Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1
 

23 страницы

396.00 ₽

Купить официальный бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Официально распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Устанавливает метод идентификации и количественного определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы в молоке, молочной продукции, яйцах, яичном порошке, меде, органах и тканях животных с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием в диапазоне измерений от 1,0 до 1000,0 мкг/кг

Введен впервые (ИУС 03-2013)

Оглавление

1 Область применения

2 Нормативные ссылки

3 Сущность метода

4 Средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы, реактивы

5 Требования безопасности

6 Порядок подготовки к проведению измерений

7 Порядок выполнения измерений

8 Метрологические характеристики

9 Оформление результатов измерений

10 Контроль качества результатов измерений

Приложение А (справочное) Структурные формулы антибиотиков тетрациклинового ряда

Приложение Б (справчоное) Отношение площади пика иона антибиотика к площади пика иона внутреннего стандарта

Приложение В (справочное) Контроль стабильности результатов измерений

Библиография

Показать даты введения Admin

Страница 1

межгосударственный совет по стандартизации, метрологии и сертификации

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION (ISC)

ГОСТ

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ    31694_

СТАНДАРТ

2012

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ, ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЕ СЫРЬЕ

Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором

Издание официальное

-'1    Москва

£] Стандартинформ

Страница 2

ГОСТ 31694-2012

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)

2    ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 1 октября 2012 г. No 51—2012)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК <ИСО 3166 J ОМ-97

Код страны по МК(ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Армения

AM

Минэкономики Республики Армения

Беларусь

BY

Госстандарт Республики Беларусь

Казахстан

KZ

Госстандарт Республики Казахстан

Кыргызстан

KG

Кыргызстандарт

Молдова

MD

Молдова-Стандарт

Российская Федерация

RU

Росстандарт

Узбекистан

UZ

Узстандарт

4    Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. No 1424-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31694-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 01 июля 2013 г.

5    Стандарт подготовлен на основе ГОСТ Р 53601-2009

6    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта публикуется в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты».

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случав пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты»

©Стандартинформ. 2013

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

Страница 3

ГОСТ 31694-2012

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ, ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЕ СЫРЬЕ

Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором

Food products, food raw materials.

Method of determination of the antibiotic residues of tetracycline group by High Performance Liquid Chromatography - Mass Spectrometry

Дата введения - 2013 - 07 - 01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод идентификации и количественного определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы в молоке, молочной продукции, яйцах, яичном порошке, меде, органах и тканях животных с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием в диапазоне измерений от 1,0 до 1000,0 мкг/кг.

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требований безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.2.085-2002 Сосуды, работающие под давлением. Клапаны предохранительные. Требования безопасности

ГОСТ 245-76 Реактивы.Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия

ГОСТ 908-2004 Кислота лимонная моногидрат пищевая. Технические условия

Издание официальное

1

Страница 4

ГОСТ 31694-2012

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042—83, ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия ГОСТ 2603-79 Реактивы. Ацетон. Технические условия ГОСТ 3622-68 Молоко и молочные продукты. Отбор проб и подготовка их к испытанию

ГОСТ ИСО 5725-6-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике ГОСТ 5848-73 Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия ГОСТ 6552-80 Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия ГОСТ 8981-78 Эфиры этиловый и нормальный бутиловый уксусной кислоты технические. Технические условия

ГОСТ 10652-73 Реактивы. Соль динатриевая этилендиамин-N, N, N', N'-тетрауксксной кислоты 2-водная (трилон Б). Технические условия

ГОСТ 13867-68 Продукты химические. Обозначения чистоты ГОСТ 19792-2001 Мед натуральный. Технические условия ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1:1981) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 30364.0-97 Продукты яичные. Методы отбора проб и органолептического анализа

ГОСТ 31654-2012 Яйца куриные пищевые. Технические условия

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю «Национальные стандарты», составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Сущность метода

3.1 Определение остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС).

Метод ВЭЖХ-МС/МС обеспечивает хроматографическое разделение антибиотиков тетрациклиновой группы и их эпи-форм (приложение А).

