Стр. 1
 

21 страница

446.00 ₽

Купить официальный бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Официально распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Распространяется на питьевую воду и устанавливает методы санитарно-бактериологического анализа, отбора, хранения и транспортирования проб воды

утратил силу на территории РФ в части разд. 1, с 01.07.2011 пользоваться ГОСТ Р 53415-2009

Оглавление

1 Метод отбора, хранения итранспортирования проб воды

2 Аппаратура, материалы, реактивы, питательные среды

3 Подготовка к анализу

4 Проведение анализа

Приложение Пояснения к пользованию таблицами

Показать даты введения Admin

Страница 1

2.12. Контроль микробиологических и паразитологических показателей

ГОСТ 18963-73

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ВОДА ПИТЬЕВАЯ

МЕТОДЫ

САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО

АНАЛИЗА

Издание официальное

Москва

Стандартинформ

2008

Страница 2

Группа 1109

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ВОДА ПИТЬЕВАЯ

Методы саннгарно-бактсрно.югнческото аналиш

ГОСТ

18963-73

Drinking water.

Methods of sanitary-bacteriological analysis

MKC 13.060.20 ОКСТУ 9109

Дата в веления 01.07.74

Настоящий стандарт распространяется на питьевую воду и устанавливает методы санитарно-бактериологического анализа, отбора, хранения и транспортирования проб воды.

1. МЕТОД ОТБОРА. ХРАНЕНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ ПРОБ ВОДЫ

1.1.    Для отбора проб воды используют стерильные флаконы вместимостью 0.5 дм’ с притертой каучуковой или корковой пробкой.

1.2.    Место и время отбора пробы определяют в зависимости от цели анализа в наиболее характерных точках водопроводной сети: ближайших к насосной станции, наиболее удаленных от нее, наиболее возвышенных, в тупиках, а также в точках, качество воды в которых вызывает сомнение.

1.3.    Пробы воды периферической водопроводной сети отбирают в периоды наибольшего расхода воды при соблюдении правил стерильности, после предварительной стерилизации кранов обжиганием пламенем горящего тампона, смоченного спиртом, и последующего спуска воды в течение 10—15 мин при полностью открытом кране. Бумажный пакет или колпачок с флакона снимают вместе с пробкой непосредственно перед отбором пробы, не касаясь пробки руками. Наполняют флаконы с таким расчетом, чтобы при транспортировании не замочить пробку. Обьем отбираемой пробы — 500 см3. Наполненные флаконы закрывают притертыми, каучуковыми или корковыми пробками и стерильными бумажными колпачками, которые обвязывают ниткой и бечевкой.

1.4.    Пробы хлорированной водопроводной воды (с аммонизацией или без нее) отбирают во флаконы с дехлорагом: во флакон, предназначенный для отбора 500 см1 воды, до стерилизации вносят 10 мг серноватистокислого натрия.

868

1

   ©Издательство    стандартов,    1973

<& Стандарт»! нформ, 2008

Страница 3

ГОСТ 18963-73 С. 2

1.5.    Отобранные пробы должны сопровождаться документом, содержащим: точное наименование этапа очистки и обеззараживания;

при отборе проб из периферической водопроводной сети — точное месторасположение крана, из которого отбирают пробу;

дату отбора пробы (с указанием года, месяца, числа и часа); особые обстоятельства, имевшие место при отборе проб (время спуска воды из крана, условия транспортирования и т. п.);

цель исследования: сделан ли отбор пробы в порядке текущего санитарного надзора или по особым показаниям (рекомендации санитарно-эпидемиологической службы; сигналы, поступающие от населения, об изменении органолептических качеств воды и т. п.).

Все сопроводительные документы должны быть подписаны лицом, отбиравшим пробу, с указанием его места работы и должности.

1.6.    Проба должна быть исследована не позже чем через 2 ч после ее ortiopa. При невозможности выполнения этих условий анализ допускается проводить

не позже чем через 6 ч после отбора пробы, сохраняя при этом пробу при температуре от 1 до 5 "С.

1.7.    При невозможности исследовать пробы на месте допускается транспортировать их в пределах времени, указанных в п. 1.6.

1.8.    Посуда с пробами должна быть упакована в сумки-холодильники или в ящики с теплоизолирующей прокладкой.

1.9.    Температуру, указанную в п. 1.6. необходимо поддерживать, применяя резиновые или пластмассовые мешки, наполненные летом льдом, а зимой теплой водой.

1.10.    Необходимо избегать при транспортировании резких толчков, которые могут привести к намоканию пробок.

2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ. РЕАКТИВЫ, ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

2.1. Для проведения анализа должны применяться следующие аппараты, реактивы и питательные среды:

банки широкогорлые с притертыми пробками; воронки стеклянные по ГОСТ 23932;

колбы конические вместимостью 250 и 500 см3 по ГОСТ 25336; колбы с тубусом по ГОСТ 25336; флаконы стеклянные вместимостью 100—250 см3; посуда мерная лабораторная стеклянная по ГОСТ 1770; пипетки вместимостью 1, 5, 10 см' с ценой деления 0.1    см’ исполнений    4.

