условия

ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

Издание официальное

ГОСТ 9293-74 Азот газообразный и жидкий. Технические условия ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический; Технические условия

ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия ГОСТ 20289-74 Реактивы. Диметилформамид. Технические условия ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29224-91 Посуда лабораторная стеклянная. Термометры жидкостные стеклянные лабораторные. Принципы устройства, конструирования и применения ГОСТ 29228-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 2. Пипетки градуированные без установленного времени ожидания

ГОСТ 29229-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 3. Пипетки градуированные с временем ожидания 15 с

Примечание- При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов на территории государства по соответствующему указателю стандартов, составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный документ заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом, следует руководствоваться замененным (измененным) стандартом. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Отбор проб

Отбор и подготовку лабораторной пробы для испытания проводят в соответствии с нормативным документом на испытуемый вид продукции.

Из объединенной лабораторной пробы для испытания отбирают две параллельные навески.

4 Метод низкотемпературной спектрофлуориметрии

Сущность метода заключается в экстракции углеводородов, в том числе бенз(а)пирена, гексаном из продукта, предварительно обработанного спиртовым раствором едкого калия, выделении фракции полициклических углеводородов тонкослойной хроматографией на оксиде алюминия и количественном определении в полученной фракции бенз(а)пирена методом низкотемпературной спектрофлуориметрии.

Диапазон определяемых величин массовой доли бенз(а)пирена в анализируемых продуктах от 0,0002 до 0,005 мг/кг или от 0,2 10'7 % до 5,0-10'7 %. Оптимальный диапазон определения массовых концентраций бенз(а)пирена в растворе составляет от 0,01 до 0,05 мкг/см3. 1

ГОСТ 33680-2015
4.1 Аппаратура, материалы и реактивы

Спектрофотометр флуоресцентный с криогенной приставкой для выполнения измерений при температуре жидкого азота минус 196 °С и спектральным диапазоном длин волн от 360 до 420 нм.

Осветитель ультрафиолетовый типа «Хроматоскоп» со спектральным диапазоном от 250 до 700 нм и лампой типа БУВ-15 в качестве источника УФ-излучения.

Шкаф сушильный лабораторный, обеспечивающий температуру (250±4) °С.

Весы лабораторные второго класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Весы лабораторные общего назначения второго класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г по ГОСТ 24104.

Испаритель ротационный с температурой нагрева до 180 °С.

Баня водяная.

Электроплитка бытовая с закрытой спиралью и регулятором нагревания по ГОСТ 14919.

Сосуд Дьюара для жидкого азота любого объема.

Камера для хроматографирования (фотокюветы эмалированные).

Пластины стеклянные размером 15x30 см и 20x40 см.

Колбы К-1-250-29/32 ТХС, К-1-100-29/32 ТХС, К-1-500-29/32 ТХС или П-1-500-29/32 ТХС по ГОСТ 25336.

Холодильники ХПТ-1-300-14/23 ХС или ХПТ-1-400-14/23 ХС по ГОСТ 25336

Холодильники ХПТ-2-400-29/32 ХС и ХПТ-1-300-29/32 или ХПТ-400-29/32 ХС по ГОСТ 25336.

Дефлегматор 250-19/26-29/32 ТС или дефлегматор 300-19/26-29/32 ТС по ГОСТ 25336.

Пробирки стеклянные П2-10-180 ХС по ГОСТ 25336.

Аллонж АИО-14/23-50 ТС по ГОСТ 25336.

Насадка П-1-19/26-14/23 ТС или Н2-19/23 по ГОСТ 25336.

Насос водоструйный лабораторный по ГОСТ 25336.

Пипетки вместимостью 1; 2; 5 и 10 см2 по ГОСТ 29228 и ГОСТ 29229.

Воронка ВФО-32-ПОР 100-14/23 ХС или ВФО-32-ПОР 160-14/23 ХС по ГОСТ 25336.

Пробирки мерные П-2-15-14/23 ХС по ГОСТ 1770.

Воронка делительная ВД-1-500 или ВД-3-500 по ГОСТ 25336.

Цилиндры мерные 1-100,1-250 или 3-100,3-250 по ГОСТ 25336.

Стаканчики для взвешивания (бюксы) СВ-14/8, или СВ-19/9, или СВ-24/10, или СВ- 34/12 по ГОСТ 25336.

Термометр с пределами измерения температуры от 0 °С до 250 °С с ценой деления 1 °С по ГОСТ 29224.

Линейка измерительная с ценой деления 0,1 см по ГОСТ 427.