2

Страница 5

ГОСТ 31694-2012

3.2    Количественное определение остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы проводят методом внутреннего стандарта по сумме ппощадей пиков идентифицированных соединений и их эпи-форм для каждого антибиотика при помощи градуировочной кривой.

3.3    Детектирование анализируемых проб проводят в режиме регистрации выбранных реакций.

4 Средства измерений, вспомогательное оборудование,

материалы, реактивы

4.1 При определении содержания антибиотиков тетрациклиновой группы применяют следующие средства измерений, вспомогатепьное оборудование и материалы:

-    масс-спектрометр с диапазоном измерения от 100 до 500 атомных единиц массы (а.е.м.), массовым разрешением не менее 500, точностью измерения массы не ниже 0,2 а.е.м., с режимом получения и анализа фрагментных ионов (режим МС/МС);

-    систему высокоэффективную жидкостную хроматографическую, состоящую из бинарного насоса со смесителем; термостата хроматографической колонки, обеспечивающего температуру нагрева до 50 °С;

-    компьютер с установпенным программным обеспечением для управления масс-спектрометром и обработки результатов масс-спектрометрических измерений;

-    весы пабораторные по ГОСТ 24104, высокого или специального класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 и 500 г с ценой поверочного депения 0,1 и 1,0 мг соответственно;

-    рН-метр с набором электродов, с предепами абсолютной погрешности измерений+0,01 pH;

-    пипетки одноканальные переменного объема 10—100 мм3, 40—200 мм3, 200—1000 мм3, 1—5 см3 [1];

-    пробирки мерные стеклянные П-1-5-0.1ХС, П-2-10-14/23 по ГОСТ 1770;

-    пипетки стеклянные градуированные по ГОСТ 29227;

-    копбы мерные стеклянные К-2-100-2, К-2-1000-2 по ГОСТ 1770;

-    виалы (флаконы полипропиленовые) вместимостью 15 и 50 см3 с герметично закрывающимися пластмассовыми крышками [2];

-    фильтры мембранные с размером пор не бопее 0,5 мкм [3];

3

Страница 6

ГОСТ 31694-2012

-    измельчитель-гомогенизатор лабораторный [4];

-    встряхиватель вибрационный для пробирок орбитального типа движения с амплитудой встряхивания 3 мм и диапазоном скоростей от 150 до 2500 об/мин [5];

-    центрифугу лабораторную рефрижераторную со скоростью вращения ротора не менее 10000 об/с и диапазоном температур охлаждения от 4 °С до 20 °С, с адаптерами для пробирок вместимостью 15 см3 и микроцентрифужных пробирок вместимостью 1,5 см3 (6);

-    модуль термостатируемый нагревательный с системой отдувки растворителей инертным газом и максимальной температурой термостатирования 40 °С [7];

-    баню упьтразвуковую с рабочей частотой не менее 20 Гц и объемом не менее 1 дм3 [8];

-    копонку хроматографическую обращенно-фазную длиной не менее 50 мм с диаметром частиц сорбента не более 5 мкм;

-    устройство вакуумное для твердофазной экстракции;

-    картридж для твердофазной экстракции объемом не менее 12 см3, запоп-ненный обращенно-фазным сорбентом с диаметром частиц не более 50 мкм;

-    камеру лабораторную морозильную с цифровым контроллером температуры и рабочим диапазоном температур от минус 18 °С до минус 24 °С;

-    холодильник бытовой с морозильной камерой, цифровым контроллером температуры и рабочим диапазоном температур от 0 °С до 5 °С.

4.2 При определении содержания антибиотиков тетрациклиновой группы применяют следующие реактивы:

-    кислоту лимонную пищевую по ГОСТ 908, высшего сорта;

-    метанол х.ч.;

-    ацетонитрил ч.д.а.;

-    деионизованную воду;

-    муравьиную кислоту ч.д.а по ГОСТ 5848;

-    натрий фосфорнокислый двузамещенный дигидрат ч.д.а по ГОСТ 245;

-    соль динатриевую этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилон Б) по ГОСТ 10652;

-    ортофосфорную кислоту по ГОСТ 6552;

-    этилацетат по ГОСТ 8981;

-    ацетон по ГОСТ 2603;

-    стандартный образец тетрациклина гидрохлорида с содержанием действующего вещества не менее 90 % (9];

4

Страница 7

ГОСТ 31694-2012

-    стандартный образец окситетрациклина гидрохлорида с содержанием действующего вещества не менее 90 % [10];

-    стандартный образец хлортетрациклина гидрохлорида с содержанием действующего вещества не менее 90 % [11];

-    стандартный образец доксициклина с содержанием действующего вещества не менее 90 % [12];

-    стандартный образец демеклоциклина с содержанием действующего вещества не менее 90 % [13].