5. 6 по ГОСТ 29227;

пипетки Мора вместимостью 50 и 100 см-1;

цилиндры вместимостью 100, 250. 500 см3 исполнений    1.    3    или    мензурки

вместимостью 250. 500. 1000 см' по ГОСТ 1770; пробирки бактериологические по ГОСТ 25336;

флаконы для отбора пробе притертыми пробками или без них вместимостью 500 см3;

спиртовки по ГОСТ 25336;

стаканы лабораторные по ГОСТ 25336;

стекла покровные для микропрепаратов по ГОСТ 6672;

869

Страница 4

С. 3 ГОСТ 18963-73

стекла предметные для микропрепаратов по 1'ОСТ 9284; чашки бактериологические (Петри); кристаллизаторы;

насос водоструйный стеклянный лабораторный по ГОСТ 25336; поплавки для пробирок и колб длиной 20. 45 и 75 мм и диаметром соответственно 5, 9 и 10 мм;

автоклав электрический по ТУ 27—31—2939;

аппараты фильтровальные с диаметром фильтрующей поверхности 32 мм;

баня водяная;

вакуум-насос:

весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 241041, 4-го класса точности, наибольший предел взвешивания 200 г, допускаемая погрешность не более 0,02 г; весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104, 4-го класса точности, наибольший предел взвешивания I кг, допускаемая погрешность не более 0,1 г; дистиллятор;

лупа с увеличением 2—5' по ГОСТ 25706;

микроскоп биологический по нормативно-техническому документу;

осветитель ОИ-19;

пенаты металлические для пипеток;

пластинка с сеткой для счета колоний;

pH-метр;

прибор для счета колоний бактерий:

термостаты электрические для выращивания бактерий с автоматическим терморегулятором до 50 "С и с термометром с ценой деления 0,2 “С;

холодильник электрический или газовый бытовой, поддерживающий температуру на 4—6 'С;

холодильники походные (сумки) или яшики для транспортирования проб с теплоизоляцией и резиновыми мешками (для льда или теплой воды); часы сигнальные или песочные по ОСТ 25—11—38; шкаф сушильный;

агар-агар в волокнах или в порошке по ГОСТ 17206;

агар сухой питательный;

кислота борная по ГОСТ 9656;

индикатор бриллиантовый зеленый;

индикатор бромтнмоловый синий;

вага гигроскопическая медицинская по ГОСТ 5556;

вата хлопчатобумажная негнгроскопическая по ТУ—17 РСФСР 63—9022;

индикатор генциан фиолетовый;

глюкоза, х. ч., по ГОСТ 6038;

днметил-м-фенилендиамии;

желчь крупного рогатого скота свежая или сухая обезвоженная;

вода дистиллированная по ГОСТ 6709;

желатин;

йод по ГОСТ 4159;

калий йодистый по ГОСТ 4232;

1

С I июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104— 2001 (здесь и далее).

S70

Страница 5

ГОСТ 18963-73 С. 4

калий фосфорнокислый двузамещенный по ГОСТ 2493; калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198; кислота соляная по ГОСТ 3118: кислота розоловая;

индикатор кристаллический фиолетовый; лактоза;

марля медицинская в кусках и бинтах по ГОСТ 9412; масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739; натрия гидроокись по ГОСТ 4328; натрий серноватисто кислый по ГОСТ 27068; натрий хлористый по ГОСТ 4233; а-нафтол по ТУ 6—09—5417;

пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805;

проволока из никелевых сплавов диаметром 0,3—0,5 мм;

спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 59621;

среда Эндо сухая питательная;

препарат с индикатором ВР и глюкозой;

препарат с индикатором ВР и лактозой;

фенол по ТУ 6—09—5303;

фильтры мембранные № 2 и 3 и фильтры планктонные № 6 или фильтрующие мембраны «Владилор» марки МФА-МА М> 5. 6. 7, 8, 10 диаметром 35 мм; фуксин основной; фуксин кислый;

бумага фильтровальная по ГОСТ 12026: пробки резиновые разных размеров для флаконов;

«сторож для молока*.

(Измененная редакция, Изм. № 1, 2).

3- ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ

3.1.    Подготовка посуды и материалов

3.1.1.    Вся бактериологическая посуда перед стерилизацией должна быть тщательно вымыта и высушена.

3.1.2.    Пробирки и флаконы должны быть заткнуты ватными пробками и завернуты в бумагу. На горлышки флаконов следует надеть бумажные колпачки, которые обвязывают шнурком (ниткой).

3.1.3.    Флаконы для отбора проб должны быть заткнуты ватными пробками, снабжены бумажными колпачками. Хорошо подобранные притертые, каучуковые или корковые пробки, завернутые в бумагу, привязывают к горлышку флакона.

3.1.4.    Пробки для пробирок и флаконов готовят из ваты, обертывают слоем марли и завязывают ниткой на свободном конце.

3.1.5.    Чашки Петри укладывают в металлические пеналы или завертывают в бумагу. Между крышкой и дном бактериологических чашек, предназначенных

1

На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 51652-2000.

S7I

Страница 6

С. 5 ГОСТ 18963-73

для разливки среды Эндо, можно проложить кружки фильтровальной бумаги диаметром на 1—2 см больше диаметра чашки.

3.1.6. В конец пипетки, который берется в рот, вкладывают кусочек ваты. Пипетки помешают в металлические пеналы не более 6—10 шт. в каждый или завертывают в бумагу.

3.2. Стерилизация посуды

3.2.1.    Подготовленную посуду стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при (160 ± 5) "С в течение 1 ч, считая с момента достижения этой температуры. Флаконы с привязанными к ним каучуковыми пробками стерилизуют отдельно в автоклаве при (126 ± 2) *С (1.47 10* Па) 30 мин.

(Измененная редакция, Изм. № 2).

3.2.2.    Простерши» зованную посуду вынимают из сушильного шкафа после его охлаждения ниже 60 *С.

3.2.3.    Стерильную посуду хранят в плотно закрытых шкафах или ящиках лабораторных столов.