Колбы мерные 2-100-2 по ГОСТ 25336.

Капилляры стеклянные, палочки стеклянные.

н-Октан, ч., по действующим нормативным документам.

н-Гексан, ч., по действующим нормативным документам.

Спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300 или спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962.

Эфир петролейный фракция при температуре от 40 °С до 70 °С по действующим нормативным документам.

ГОСТ 33680-2015

Хлороформ по ГОСТ 20015.

Бензол по ГОСТ 5955.

Алюминия оксид для хроматографии второй степени активности по действующим нормативным документам.

Калия гидроксид по ГОСТ 24363.

Бенз(а)пирен, содержание основного вещества не менее 98 %.

1,12-Бензперилен, содержание основного вещества не менее 98 %.

Азот жидкий по ГОСТ 9293.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечание - Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками, а также реактивов и материалов по качеству не ниже указанных.

4.2 Подготовка к испытанию

4.2.1    Очистка растворителей

Растворители (н-октан, этиловый спирт, петролейный эфир, хлороформ и н-гексан) перегоняют общепринятым способом с дефлегматором.

4.2.2    Подготовка оксида алюминия

Оксид алюминия высушивают в сушильном шкафу при температуре (250±4) °С в течение 4 часов и хранят в сосуде с пришлифованной пробкой.

4.2.3    Приготовление раствора бенз(а)пирена для тонкослойной хроматографии (раствор «свидетель»)

В бюкс отвешивают 10 мг бенз(а)пирена, приливают несколько миллилитров петролейного эфира до полного растворения взятой навески.

Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят объем раствора до метки петролейным эфиром. Срок хранения раствора не более трех месяцев в холодильнике.

4.2.4    Приготовление стандартного раствора бенз(а)пирена

В бюкс отвешивают (10,0±0,2) мг бенз(а)пирена, приливают несколько миллилитров н-октана до полного растворения взятой навески. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу с притертой пробкой вместимостью 100 см3 и доводят до метки н-октаном. Массовая концентрация бенз(а)пирена в полученном растворе 100 мкг/см3. Раствор хранят в холодильнике.

Срок годности раствора не более трех месяцев.

4.2.5    Приготовление рабочих растворов бенз(а)пирена

Рабочие растворы бенз(а)пирена массовой концентрацией 0,1; 0,04 и 0,02 мкг/см3 в н-октане готовят последовательным разведением исходного стандартного раствора бенз(а)пирена, приготовленного по 4.2.4, в мерных колбах с притертой пробкой вместимостью 100 см3. Растворы хранят в холодильнике. Срок годности растворов не более одного месяца.

4.2.6    Приготовление стандартного раствора 1,12-бензперилена (внутренний стандарт)

Для приготовления исходного раствора в бюкс отвешивают (10,0±0,2) мг 1,12-бензперилена, приливают несколько миллилитров н-октана до полного растворения взятой навески. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу с притертой пробкой вместимостью 100 см3 и доводят до метки н-октаном. Массовая концентрация 1,12-бензперилена в полученном растворе 100 мкг/см3. Раствор хранят в холодильнике. Срок годности раствора не более трех месяцев.

4

ГОСТ 33680-2015

4.2.7    Приготовление рабочих растворов 1,12-бензперилена (растворы внутреннего стандарта)

Рабочие растворы 1,12-бензперилена массовой концентрацией 0,01; 0,005; 0,002 и 0,001 мкг/см3 готовят в н-октане последовательным разведением исходного стандартного, приготовленного по 4.2.6, в мерных колбах с притертой пробкой вместимостью 100 см3. Растворы хранят в холодильнике. Срок годности растворов не более одного месяца.

4.2.8    Подготовка пластин для хроматографического разделения

На стеклянную пластину размером 20x40 см равномерно насыпают оксид алюминия. Затем с помощью стеклянной палочки, разделенной на три части (14; 1 и 3 см) резиновыми колечками толщиной 1 мм и шириной 3 мм, тщательно разравнивают оксид алюминия.

4.3 Проведение испытания

4.3.1 Выделение бенз(а)пирена из продукта

В круглодонную колбу вместимостью 500 см3 помещают навеску продукта массой 25 г, добавляют в колбу 20 см3 дистиллированной воды, 200 см3 этилового спирта и 20 г гидроксида калия. Содержимое колбы перемешивают встряхиванием. Колбу соединяют с обратным холодильником и нагревают на водяной бане до кипения, реакционную смесь кипятят в течение 3 часов. Затем в колбу через холодильник добавляют 150 см3 воды; колбу снимают с бани и охлаждают до комнатной температуры.