Все реактивы должны относиться к подгруппе чистоты 2 (х. ч.) или 3 (ч.д.а.) по ГОСТ 13867.

5    Требования безопасности

5.1    Используемые в работе реактивы относятся к веществам 1-го и 2-го классов опасности по ГОСТ 12.1.007, при работе с ними необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005.

5.2    Помещения, в которых проводят анализ и подготовку проб, допжны быть оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией.

5.3    Операции по приготовпению и дозированию градуировочных растворов следует проводить под тягой в вытяжном шкафу.

5.4    В связи с тем, что при работе на хромато-масс-спектрометре используется сжатый азот, следует соблюдать требования ГОСТ 12.2.085 и правил устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давпением, действующих на территории государства, принявшего стандарт.

5.5    При выполнении измерений на хромато-масс-спектрометре спедует соблюдать правипа электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5.6    К выпопнению измерений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии — масс-спектрометрии допускаются лица, владеющие техникой ВЭЖХ-МС/МС и изучившие инструкции по эксплуатации аппаратуры.

6    Порядок подготовки к проведению измерений

6.1    Отбор проб

6.1.1    Отбор проб проводят в соответствии с методическими указаниями по отбору проб пищевой продукции с цепью пабораторного контроля качества и безопасности, утвержденными на территории государства, принявшего стандарт.

Страница 8

ГОСТ 31694-2012

6.1.2    Отбор проб органов, тканей животных и птицы производят в соответствии с [14]. Масса средней пробы органов, тканей животных и птицы не менее 200 г.

6.1.3    Отбор проб молока и молочных продуктов производят в соответствии с ГОСТ 3622. Объем средней пробы молока не менее 200 см3, масса средней пробы образцов молочных продуктов не менее 250 г.

6.1.4    Отбор проб меда производят в соответствии с ГОСТ 19792. Масса средней пробы меда не менее 200 г.

6.1.5    Отбор проб яиц и яичного порошка производят в соответствии с ГОСТ 31654 и ГОСТ 30364.0. От яиц в качестве средней пробы отбирают не менее 12 шт.; масса средней пробы яичного порошка не менее 200 г.

6.2 Подготовка хромато-масс-спектрометрической системы к выполнению измерений

Подготовку хромато-масс-спектрометра к работе осуществпяют в соответствии с техническим руководством по эксплуатации прибора.

При этом должны быть соблюдены следующие условия:

-    температура окружающего воздуха..............................от 20 °С до 25 °С;

-    атмосферное давление.............................................от 84 до 106 кПа;

-    напряжение в электросети.........................................(220 + 10) В;

-    частота тока в электросети.........................................от 49 до 51 Гц;

-    относительная влажность воздуха...............................от 40 % до 80 %.

6.3 Приготовление растворов

6.3.1    Приготовление раствора лимонной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм3

В мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 21 г лимонной кислоты, растворяют в деионизированной воде и доводят объем до метки этим же растворителем.

Срок хранения при комнатной температуре - не бопее 1 мес.

6.3.2    Приготовление раствора гидрофосфата натрия молярной концентрации 0,2 мольI дм3

В мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 35,6 г двузамещенного фосфата натрия, растворяют в деионизированной воде и доводят объем до метки этим же растворителем.

Срок хранения при комнатной температуре - не более 1 мес.

6.3.3    Приготовление буферного раствора

6

Страница 9

ГОСТ 31694-2012

Для приготовления буферного раствора смешивают в соотношении 60:40 растворы лимонной кислоты и гидрофосфата натрия, полученные по 6.3.1 и 6.3.2, добавляют 37,2 г трилона Б, измеряют pH и, при необходимости, доводят значение pH до 4,0 ортофосфорной кислотой.