3.2.4.    При отсутствии сушильного шкафа посуду стерилизуют в автоклаве при (126 ± 2) *С (1,47 10’ Па) 30 мин.

(Измененная редакция, Изм. № 2).

3.3. Приготовление сред и реактивов

3.3.1.    Приготовление стерильной воды

Водопроводную (колодезную, речную) воду разливают в пробирки по 10 cmj в каждую или во флаконы по 100 см* в каждый, закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве при (120 ± 2) *С (1,078 105 Па) 20 мин. Срок хранения — не более двух недель.

Целесообразнее воду стерилизовать во флаконе и разливать в пробирки по 9 см’ непосредственно перед посевом, соблюдая правила стерильности.

3.3.2.    Пригототение мясной в<м)ы

500 г мясного фарша без жира и сухожилий заливают 1 дм} дистиллированной поды, настаивают 12 ч на холоде или 1 ч в водяной бане при 50—60 “С. Затем настой кипятят, фильтруют через марлю или вату и опять доводят дистиллированной водой до I дм3, разливают во флаконы, стерилизуют в автоклаве при (120 ± 2) 'С (1,078 10s Па) 20 мин или приступают непосредственно к приготовлению мясного бульона или других питательных сред.

3.3.3.    Приготомение мясопептонного бульона

К I дм3 мясной воды прибаааяют 10 г пептона и 5 г хлористого натрия, нагревают до полного растворения пептона и соли, устанавливают pH (7,2—7,4), осветляют, фильтруют и разливают в пробирки или флаконы в количествах, необходимых для анализа, закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве при (120 ± 2) *С (1.07S 10' Па) 20 мин.

Примечание. Допустимая погрешность взвешивания 0,1 36.

3.3.4.    Нригото&гение мясопептонного агара

К. 1 дм3 мясопептонного бульона приба&ляюг 15 г агара в волокнах или порошке, нагрепают до полного растворения, проверяют pH (7,2—7,4), осветляют, фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр и разливают во флаконы или пробирки в количествах, необходимых для анализа. Стерилизуют в автоклаве при (120 ± 2) 'С (1,078- 1Q5 Па) 20 мин.

S72

Страница 7

ГОСТ 18963-73 С. 6

Вместо мясопептонного бульона также используют перевар Хотгингера с концентрацией амннного азота не менее ИЮ мг/дм3.

3.3.1—3.3.4. (Измененная релакиня, Изм. № 2).

3.3.5.    Приготовление питательного агара Дагестанского НИИ питательных сред

Готовят по прописи на этикетке.

3.3.6.    Приготовление глюкозопептонной среды

Среду готовят двух видов: нормальную и концентрированную.

Среда нормальной концентрации: 10 г пептона. 5 г хлористого натрия. 5 г глюкозы. 1 дм3 дистиллированной воды. После растворения указанных ингредиентов прибавляют индикатор (2 см' 1.6 %-иого спиртового раствора бромтн-молового синего или 10 см' индикатора Андреде), устанавливают pH (7,4—7.6), разливают по 10 см-' в пробирки с поплавками или комочками ваты, стерилизуют в автоклаве при 112’С (0,49-101 11а) 12 мин. Приготовляя концентрированную среду, количество всех ингредиентов, кроме волы, увеличивают в 10 раз.

(Измененная редакция, Изм. № 2).

3.3.7.    Приготовление лактозопептонной среды

Готовят так же. как глюкозопептонную среду, заменив глюкозу лактозой.

3.3.8.    Приготовление индикатора Андреде

I г кислого фуксина растворяют в 32 см1 нормального раствора гидрата окиси натрия, прибавляют 200 см3 дистиллированной воды, настаивают 24 ч при 37 'С, фильтруют, стерилизуют 5 мин при 100 *С. Хранят во флаконе из темного стекла с притертой пробкой.

3.3.9.    Приготов.гение полужидкой с/уеды с индикатором ВР и глюкозой

Готовят по прописи на этикетке. Срок хранения — не более 7 сут.

3.3.10.    Приготовление полужидкой среды с глюкозой

Полужидкую среду применяют при отсутствии сухих сред. Для этого в 1 дм3 дистиллированной волы растворяют 10 г пептона, 5 г хлористого натрия, 4—5 г агар-агара, доводят до кипения, устанавливают pH (7,2—7,4), добавляют 1 см3 1,6 %-иого спиртового раствора бромтимолового синего. Стерилизуют при (120 ± 2) *С (1,078 105 Па) 20 мин. В расплавленную среду вносят 5 г глюкозы. нагревают до кипения, разливают в стерильные пробирки столбиком высотой около 3 см и стерилизуют при 112 *С (0,49 10' Па) 12 мин. Срок хранения — не более 7 сут.

(Измененная редакция, Изм. № 2).

3.3.11.    Приготовление среды Эндо (модификация)

Готовят из сухого препарата по прописи на этикетке.

В готовую и охлажденную ло 60—70 "С среду перед разливкой в чашки допускается прибавлять на 100 см3 среды: 0,2 см3 10 %-ного спиртового раствора основного фуксина для повышения дифференцирующих свойств срелы и 0,2 см3 5 %-ного спиртового раствора розоловой кислоты во избежание зарастания посевов споровыми аэробными бактериями. После тщательного перемешивания среду разливают в чашки по 20—25 см3. Если на поверхности среды заметны следы влаги, чашки перед посевом необходимо подсушить. Для этого можно оставить чашки со средой на 0,5—1 ч для застывания и подсушивания накрытыми стерильными кружками фильтровальной бумаги. Хранить чашки со средой допускается не более двух-трех суток в темноте или

S73

Страница 8

С. 7 ГОСТ 18963-73

в холодильнике. Срок хранения растворов фуксина и розоловой кислоты — не более одного месяца.