После охлаждения жидкую фазу реакционной смеси декантацией переносят в делительную воронку, оставляя остаток продукта в колбе. В колбу с остатком добавляют 150 см3 н-гексана, содержимое колбы энергично перемешивают и н-гексан декантируют в делительную воронку.

Воронку закрывают пробкой и энергично встряхивают, затем закрепляют в штативе и оставляют для расслаивания жидкостей. Для разделения образовавшейся эмульсии к смеси в делительной воронке добавляют 20 смэтилового спирта. После расслаивания нижнюю водно-спиртовую фазу сливают обратно в колбу с осадком, а гексановый экстракт переливают в колбу вместимостью 500 см3.

Такую обработку реакционной смеси проводят еще два раза, используя для экстракции н-гексан по 100 см3 и этиловый спирт для расслаивания эмульсии, порциями по 20 см3

По окончании экстракции остаток в колбе и гидролизат (водно-спиртовую фазу) отбрасывают, а гексановый экстракт промывают в делительной воронке дистиллированной водой трижды по 50 см3 и упаривают порциями в предварительно взвешенной с точностью до второго десятичного знака (в граммах) круглодонной колбе вместимостью 250 см3 на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 60 °С.

Колбу с экстрактом оставляют в вытяжном шкафу для удаления следов растворителя, после чего вновь взвешивают. По разности между взвешиваниями определяют массу выделенного экстракта mi.

От экстракта в колбе отбирают 1/5 часть в бюкс, не взвешивая. Колбу с остатком экстракта взвешивают, по разности масс до и после отбора определяют массу отобранного экстракта /г?2. В бюкс с частью экстракта добавляют от 0,1 до 0,2 см3 раствора «свидетеля» бенз(а)пирена, приготовленного по 4.2.3. Содержимое бюкса и остаток в колбе растворяют в небольшом объеме

ГОСТ 33680-2015

петролейного эфира.

Полученные растворы количественно наносят на подготовленную пластину стеклянными капиллярами: на узкую часть - раствор из бюкса («свидетель»), на широкую - экстракт продукта из колбы. Растворы наносят равномерно сплошной полосой, отступив от нижнего края пластины от 7 до 8 см.

Пластину помещают в кювету для хроматографирования под небольшим углом 20-25°, наливают петролейный эфир так, чтобы он не доходил до линии нанесения пробы. Кювету накрывают стеклом и проводят хроматографию, доводя фронт растворителя до верхнего края пластины.

Не высушивая пластину, облучают ее ультрафиолетовым светом и по светящейся полосе «свидетеля» определяют место нахождения бенз(а)пирена в исследуемой пробе. Отмечают границы полосы бенз(а)пирена на хроматограмме исследуемой пробы. Пластину высушивают на воздухе в вытяжном шкафу.

Отмеченную на хроматограмме исследуемой пробы полоску оксида алюминия с помощью предметного стекла снимают с пластины и количественно переносят на пористую пластину фильтрующей воронки. Воронку соединяют с круглодонной колбой вместимостью 100 см3 и бенз(а)пирен элюируют с оксида алюминия 50 смбензола, добавляя бензол небольшими порциями и перемешивая оксид алюминия на воронке палочкой. Бензол испаряют досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 60 °С. Остаток в колбе октаном количественно переносят в градуированную пробирку. Объем раствора в пробирке не должен превышать 5 см3.

При анализе некоторых продуктов не происходит полного и четкого разделения флуоресцирующих компонентов образца при первичном хроматографировании выделенного из продукта экстракта. В этом случае с пластины снимают более широкую полоску оксида алюминия на уровне «свидетеля», бенз(а)пирен элюируют с оксида алюминия бензолом так, как описано ранее, и остаток после упаривания растворяют в этиловом спирте, и полученный спиртовой экстракт повторно хроматографируют.

Для хроматографического разделения спиртового экстракта используют пластину размером 15x30 см с толщиной слоя оксида алюминия 0,3 мм. На пластине отделяют две полосы шириной 10 и 3 см. На широкую часть пластины наносят с помощью стеклянного капилляра спиртовой экстракт анализируемого продукта, на узкую - раствор бенз(а)пирена в петролейном эфире (раствор «свидетель»). Пластину помещают в кювету под углом от 20° до 25° и проводят хроматографию в хлороформе, доводя фронт растворителя до верхнего края пластины. В ультрафиолетовом свете отмечают по «свидетелю» полосу оксида алюминия с бенз(а)пиреном исследуемого продукта. Затем бенз(а)пирен элюируют с оксида алюминия бензолом и проводят все дальнейшие операции так, как указано ранее.