6.3.4    Приготовление растворов элюентов мобильной фазы А и Б

6.3.4.1    Для приготовления раствора элюента мобильной фазы А в мерную колбу вместимостью 1000 см3 приливают деионизованную воду, добавляют 5 см3 муравьиной кислоты и доводят объем до метки деионизованной водой.

Срок хранения при комнатной температуре - не более 1 мес.

6.3.4.2    Дня приготовления раствора элюента мобильной фазы Б в мерную колбу вместимостью 1000 см3 припивают метиповый спирт, добавпяют 5 см3 муравьиной кислоты и доводят объем до метки метиловым спиртом.

Срок хранения при комнатной температуре - не бопее 1 мес.

6.3.5    Приготовление градуировочных растворов

6.3.5.1    Приготовление градуировочных растворов тетрациклинов

Для приготовления градуировочных растворов тетрациклинов на весах с наибольшим предепом взвешивания 500 г взвешивают по 10 мг каждого стандартного образца по 4.1 (кроме демеклоциклина) и переносят в мерную пробирку вместимостью 10 см3. Добавляют метанол, помещают в упьтразвуковую баню на 1 мин и доводят попученный раствор до метки метанопом.

Массовая концентрация каждого антибиотика тетрациклиновой группы в растворе Со составляет 1 мг/см3.

Срок хранения раствора - 3 мес при температуре минус 20 °С.

6.3.5.2    Приготовление раствора демеклоциклина (внутреннего стандарта)

Для приготовления раствора внутреннего стандарта на весах с наибольшим предепом взвешивания 500 г взвешивают 10 мг стандарта демеклоциклина гидрохлорида и переносят в мерную пробирку вместимостью 10 см3. Добавляют метанол, помещают в упьтразвуковую баню на 1 мин, доводят полученный раствор до метки метанолом.

Массовая концентрация внутреннего стандарта в растворе составляет 1 мг/см3. Путем нескольких разбавлений доводят массовую концентрацию раствора внутреннего стандарта до значения 1 мкг/см3. Раствор с данной концентрацией используют для внесения в исследуемые образцы.

Срок хранения раствора -3 мес при температуре минус 20 °С.

7

Страница 10

ГОСТ 31694-2012

Перед применением растворы выдерживают при комнатной температуре, в темном месте, не менее 20 мин.

6.4 Хроматографические условия измерений

6.4.1    Хромато-масс-спектрометр включают и настраивают в соответствии с техническим руководством по его эксплуатации и устанавливают следующие хроматографические параметры:

-    скорость потока эпюента - 200 мм3/мин;

-    объем вводимой пробы - 20 мм3.

6.4.2    Детектирование пиков проводится методом «регистрации выбранных реакций»1*. Для каждого антибиотика тетрациклиновой группы измеряется сигнал для двух фрагментных ионов согласно таблице 1.

Таблица 1-Значения масс ионов-предшественников и ионов-фрагментов

Антибиотик тетрацикл иновой группы

Ион-предшественник,

m/z*

Ионы-фрагменты,

m/z*

Тетрациклин

445,1

410.0

427.1

Окситетрациклин

461,1

426.1

444.2

Доксициклин

445,1

428.0

410.0

Хлортетрациклин

479,1

444.1

462.1

Демеклоциклин

465,1

448,1 430,11

* mfz - отношение массы иона к его заряду.

Бопее интенсивный пик (верхний в каждой строке таблицы 1) служит для опредепения концентрации антибиотика, второй (нижний в каждой строке таблицы 1) используется для подтверждения правильности опредепения. Пики ионов-фрагментов с массой 410,1 тетрациклина и доксициклина различаются по времени их удержания в хроматографической копонке, опредепяемому на стадии разработки ВЭЖХ-МС/МС метода.

11 «Регистрация выбранных реакций» - режим работы масс-спектрометра, при котором детектируется ионный ток только для выбранных фрагментных ионов выбранных ионов-прекурсоров.