3.3.12.    Приготовление желчно-.мктозного бульона с бри.ииантовым зеленым

10 г пептона, 10 г лактозы, 200 см3 свежей фильтрованной желчи крупного рогатого скота (или 20 г сухой обезвоженной желчи, растворенной в 200 см1 дистиллированной воды) растворяют при нагревании в 700 см5 дистиллированной волы, устанавливают pH (7,2—7,4), прибавляют 13.3 см5 1 %-ного водного раствора бриллиантового зеленого, доливают дистиллированной водой до общего объема I дм3. фильтруют через ватный фильтр, разливают по 5 см' в пробирки с поплавками и стерилизуют при 112 "С (0,49 10' Па) 12 мин или три дня при 100 “С. Срок хранения — не более двух недель.

3.3.13.    Пригототение борнокиаой буферной среды с лактозой

10 г пептона, 12,2 г калия фосфорнокислого двузамещенного (безводного), 4,1 г калия фосфорнокислого однозамешенного (безводного), 3,2 г борной кислоты. 5 г лактозы растворяют в 1 дм3 дистиллированной воды, разливают по 5 см3 в пробирки с поплавками, стерилизуют при 112 "С (0,49110* Па) 12 мин. Срок хранения — не более двух недель.

3.3.12, 3.3.13. (Измененная редакция, Изм. № 2).

3.3.14.    Приготовление реактивов для окраски по Грому *

Карболовый раствор генциана фиолетового готовят следующим образом: I г генциана фиолетового, 10 см3 ректификованного этилового спирта, 5 г фенола растирают в ступке, добавляя 100 см3 дистиллированной воды.

Раствор Люголя готовят следующим образом: 1 г йода, 2 г йодистого калия растворяют в 300 см* дистиллированной воды. Хранят во флаконе из темного стекла.

Фуксин Циля готовят следующим образом: 1 г основного фуксина, 10 см3 ректификованного этилового спирта, 5 г фенола растирают в ступке, добавляя 100 см3 дистиллированной воды.

Мазок на предметном стекле фиксируют трехкратным проведением через пламя горелки. На препарат накладывают полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают карболовый раствор генциана фиолетового на 0,5—1 мни. снимают бумагу, начнваюг раствор Люголя на 0,5—1 мин, сливают раствор Люголя и стекло прополаскивают в этиловом спирте в течение 0,5—1 мин, пока не перестанет отходить краситель. Затем стекло тщательно промывают водой и докрашиваю! от 1 до 2 мин фуксином Циля, разведенным 1:10 дистиллированной водой. После промывки и просушивания препарата мазок мнкроскопируют.

Экспресс-метод окраски по Граму.

Приготовление реактива Ne 1: 0.5 %-ный спиртовой раствор кристаллического фиолетового.

Приготовление реактива № 2: в 100 см3 ректификованного этилового спирта растворяют 0,4 г йодистого калия, нагревают на водяной бане или оставляют на сутки при комнатной температуре. Затем прибаачяют0,2 г кристаллического йода и 0.1 г основного фуксина. Хранят во флаконе из темного стекла.

1

Вместо карболового раствора генциана фиолетового и фуксина Циля допускается использовать полоски фильтровальной бумаги, пропитанные соочвстству юшими растворами и высушенные.

S74

Страница 9

ГОСГ 18963-73 С. 8

На обезжиренное спиртом предметное стекло наносят петлей одну каплю дистиллированной «юлы (при приготовлении препарата из колоний на плотных средах) или одну каплю бульонной культуры. В каплю дистиллированной воды вносят небольшое количество микробных клеток из анализируемой колонии или газона чистой культуры на плотной среде. Затем в каплю вносят петлей одну каплю реактива № 1, распределяют смесь по стеклу и подсушивают мазок при комнатной температуре. Затем фиксируют на пламени горелки, промывают водой, просушивают фильтровальной бумагой и наносят реактив № 2. покрывая им всю поверхность стекла, на 1—5 мин (продолжительность окраски не влияет на ее результат). Тщательно и быстро прополаскивают препарат водой, просушивают фильтровальной бумагой, микроскопируют. При приготовлении на одном стекле нескольких мазков на лицевую сторону стекла наносят восковым карандашом линии, деляшне поверхность стекла на необходимое количество квадратов.

3.3.15. Пригото&шие реактива для определения оксидатой активности бактерий

30—40 мг а-нафтола растворяют в 2,5 см' ректификованного этилового спирта, прибаатяют 7,5 см* дистиллированной воды и растворяют 40— 60 мг диметил-л-фенилендиамина. Раствор готовят непосредственно перед определением.

Оксидазный тест предназначается для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от неотрицательных бактерий семейства Pseudomonadaceae и других водных сапрофитных бактерий, которые обладают активным ферментом оксидазой и окисляют фенилендиамиповые соединения до индофенола ярко-синего цвета.

3.3.15.1.    Постановка оксидазного теста при работе методом мембранных фильтров

Мембранный фильтр с выросшими на нем колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги несколько большего диаметра, чем фильтр, обильно смоченный реактивом. Через 2—4 мин определяют результат. Все посиневшие колонии или с синим ободком не относятся к семейству Enterobacteriaceae, их учитывают.