Раствор бенз(а)пирена в н-октане переносят в пробирку. Объем раствора не должен превышать 5 см3 при исходной навеске продукта 25 г.

В полученном растворе (экстракте) определяют содержание бенз(а)пирена методом низкотемпературной спектрофлуориметрии, используя для количественной оценки метод добавок или метод внутреннего стандарта.

4.3.2 Определение содержания бенз(а)пирена в растворе (экстракте), полученном по 4.3.1 методом добавок

В три пробирки наливают пипеткой по 1 см3 полученного раствора бенз(а)пирена в н-октане. Затем в первую пробирку приливают 2 см3 н-октана. Во вторую пробирку приливают 1,5 см3 н-октана и 0,5 см3 рабочего раствора

6

ГОСТ 33680-2015

бенз(а)пирена массовой концентрации 0,1 мкг/см3, приготовленного по 4.2.5. В третью пробирку вносят 1 см3 н-октана и 1 см3 того же рабочего раствора бенз(а)пирена, что и во вторую пробирку.

Спектрофлуориметрический анализ начинают с третьей пробирки. Для этого третью пробирку помещают в сосуд Дьюара с жидким азотом перед входной щелью спектрофотометра; устанавливают аналитическую линию флуоресценции бенз(а)пирена 403 нм при длине волны возбуждающего света 367 нм. Регулировкой коэффициента усиления и раскрытием щели, а также одновременной юстировкой пробирки в сосуде Дьюара добиваются максимального сигнала по регистрирующему прибору спектрофотометра (от 50 % до 80 %), после чего записывают спектрограмму бенз(а)пирена в области от 401 до 404 нм, фиксируя значение регистрирующего прибора спектрофотометра при длине волны 401 нм. Запись спектра повторяют дважды.

Затем последовательно замораживают в жидком азоте вторую и первую пробирки и записывают спектры флуоресценции в области длин волн от 401 до 404 нм, обязательно выставляя перо самописца при длине волны 401 нм в то же положение, что при сканировании пробы в третьей пробирке.

Массовую концентрацию бенз(а)пирена в анализируемом экстракте определяют по графику, на котором по оси абсцисс откладывают значение добавки бенз(а)пирена (мкг), а по оси ординат - высоту пика максимума характеристической линии бенз(а)пирена при 403 нм, измеренную по полученным спектрограммам в миллиметрах.

Если массовая концентрация бенз(а)пирена в исследуемом растворе попадает в область, пригодную для измерений, то полученные экспериментальные точки лежат на одной прямой. Экстраполяция этой прямой до пересечения с осью абсцисс дает на ней отрезок, длина которого соответствует содержанию бенз(а)пирена в растворе без добавки, то есть в 1 см3 исследуемого раствора. В случае, если массовая концентрация бенз(а)пирена в анализируемом растворе выше верхнего предела диапазона измеряемых прибором концентраций, то проводят разбавление анализируемого раствора н-октаном и спектрофлуориметрический анализ проводят вновь.

4.3.3 Определение содержания бенз(а)пирена в растворе(экстракте), полученном по 4.3.1 методом внутреннего стандарта.

В качестве внутреннего стандарта используют 1,12-бензперилен. В пробирку наливают 3 см3 раствора бенз(а)пирена в н-октане, полученного по 4.3.1, и помещают в сосуд Дьюара с жидким азотом перед входной щелью спектрофотометра, устанавливают аналитическую линию 403 нм при длине волны возбуждающего света 367 нм и проводят запись спектра анализируемого раствора в области длин волн от 401 до 409 нм. По интенсивности линии (по высоте пика максимума характеристической линии бенз(а)пирена при 403 нм) оценивают приблизительное содержание бенз(а)пирена в пробе. В соответствии с этой оценкой далее в пробирку с 3 см3 раствора бенз(а)пирена в н-октане добавляют раствор 1,12-бензперилена в таком количестве, чтобы в спектре пробы интенсивность 1,12-бензперилена при 406,3 нм была в три-пять раз больше интенсивности линии бенз(а)пирена при длине волны 403 нм.

Проводят запись спектра в интервале длин волн от 401 до 409 нм дважды.

Интенсивности характеристических линий бенз(а)пирена при 403 нм и 1,12-бензперилена при 406,3 нм (Hi и Н2 соответственно) определяют по спектрограммам, измеряя высоты пиков в максимумах характеристических линий этих соединений в миллиметрах. В расчетах принимают среднюю величину. Рассчитывают коэффициент

7

1

2