8

Страница 11

ГОСТ 31694-2012

6.5    Построение градуировочной характеристики

6.5.1    Градуировочную кривую строят при помощи матричной градуировки. Для этого проводят обработку «чистых» проб, приготовленных и проанализированных ранее в соответствии с требованиями раздела 7, не содержащих тетра-циклинов более 1 мкг/кг для каждого из антибиотиков, в зависимости от типа исследуемой матрицы. На стадии перерастворения перед введением в хроматограф в мерную пробирку вместимостью 5 см3, содержащую исследуемую «чистую» пробу, добавляют градуировочный раствор тетрациклинов по 6.3.5.1 с таким расчетом, чтобы окончательные массовые концентрации находились в пределах от 1 до 1000 нг/см3. Затем добавпяют 50 мм3 раствора внутреннего стандарта по 6.3.5.2 и необходимое количество мобильной фазы А по 6.3.4.1, доводя объем до 1 см3.

6.5.2    Дня получения градуировочных данных используют не менее четырех уровней концентраций матричных градуировочных растворов.

6.5.3    При построении градуировочной зависимости для количественного оп-редепения тетрациклинов анализируют матричные градуировочные растворы различных уровней концентраций в условиях, описанных в 6.2 и 6.4. Затем строят графики зависимости массовой концентрации антибиотика тетрациклиновой группы от отношения площади хроматографического пика антибиотика тетрациклиновой группы к площади пика внутреннего стандарта дпя каждого фрагментного иона четырех антибиотиков тетрациклиновой группы. Образец графика приведен в приложении Б.

Построение графиков может проводиться при помощи программы обработки данных ВЭЖХ-МС/МС или при помощи программы Excel (Microsoft Office).

6.5.4    Расчетные концентрации для обоих фрагментных ионов каждого антибиотика тетрациклиновой группы должны совпадать в пределах 20 %.

Градуировочная зависимость считается приемлемой, если рассчитанное значение квадрата коэффициента корреляции для градуировочной кривой каждого фрагментного иона каждого антибиотика тетрациклиновой группы не менее 0,98.

6.6    Подготовка лабораторной посуды и реактивов

6.6.1 Мойку и сушку посуды следует проводить в отдельном помещении, оборудованном приточно-вытяжной вентипяцией. Не допускается проведение подготовки посуды в данном помещении для других видов анализов. Для сушки лабораторной посуды и подготовки реактивов необходимо испопьзовать отдельные сушильные шкафы.

9

Страница 12

ГОСТ 31694-2012

6.6.2    Стеклянную посуду подвергают стандартной процедуре очистки лабораторной посуды с последующей последовательной промывкой органическими растворителями: этилацетатом (однократно), ацетоном (дважды).

6.6.3    Процедуру промывки органическими растворителями следует проводить в вытяжном шкафу. Рекомендуется на стадиях промывки использовать ультразвуковую баню. Окончательную сушку посуды проводят в сушильном шкафу, установленном в вытяжном шкафу, при температуре от 105 °С до 110 °С.

7 Порядок выполнения измерений

7.1    Обработка проб органов, тканей животных, яиц, яичного порошка, молока, молочных продуктов и меда

7.1.1    Мышечную ткань предварительно очищают от грубой соединительной ткани. Яйца отделяют от скорлупы. Каждую пробу измельчают на гомогенизаторе и взвешивают по 1,0 г гомогенизированной пробы в виале на лабораторных весах с наибольшим пределом взвешивания 200 г. В виалу добавляют 50 мм3 раствора внутреннего стандарта по 6.3.5.2 и оставляют для уравновешивания на 15 мин. Затем добавляют 10 см3 экстрационного буферного раствора по 6.3.3, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 15 мин. Далее виалы с образцами помещают на предварительно охлажденную до 4 °С центрифугу и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 мин. Процедуру экстракции и центрифугирования повторяют еще один раз. Объединенные экстракты собирают в чистые виалы.