Колонии, не изменившие своего первоначального цвета, в подавляющем большинстве образованы бактериями группы кишечных палочек, но среди них могут быть кокки, спорообразующие и неотрицательные палочки, не имеющие санитарно-показательного значения, которые не учитывают после микроскопнрования и отсутствия образования газа на полужидкой среде с глюкозой при (37 ± 0,5) ‘С. Учитывая бактерицидность реактива для определения оксидазной активности, мембранный фильтр сразу же после четкого проявления реакции переносят обратно на среду Эндо и немедленно (не позднее чем через 5 мин) пересеивают оксидазоотрицательные колонии в полужидкую среду с глюкозой.

3.3.15.2.    Постановка оксидазного теста при работе бродильным методом

По 2—3 изолированные колонии каждого типа, выросшие на секторах среды

Эндо. снимают петлей или стеклянной палочкой и наносят штрихом на фильтровальную бумагу', смоченную реактивом. В месте нанесения бактериальной массы бумага не изменяет цвета, если оксидазный тест отрицательный, и синеет в течение 1 мин, если бактерии имеют активную оксидазу. Исследование нзо-

S75

Страница 10

С. 9 ГОСТ 18963-73

лированных колоний является обязательным, иначе можно необоснованно отбросить кишечную палочку при ложном посинении за счет примеси оксидазо-положительиых бактерий.

Примечание. Если оксилазный тест со средой Эндо проявляется недостаточно четко из-за того. ЧТО мешают ингибиторы (эго относится в основном к земно-красным колониям), то для получения правильного результата такие колонии можно пересеять на секторы или на скошенный питательный агар и после полрашиваиия повторить оксилазный тест.

4. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

4.1.    Определение общего количества бактерий в воде

Сущность метода заключается в определении в I см> воды общего содержания

меэофнльных, меэотрофиых аэробов и факультативных анаэробов, способных расти на питательном агаре данного состава при температуре (37 ± 0,5) “С в течение (24 ± 2) ч. образуя колонии, видимые при увеличении в 2—5 раз.

4.1.1.    Питательный агар расплавляют в водяной бане и охлаждают до температуры (45 ± 5) *С.

4.1.2.    Стерильные чашки Петри раскладывают на столе и подписывают на крышках номер пробы, дату посева и объем посеянной волы.

4.1.3.    Из каждой пробы должен быть сделан посев не менее двух различных объемов, выбранных с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. При исследовании водопроводной воды засевают в каждую из двух чашек по 1 см3.

4.1.4.    С флаконов с пробой воды снимают бумажные колпачки, вынимают пробки, горлышки фламбируют, после чего воду тщательно перемешивают осторожным продуванием воздуха через стерильную пипетку.

4.1.5.    Стерильной палочкой отбирают соответствующие объемы воды и вносят в стерильные чашки, слегка приоткрывая крышку.

4.1.6.    Для посева 0,1 см3 и меньших объемов воды используют разведения анализируемой воды. Ятя этого в пробирку с 9 см! стерильной воды, приготовленной по п. 3.3.1, вносят I см' анализируемой воды. При этом пипетка должна быть опущена ниже поверхности воды не более чем на 3 мм, чтобы избежать смывания бактерий с наружной стороны. Другой стерильной пипеткой продуванием воздуха тщательно перемешивают содержимое пробирки, отбирают из нее I см3 и переносят в чашку, что будет соответствовать посеву 0,1 см’ анализируемой воды. При необходимости посева меньших объемов воды этой же пипеткой переносят 1 см3 содержимого первой пробирки в следующую с 9 см3 стерильной воды. Посев 1 см3 из второй пробирки будет соответствовать посеву 0,01 см3 анализируемой воды и т. д.

4.1.7.    После внесения воды в чашки Петри ее заливают 10—12 см3 остуженного питательного агара при фламбированин краев пробирки или бутылки, где он содержится.

Воду быстро смешивают с агаром, осторожно наклоняя или вращая чашку по поверхности стола. Необходимо избегать образования пузырьков воздуха, незалитых частей дна чашки, попадания среды на края и крышку чашки. После этого чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания среды.

4.1.8.    После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх

S76

Страница 11

ГОСТ 18963-73 С. Ю

дном не более чем по 3—4 чашки вместе. Посевы выращивают при (37 ± 0,5) *С в течение (24 ± 2) ч.

4.1.9.    Колонии, выросшие как на поверхности, так и в глубине агара, под-считывают с помощью лупы с увеличением в 2—5 раз или прибора для счета колоний. Для этого чашку кладут вверх дном на черный фон. Для большей точности счета каждую подсчитанную колонию отмечают со стороны дна тушью или чернилами для стекла.

4.1.10.    Оценивают только те разведения, при посеве которых на чашке выросло от 30 до 300 колоний. При посеве 1 см5 неразведанной пробы учитывают любые количества колоний, но не превышающие 300.

Если в чашке с наиболее высоким разведением выросло свыше 300 колоний и анализ нельзя повторить, то допускается подсчитывать колонии с помощью пластинки с сеткой и лупы при сильном боковом освещении. Подсчитывают не менее 20 квадратов плошадью I см- каждый в разных местах чашки, затем выводят среднеарифметическое число колоний на 1 см2, значение которого умножают на площадь чашки в см’, вычисленную по формуле

S = к г2.

4.1.11.    Результат подсчета колоний в каждой чашке выражают в количестве бактерий на 1 см3 анализируемой воды с учетом посеянного объема. За окончательное количество бактерий принимают среднеарифметическое результатов подсчета на двух параллельных чашках или разных разведений. Результаты округляют следующим образом:

если результат находится в пределах чисел от 1 до 100, то записывают тс числа, которые получены; если результат находится в пределах чисел от 101 до 1000, то результат округляют до 10: если результат находится в пределах чисел от 1001 до 10000. то результат округляют до 100 и т. д.