7.1.2    1,0 г меда взвешивают на лабораторных весах с наибольшим пределом взвешивания 200 г в виале вместимостью 50 см3. В виалу добавляют 50 мм3 раствора внутреннего стандарта no 6.3.5.2 и оставляют для уравновешивания на 15 мин. Затем добавляют 20 см3 экстрационного буферного раствора по 6.3.3, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 1 мин. Далее виалы с образцами помещают на предваритепьно охлажденную до 4 °С центрифугу и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 мин.

7.2    Проведение твердофазной экстракции и подготовка к хроматографированию

7.2.1 Для проведения твердофазной экстракции картридж дня ТФЭ запоп-няют 0,5 г сорбента. Предварительно картридж кондиционируют 6 см3 метилового спирта и уравновешивают 6 см3 бидистиллированной воды. Затем наносят объединенный экстракт и вновь промывают 6 см3 бидистиплированной воды. Тетра-

10

Страница 13

ГОСТ 31694-2012

циклины элюируют с сорбента при помощи 6 см3 мобильной фазы Б. Полученный элюат упаривают на нагревательном модуле в токе воздуха до 0,5 см3 при температуре 40 °С.

7.2.2 Для перерастворения и подготовки к хроматографированию объем полученного упаренного элюата в мерной пробирке вместимостью 10 см3 доводят до 1 см3 при помощи мобильной фазы А и помещают на ультразвуковую баню на 1 мин. Полученный экстракт фильтруют через мембранный фильтр и используют для ВЭЖХ-МС/МС анализа.

7.3    Обработка проб молока

7.3.1    Для очистки образцов к навеске образца молока массой 1 г, помещенной в виапу, добавляют 100 мм3 раствора внутреннего стандарта по 6.3.5.2 и оставляют для уравновешивания на 15 мин. Затем добавляют 3 см3 ацетонитрила, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 3 мин, затем оставляют на 15 мин в горизонтальном положении для последующего уравновешивания. Далее виалу с образцом помещают на предваритепьно охлажденную до 4 °С центрифугу и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 мин. Полученный раствор переносят в мерную пробирку вместимостью 10 см3 и упаривают до 1 см3 на нагревательном модуле в токе воздуха при температуре 40 °С. К полученному остатку добавляют 9 см3 буферного раствора 6.3.3 и помещают на ультразвуковую баню.

7.3.2    Процедуру твердофазной экстракции осуществляют в соответствии с

7.2.1,    а перерастворение и подготовку к хроматографированию - в соответствии с

7.2.2.

7.4    ВЭЖХ-МС/МС анализ

7.4.1    Для определения остаточного содержания тетрациклинов и их эпиформ проводят анализ в условиях, указанных в 6.4.

7.4.2    Время удерживания антибиотиков тетрациклиновой группы опредепя-ют при анализе градуировочных растворов.

7.5    Контроль качества измерений

7.5.1    Каждая серия измерений включает в себя несколько степеней подтверждения качества измерений.

7.5.2    Для исключения контаминации образца испопьзуемыми реагентами проводят обработку «чистого образца» в соответствии с 7.1 — 7.3 в зависимости от типа исследуемой матрицы.

11

Страница 14

ГОСТ 31694-2012

7.5.3    Для учета матричного эффекта при расчете остаточных содержаний антибиотиков тетрациклиновой группы используют матричную градуировку по 6.5.

7.5.4    Проводят испытание образца с обработкой пробы в соответствии 7.1 -7.3 в зависимости от типа исследуемой матрицы.

7.6 Обработка результатов хроматографического анализа

7.6.1    Расчеты содержания антибиотика тетрациклиновой группы выполняют с помощью градуировочной характеристики спедующим образом. Вычисляют отношение площади пика фрагментного иона к площади внутреннего стандарта с помощью программы обработки спектров поставпяемой вместе с хромато-масс-спектрометром. Затем, для найденного значения (абсциссы) находят точку на градуировочной характеристике. Ордината этой точки является искомым содержанием (приложение Б).

7.6.2 Окончательные результаты измерений содержания тетрациклинов округляют до целого значения и выражают в микрограммах на килограмм.

8 Метрологические характеристики

8.1    Установленный в настоящем стандарте метод обеспечивает выполнение измерений содержания тетрациклинов с расширенной неопределенностью результатов аналитических измерений при коэффициенте охвата к = 2, указанной в таблице 2.

Примечание — Значения относительной расширенной неопределенности, указанные в таблице 2. соответствуют границам относительной погрешности результатов измерений при Р = 0,95.

Таблица 2 - Значения относительной расширенной неопределенности измерений (при коэффициенте охвата к = 2) V, %, в диапазонах измерений содержаний антибиотиков тетрациклиновой группы, мкг/кг

Антибиотик

тетрациклиновой

группы

Относительная расширенная неопределенность Vn, %, при Р = 0,95 и диапазоне измерений содержания тетрациклинов, мкг/кг

от 1,0 до 10,0 включ.

св. 10,0 до 100,0 включ.

св. 100,0 до 1000,0 включ.

Тетрациклин

69

27

12

Окситетрациклин

67

28

20

Доксицикпин

80

25

12

Хлортетрациклин

114

23

18

12

Страница 15

ГОСТ 31694-2012

9    Оформление результатов измерений

9.1    Результат анализа Мс в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде формулы

Мса,±иЙ1С ,    (1)

где Хпх.— среднеарифметическое значение двух параллельных измерений содержания п-го антибиотика в анализируемой пробе, мкг/кг; п£ - расширенная неопределенность при коэффициенте охвата к - 2 определения содержания n-го антибиотика тетрациклиновой группы, определяемая по формупе (2), мкг/кг.

9.2 Значения расширенной неопределенности измерения рассчитывают с использованием значений относительной расширенной неопредепенности при к- 2 (в соответствии с табпицей 2) по формупе

— V

Vnu=X'‘—,    (2)

100’

где - среднеарифметическое значение двух параллельных измерений содержания л-го антибиотика в анализируемой пробе, мкг/кг;

Vn - значение относитепьной расширенной неопределенности содержания п-го антибиотика тетрациклиновой группы для соответствующего диапазона измерений (таблица 2).

10    Контроль качества результатов измерений

10.1    Контроль полноты извлечения внутреннего стандарта тетрацик-линов

10.1.1    Контроль извлечения внутреннего стандарта тетрациклинов выполняют в ходе каждого измерения (получения результата количественного химического анализа при собпюдении требований настоящего стандарта).

10.1.2    Рассчитанные программным обеспечением значения извпечения внутренних стандартов допжны находиться в диапазоне от 40 % до 130 %. Еспи рассчитанное значение извлечения ниже или выше указанного диапазона, то результаты измерения массовой доли тетрациклинов не принимают за окончатепь-ный результат. Проводят повторные исследования анализируемых проб.

10.2    Контроль неопределенности результатов измерений

При проведении испытаний рекомендуется в ходе анализа каждой серии образцов с использованием стандартной процедуры пробоподготовки (см. 7.1 и

Страница 16

ГОСТ 31694-2012

7.3) проводить анализ градуировочных растворов в соответствии с 6.4. Результаты измерений признают удовлетворительными при выполнении следующего неравенства:

/ \

-

ч

Х„ --Х пс п. а

£

Хп,С

\ ш)

где хил - рассчитанное с помощью градуировочной характеристики значение содержания л-го антибиотика тетрациклиновой группы в анализируемой пробе, мкг/кг;

Хл.э - значение содержания n-го антибиотика по паспорту на стандартный образец, мкг/кг;

Vn - значение относитепьной расширенной неопредепенности содержания п-го антибиотика тетрациклиновой группы для соответствующего диапазона измерений (таблица 2), %.

14

Страница 17

ГОСТ 31694-2012

Приложение А (справочное)

Структурные формулы антибиотиков тетрациклинового ряда

эпимеризация

Н2

Тетрациклин

эпимеризация рН2- 6

эпимеризация рН2- 6

Хлортетрациклин

Окситетрациклин

4 - эпихлортетрациклин

эпимеризация рН2- 6

4 - эпидоксициклин

15

Страница 18

Приложение Б (справочное)

Отношение площади пика иона антибиотика к площади пика иона внутреннего стандарта


Концентрация, мкг/кг

Рисунок Б.1 — Отношение площади пика иона антибиотика к площади пика иона

внутреннего стандарта

16

Страница 19

ГОСТ 31694-2012

Приложение В (обязательное)

Контроль стабильности результатов измерений

Периодичность контроля стабильности результатов измерений регламентируют в руководстве по качеству лаборатории.