4.1.12.    Количество колоний учитывают, ориентируясь на одну чашку, в случаях: если на другой чашке при посеве из разведения выросло менее 20 колоний: при ползучем росте бактерий, распространившихся на всю поверхность чашки или значительные зоны, маскирующем рост других колоний; при количестве колоний свыше 300.

Счетную пластинку рекомендуется применять при подсчете количества колоний. когда на обеих чашках отмечен ползучий рост.

При этом просчитывают квадраты на свободных от сплошного роста местах чашки.

4.1.13.    Окончательный результат вносят в протокол анализа или в журнал регистрации, где должны быть приведены сведения из сопроводительного документа к пробе воды. Кроме того, отмечают особые обстоятельства анализа (превышение срока хранения пробы, изменение температуры и времени инкубации посевов, применение заменителей при приготовлении питательных сред и прочие вынужденные отклонения).

4.2. Определение количества бактерий группы кишечных палочек

К бактериям группы кишечных палочек относятся грамотрииательные. не образующие спор палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа при (37 ± 0,5) 'С в течение 24—48 ч или сбраживающие глюкозу с образо-

877

Страница 12

С. 11 ГОСТ 18963-73

ванием кислоты и газа при (37 ± 0,5) *С п течение 24 ч и не обладающие оксидазной активностью.

Обнаружение в воде бактерий группы кишечных палочек следует рассматривать как показатель фекального загрязнения волы, а их количество позволяет судить о степени этого загрязнения.

Количество бактерий группы кишечных палочек определяют методом мембранных фильтров и бродильным методом.

Метод мембранных фильтров

Сущность метода заключается в концентрировании бактерий из определенного объема анализируемой воды на мембранный фильтр, выращивании их при (37 ± 0.5) 'С на среде Эндо. дифференцировании выросших колоний и подсчете количества бактерий группы кишечных палочек на 1 дм-' воды.

4.2.1.    Подготовка к анализу

При анализе воды, поступающей в водопроводную сеть, и в наиболее характерных ее точках необходимо анализировать объем не менее 333 см1, профильтровывая этот объем не менее чем через два фильтра.

На этапах очистки анализируют не менее двух десятикратных объемов воды, выбранных в зависимости от ее качества таким образом, чтобы на одном из фильтров вырастало не более 30 колоний бактерий группы кишечных палочек. При этом необходимо ориентироваться па результаты предыдущих анализов воды в этих же пунктах (например, для воды посте первичного хлорирования могут быть выбраны объемы 10 и 100 см5; для воды необеззараженной — 0,1; 1 и 10 см5).

При анализе воды неизвестного качества следует засевать 3—4 десятикратных объема (например, из водопроводной сети можно фильтровать 3; 30; 100; 200 см5 воды; по этапам очистки — 0,1; 1; 10; 100 см3 воды).

4.2.2.    Подготовка мембранных фильтров

Мембранные фильтры № 2 или 3. а также планктонные фильтры .Nfc 6, проверенные на отсугствие трещин, отверстий и т. п.. помещают по одному на поверхность дистиллированной волы, нагретой до 80 *С в стакане (в чашке для выпаривания, эмалированной кастрюле), и медленно доводят до кипения на слабом огне, после чего воду заменяют и кипятят 10 мин. Смену воды и последующее кипячение повторяют 3—5 раз до полного удаления остатков растворителей из фильтров, после чего они готовы к работе. Подготовленные фильтры сохраняют сухими или в широкогорлой банке с дистиллированной водой. Перед употреблением фильтры стерилизуют кипячением в дистиллированной воде.

Фильтрующие мембраны «Владипор» марки МФА-МА № 5. 6. 7, 8 и 10, визуально проверенные на отсутствие трещин, отверстий, пузырей и т. п., стерилизуют кипячением. При этом во избежание скручивания мембран необходимо строго соблюдать следующие правила. На дно сосуда, в котором проводят кипячение (химический стакан, эмалированная кастрюля и т. п.), помещают «сторож для молока* или нержавеющую сетку (для ограничения бурного кипения). Дистиллированную воду заливают в этот сосуд в небольшом объеме, ограничивающем свободное вращение в ней фильтрующих мембран, но достаточном для того, чтобы предназначенные для стерилизации фильтрующие мембраны были покрыты водой. Дистиллированную воду доводят в сосуде до 80—90 *С, после чего, убавив нагрев, на поверхность воды по одной поме-

878

Страница 13

ГОСТ 18963-73 С. 12

щают фильтрующие мембраны. Воду с помещенными в нее мембранами медленно доводят до кипения и кипятят на слабом огне в течение 10—15 мин. Затем воду сливают и заменяют небольшим количеством (чтобы покрыть фильтрующие мембраны) стерильной дистиллированной воды. После этого фильтрующие мембраны готовы к употреблению. При необходимости может быть проведено повторное кипячение фильтрующих мембран.

(Измененная редакция, Изч. № 1).

4.2.3.    Подготовка фильтровального аппарата к анализу

Перед посевом воды фильтровальный аппарат стерилизуют фламбнрованием после обтирания оатным тампоном, смоченным спиртом. После охлаждения на нижнюю часть фильтровального аппарата (столик) кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его верхней частью прибора (стаканом, воронкой) и закрепляют устройством, предусмотренным конструкцией прибора.

4.2.4.    Фильтрование во<)ы

В воронку (стакан) фильтровального прибора при соблюдении правил стерильности наливают необходимый объем воды и создают вакуум в приемном сосуде. Фильтруют сначала меньшие, а затем большие объемы воды через один фильтровальный аппарат, меняя каждый раз фильтры. При фильтровании небольших объемов воды (1 см5) в воронку сначала наливают 10 см3 стерильной воды, а затем вносят анализируемую воду.

После окончания фильтрования воронку снимают, фильтр осторожно приподнимают за край фламбированным пинцетом при сохранении вакуума для удаления излишка влаги на нижней стороне фильтра, а затем переносят его. не переворачивая, на среду Эндо, разлитую в чашку Петри, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.

Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, даты посева и номера пробы. На одну чашку можно поместить 3—4 фильтра с условием, чтобы фильтры не соприкасались.

4.2.5.    Если анализируемая вода содержит большое количество взвешенных веществ или клеток фитопланктона, то ее фильтруют сначала через предварительный фильтр № 6 для удаления крупной взвеси. Для этого фильтр № 6 помещают в фильтровальный прибор над фильтром № 2 или 3. После окончания фильтрования оба фильтра переносят на среду Эндо. При выведении результатов анатиза учитывают рост бактерий на обоих фильтрах.

При работе с фильтрующими мембранами «Владипор» марки МФА-МА в качестве предварительной мембраны для удаления крупной взвеси используют мембрану «Владипор* марки МФА-МА М> 10. которую помещают в фильтровальный прибор над основной мембраной, задерживающей бактерии группы кишечных палочек. В качестве основной используют фильтрующую мембрану «Владипор» марки МФА-МА .Nfc 5, 6, 7 или 8. После окончания фильтрования предварительную и основную мембраны переносят на среду Эндо. При определении результатов анализа учитывают рост бактерий на обеих фильтрующих мембранах.

(Измененная редакция, Изм. № 1).

4.2.6.    Чашки с фильтрами на среде Эндо помещают в термостат дном вверх и инкубируют при (37 ± 0,5) "С в течение 18—24 ч.

S79

Страница 14

С. 13 ГОСТ 18963-73

4.2.7.    Обработка результатов

При отсутствии каких-либо колоний на фильтрах или при наличии только пленчатых, губчатых, с неровной поверхностью и краями, плесневых и других нехарактерных для кишечных палочек колоний дают отрицательный результат на присутствие бактерий группы кишечных палочек в анализируемом объеме воды. Анализ на этом этапе заканчивают через 18—24 ч.

4.2.8.    При наличии на фильтрах колоний, характерных для кишечных палочек (темно-красных с металлическим блеском и без него, розовых, прозрачных), из нескольких колоний каждого типа готовят мазки, окрашивают по Граму и мнкроскопируют. Отсутствие в мазках грамотрицательных неспороносных палочек дает отрицательный ответ. Анализ на этом заканчивают через 18—24 ч.

4.2.9.    При наличии в мазках грамотрицательных. коротких, полиморфных, не образующих спор палочек (возможны удлиненные нитевидные формы, а также крупные палочки, полярно окрашенные) выполняют оксидазный тест (п. 3.3.15.1).

4.2.10.    Н&чичне активной оксидазы у всех колоний, кроме перечисленных в п. 4.2.7, позволяет дать отрицательный результат.

4.2.11.    Отсутствие оксидазы у темно-красных с металлическим блеском и без него (лактозоположительных) колоний позволяет отнести их к бактериям группы кишечных палочек и немедленно дать положительный ответ.

Анализ питьевой воды может быть завершен на этом этапе, если нет других колоний, не обладающих оксидазной активностью.

Анализ воды по этапам очистки заканчивают через 18—24 ч подсчетом этих колоний для вычисления колииндекса.

4.2.12.    При наличии на фильтрах розовых и бесцветных колоний с отрицательной оксидазной активностью их подсчитывают и подтверждают принадлежность к бактериям группы кишечных палочек посевом 2—3 изолированных колоний каждого типа в полужидкую среду с глюкозой. Учет проводят через 4—5 ч инкубации при (37 ± 0.5) 1С. Мри образовании кислоты и газа результат анализа считают положительным. При отсутствии кислоты и газа получают отрицательный результат. Анализ заканчивают через 24—28 ч.

При наличии только кислоты пробирки оставляют в термостате для окончательного учета через 24 ч. При отсутствии газообразования через 24 ч получают окончательный отрицательный результат, при наличии газообразования — положительный результат.

4.2.13.    Вычисление колииндекса

Результат выражают в виде колииндекса, т. е. количества бактерий группы кишечных палочек в 1 дм3 воды. Питьевая вода удоатетворяет требованиям ГОСТ 2874*, если колииндекс не превышает 3.

Колинндекс высчитывают следующим образом: количество бактерий группы кишечных палочек, выросших в анализируемом объеме воды, умножают на 1000 см3 и делят на этот объем воды.

При отсутствии на фильтрах бактерий группы кишечных палочек колииндекс будет меньше той величины, которая была бы определена в случае обнаружения в анализируемом объеме одной клетки кишечной палочки.

880

1

На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 51232-98.

Страница 15

ГОСТ 18963-73 С. 14

Пример I. При посеве 300 см3 воды не выросло пи одной колонии. <1-1 ООО): 300 = 3. Кол и индекс менее 3.

При наличии бактерий группы кишечных палочек вычисляют колииндекс, учитывая весь объем анализируемой воды.

Пример 2. При посеве трех объемов воды по 100 см3 на одном фильтре выросло три колонии бактерий группы кишечных палочек, на двух других нет роста; колииндекс равен (3 1000): 300 = 10. При посеве 10 и 100 см3 воды на одном фильтре выросла одна колония, на другом выросло пять колоний; колииндекс равен (6 1000): 110 = 54.

Если на одном из фильтров сплошной рост бактерий и подсчет их невозможен, тогда в расчет принимают тот объем волы, при фильтровании которого па фильтре выросли изолированные колонии.