Контроль стабильности результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ ИСО 5725-6, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения промежуточной прецизионности рутинного анализа с изменяющимися факторами «время» и «оператор».

Применяя метод контрольных карт Шухарта. проверяют стабильность этих результатов измерений и оценивают стандартное отклонение промежуточной прецизионности с изменяющимися факторами «время» и «оператор». После отбора испытуемую пробу от каждой партии подготавливают в лаборатории для анализа. Одну пробу, подвергавшуюся анализу во время смены (С,), анализирует повторно другой оператор в другую смену (С,), и результаты сравнивают. Значение стандартного отклонения промежуточной прецизионности (Оцт.оj) устанавливают в лаборатории по результатам измерений за предыдущий период. Параметры контрольной карты пределов для каждого диапазона рассчитывают следующим образом:

- среднюю линию по формуле

1(Т.О}~^^^'а1ГТ.Оп    (4)

где Оцт.о) - среднеквадратическое отклонение промежуточной прецизионности, %;

-    верхний предел действия по формуле

£/С1д=3,686 с,,го,;    (5)

-    верхний предел предупреждения по формуле

UCLn = 2,834 ‘Gl(r0t‘    (6)

Расхождение (w) рассчитывают по формуле

2AC. -CJ-100

М' = ——-—

(7)

(С,+Са)

Расхождение w наносят на карту в течение контролируемого периода. Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30. После этого проводят

17

Страница 20

ГОСТ 31694-2012

оценку стандартного отклонения промежуточной прецизионности (Stfr.o)) результатов по формуле

п

*тт~т.-*г'    (8)

где тп - число измерений.

Полученное значение S,<T.o) используют для последующего контроля стабильности результатов измерений.

18

Страница 21

ГОСТ 31694-2012

Библиография

[1]    Пипетки переменного объема одноканальные, Transferpettor Brand, Германия

[2]    Виалы (флаконы полипропиленовые) вместимостью 15 и 50 см3, Corning 430790 и 430290

[3]    Фипьтры мембранные с размером пор 0,5 мкм, Acrodisc CR 13 мм, 0,2 мкм, Life Sciences PN 4423Т

[4]    Измельчитель-гомогенизатор лабораторный MMR 0801/01, Bosch, Германия

[5]    Вибрационный встряхиватель для пробирок (вортекс) Multi Reax, Heidolph, Германия

[6]    Центрифуга лабораторная роторная рефрижераторна, Beckman, Германия

[7]    Термостатируемый нагревательный модуль с системой отдувки растворителей инертным газом, Reacti-Therm (Pierce, США)

[8]    Ультразвуковая баня, Elma S 30 Н, Германия

[9]    Стандартный образец тетрациклина гидрохлорида, USP, Sigma, Т4062

[10]    Стандартный образец окситетрациклина гидрохлорида, USP, Sigma, 05875

[11]    Стандартный образец хлортетрациклина гидрохлорида,USP, Sigma, С4881

[12]    Стандартный образец доксициклина, USP, Sigma, D9891

[13]    Стандартный образец демеклоциклина, USP, Sigma, D6140

[14]    ИСО 17604:2003 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных.

Отбор проб с туши дпя микробиологического анализа (Microbiology of food and animal feeding stuffs. Carcass sampling for microbiological analysis)

19

Страница 22

ГОСТ 31694-2012

УДК 637,638:614.3:006.354    МКС    67.050

67.100

67.120

Ключевые слова: пищевые продукты, продовольственное сырье, антибиотики тет-рациклиновой группы, метод определения содержания с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием

20

Страница 23

Издано а электронном виде в формате PDF, подтвержденном электронно-цифровои подписью Удостоверяющею центра Росстандарта

Редактор Н.В Таланова

Печ. л. 3.00. Уч.-иэд л. 2.40

ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ». 123995 Москва. Гранатный пер.. 4 www.goslinfo.rumfo@goslinfo.ru