Пример 3. В 100 см3 — сплошной рост, в 10 см3 — 12 бактерий группы кишечных палочек; колииндекс равен (12 1000): 10 = 1200.

При подсчете колииндекса в пробах воды необеззараженной. с большим фекальным загрязнением, когда для анализа профильтровывают объем воды менее 10 см' или ее разведения, то для учета выбирают тот фильтр, на котором выросло не менее 10 и не более 30 изолированных колоний кишечных палочек. Количество колоний на нем. относимых к бактериям группы кишечных палочек, пересчитывают на 1 дм* с учетом только того объема воды, который профильтрован через этот фильтр.

Если на всех фильтрах получен более густой рост и анализ невозможно повторить, то допускается подсчет колоний на фильтре с наименьшим разведением. но с записью в протоколе исследования и в журнале регистрации.

Результат в виде колииндекса вносят в журнал регистрации и в протокол анализа, где помечают особые обстоятельства, имевшие место при анализе воды (отклонения в температуре инкубации, составе используемых сред, особенно добавки в среду Эндо и т. п.).

Бродильный метод

Сущность метода заключается в посеве определенных объемов анализируемой воды и подрашнвании при (37 ±0.5) "С вередах накопления с последующим высевом бактерий на плотную среду Эндо. дифференцировании выросших бактерий и определении наиболее вероятного числа бактерий группы кишечных палочек в I дм5 воды по таблицам.

4.2.14.    Подготовка к анализу:

а)    при исследовании на этапах очистки и обеззараживания засевают 100,0; 10,0;

1.0    и 0,1 см3 воды;

б)    на выходе в водопроводную сеть и в наиболее характерных ее точках засевают три объема по 100.0 см3, три объема по 10,0 см3 и три объема по 1,0 см3.

4.2.15.    Указанные в п. 4.2.14 объемы воды помешают во флаконы и пробирки с глюкозопептониой или лактозопептонной средой и индикатором, снабженные поплавками или комочками ваты, погруженными на дно сосуда. Посев

100.0    и 10.0 см3 воды проводят во флаконы и пробирки соответственно с 10.0 и 1,0 см3 концентрированной среды; посев 1,0 и 0.1 см3 воды — в пробирки с

10.0    см3 среды нормальной концентрации. Посевы инкубируют 24 ч при (37 ± 0,5) *С. Отсутствие помутнения и образования кислоты и газа во флаконах

881

Страница 16

С. 15 ГОСТ 18963-73

и пробирках позволяет получить отрицательный результат на наличие бактерий группы кишечных палочек п исследованном объеме волы и закончить исслело-вапие через 24 ч.

4.2.16.    Из каждого флакона, где отмечены помутнение, кислота и газ. а также помутнение и кислота при использовании глюкозопептонной среды или помутнение при использовании лактозопептонной среды, высевают петлей штрихами на поверхность среды Эндо, разделенной на 3—4 сектора. Посевной материал следует брать с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. При получении сплошного роста необходимо рассеивать посевной материал на чашку со средой Эндо для выделения изолированных колоний. Чашки помешают крышками вниз в термостат и инк\бируют 16—18 ч при (37 ± 0,5) 'С.

4.2.17.    При отсутствии роста колоний на секторах среды Эндо, а также при наличии пленчатых, губчатых, с неровными краями и поверхностью, плесневых и других нехарактерных для кишечных палочек колоний получают отрицательный результат.

4.2.18.    Если при высеве из флаконов и пробирок, где отмечены помутнение, кислота и газ, на секторах среды Эндо выросли темно-красные с металлическим блеском и без него (лактозоположительные) колонии, то их принадлежность к бактериям группы кишечных палочек подтверждают микроскопированием и постановкой оксидазного теста по п. 3.3.15.1.

Наличие грамотрицательных палочек в мазках и отрицательный оксидазный тест позволяют немедленно лать положительный ответ о наличии бактерий группы кишечных палочек в анализируемом объеме воды. Анализ воды по этапам очистки заканчивают учетом результатов по наличию или отсутствию на подтверждающей среде Эндо темно-красных колоний грамотрипательных палочек, не обладающих оксидазной активностью.

4.2.19.    При анализе питьевой воды учитывают и те секторы, где выросли только розовые и бесцветные колонии, или где темно-красные колонии оказались оксидазоположительными. В этом случае из двух-трех разного типа колоний каждого сектора приготовляют мазки, окрашивают по Граму и микроскоиируют, а также проверяют оксидазную активность по п. 3.3.15.2.

4.2.20.    При наличии только грамположительных спорообразутоших бактерий получают отрицательный результат.

4.2.21.    Наличие активной оксидазы у всех бактерий, высеянных из фчаконов или пробирок, кроме перечисленных в п. 4.2.17. позволяет также получить отрицательный результат. Анализ во всех этих случаях заканчивают через 40—42 ч.

4.2.22.    При росте на секторах оксидазоотрицательных не окрашивающихся по Граму палочек лве-три изолированные колонии разного типа с каждого сектора засеивают в полужидкую среду с глюкозой и инкубируют 4—5 ч при (37 ± 0,5) “С.

При наличии кислоты и газа получают положительный результат. При отсутствии кислоты и газа получают отрицательный результат, анализ заканчивают через 44—48 ч.

При наличии только кислоты пробирки остаатяют на 24 ч для окончательного учета. При отсутствии газообразования через 24 ч получают окончательный отрицательный результат, при наличии газа — положительный результат.

882

Заменяет ГОСТ 5215-50 ГОСТ 5216-50