ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

Издание официальное

Москва

Стандартинформ

2010

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод определения Clostridium perfringens.

Метод основан на выделении С. perfringens из колоний, полученных при глубинном посеве продукта. ею разведения или культуральной жидкости в селективные среды. Принадлежность выделенных колоний к С. perfringens определяют по морфологическим и биохимическим свойствам. В зависимости от 1ребо1«аний нормативно-технической документации подсчитывают количество или учитывают присутствие (отсутствие) С. perfringens в исследуемом продукте.

Метод предназначен для:

установления соответствия микробиологических показателей качества пищевого продукта требованиям нормативно-технической документации;

исследования продукта по санитарно-эпидемиологическим показаниям:

анализа микрофлоры посевов (культуральной жидкости), в которых обнаружены мезофиль-ные анаэробные клостридии, при необходимости подтверждения присутствия в посевах С. perfringens.

I. ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ

1.1.    Отбор проб пищевых продуктов — по ГОСТ 26668, ГОСТ 26809.

1.2.    Подготовка проб пищевых продуктов к анализу но ГОСТ 26669.

Консервы проверяют на герметичность но ГОСТ 8756.18.

Полные консервы, нормальные по внешнему виду, перед испытанием термостатнруют при 30— 37 ^{1 2}С в таре вместимостью до I дм³ включительно не менее5сут, в таре вместимостью свыше I дм³ — нс менее 7 сут.

Пищевые продук ты, в которых нормируется допустимое количество С. perfringens. лермоста гиро-ванию не подлежат.

Масса (объем) навески, предназначенной для приготовления гомогената продукта тын исходного разведении — не менее (10.0±0.1) г (см³).

Исходные разведения продуктов с массовой далей NaCI более 5 % готовят с использованием пептонной воды; исходные разведения мясных, молочных продуктов и молока готовите использованием физиологического раствора. Для приготовления последующих деся тикратных разведений используют пептонно-со1евой раствор. Пептонную воду и пептонно-со.левой раствор готовят по ГОСТ 26669. физиологический раствор — по ГОСТ 10444.1.

Из пробы пищевого продукта, в котором нормируется количество С. perfringens. или его исходного разведения готовят ряд разведений в соответствии с допустимым количеством С. perfringens. указанном в нормативно-технической документации на конкретный вид пищевого продукта. Культуральную жидкость разводят так. чтобы получить при высеве раздельные колонии.

С. 2 ГОСТ 10444.9-88

2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ

2.1.    Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы, реактивы по ГОСТ 10444.1. а также аппаратуру, материалы, реактивы, указанные ниже:

анаэростат или другое оборудование, обеспечивающее анаэробные условия культивирования; весы лабораторные общею назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104³. с наибольшим пределом взвешивания до 200 г и поверочной пеной деления не более 2 мг (для взвешивания реактивов);

весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104³. с наибольшим пределом взвешивания до 200 г и поверочной ценой деления не более 20 мг (для взвешивания продукта);

микроскоп световой биологический с приспособлением для фазовоконтрастного микроскопиро-вания;

стекла покровные по ГОСТ 6672; стекла предметные по ГОСТ 9284:

11етлю бактериологическую;

термостат с диапазоном рабочих температур от 28 до 55 ‘С, позволяющий поддерживать заданную температуру с погрешностью ±1 ’С;

кислоту 5-амино-2-нафтален сульфоновую; галактозу;

квасцы железоаммонийные;

натрий сернисто кислый;

натрий тиосульфит (Na₂S₂0$ безводный);

неомицина сульфат в таблетках по 0.25 г и 0.1 г;

неомицина сульфат во флаконах по 0.5 г (50000 ЕД):

полимиксин В сульфат во флаконах по 25 мг (250000 ЕД) и по 50 мг (500000 ЕД):

полимиксин М сульфат во флаконах по 500000 ЕД;

кислота сульфани; ювая;

циклосерин в таблетках по 0.25 г;

феноловый красный, индикатор;

цинк — порошок по ГОСТ 3640;

цитрат аммонийного железа.

3. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ

3.1.    Приготовление растворов

3.1.1.    Раствор массовой концентрации неомицина сульфата 50 г/дм': во флакон с 0.5 г неомицина сульфата (для инъекций) доливают до 10 см' стерильную дистиллированную воду.

При приготовлении раствора массовой концентрации неомицина сульфата 10 г/дм'из таблеток: 2 таблетки по 0.25 г или 5 таблеток по 0.1 г растирают в ступке, порошок переносят в мерную посуду вместимостью 50 см', смывая диспилированной водой, объем доводят до метки. Раслюр стерилизуют методом мембранной фильтрации по ГОСТ 26670.

3.1.2.    Раствор массовой концентрации полимикс и на В сульфата 2.5 и 5 г/дм³ tun полнмиксина М сульфата 5 г/дм': во флакон с 25 мг или 50 мг полимиксина (дш инъекций) вносят до 10 см' стерильную дистиллированную воду, получая растворы массовых концентраций 2,5 и 5 г/дм³.

3.1.3.    Раствор массовой концентрации циклосерина 40 г/дм³: 4 таблетки циклосерина по 0.25 г растирают в ступке, порошок переносят в мерную посуду вместимостью 25 см³, смывая диспи-лиро ванной водой, объем доводят до метки.

Раствор стерилизуют методом мембранной фильтрации по ГОСТ 26670.

3.2. Приготовление питательных сред

3.2.1. Агар триптозо-сульфит-циклосериновый: основу питательной среды готовят следующим образом: 15,0 г триптозы. 5.0 г ферментативного пептона. 25 см' дрожжевого экстракта. 1.0 г безводного тиосульфита натрия. 1.0 г цитрата аммонийного железа. 20.0 г агара растворяют в 1 дм' кипяшей дистиллированной воды. Устанавливают pH таким образом, чтобы посте стерилизации он составлял при температуре 25 ‘С 7.610,1. Основу среды стерилизуют при температуре (121 ± 1.0) ³С в течение 20 мин и хранят при температуре (4±2) ³С не более 14 сут.

ГОСТ 10444.9-88 С. 3

К 100 см¹ (кноны. расплавленной и охлажденной до 45—55 *С. добавляют непосредственно перед употреблением I см³ раствора массовой концегпрацией циклосерина 40 г/дм³.

Допускается при отсутстнии триптозы заменять ее равным количеством ферментатпнного пептона.

3.2.2.    Агар сульфит-полимиксин-неомииинопый: основу питательной среды готовят следующим образом: 17.0 г ферментативного пептона. 15 см³ дрожжевого экстракта. 5.0 г хлорида натрия. 1.0 1 безводного тиосульфита натрия. 1.0 г цитрата аммонийного железа. 12.0— 15.0 г агара добавляют к I дм³ дистиллированной воды. Смесь, периодически перемешивая, подогревают до кипения и кипятят до полного растворения всех составных частей. Устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он соответствовал при температуре (25± I) ‘С 7.610.1. Стерилизуют при температуре (12111) *С в течение 20 мин. Основу среды хранят при температуре (412)'С неболее 14 сут.

К 1 дм³ основы, расплавленной и охлажденной до 45—55 *С, непосредственно перед употреблением добавляют 1 см³ раствора массовой концентрации неомицина сульфата 50 г/дм³ или 5 см³ раствора массовой концентрации неомицина сульфата 10 г/дм³ (50 мкг/ см³ основы среды) и 8 см³ раствора массовой концешрации полимиксина 2.5 г/дм³ или 4 см³ раствора массовой конценфацией полимиксина 5 г/дм³ (20 мкг/см’ основы среды).

3.2.3.    Среду Вильсон Блера. измененную для анаэробов, готовят по ГОСТ 10444.1.

3.2.4.    Среду для анаэробов готовят по ГОСТ 10444.1.

3.2.5.    Желатин-лактозная среда: 15.0 г триптозы или ферментативного пептона, 50 см³ дрожжевого эксфакта, 120,0 г желатина. 5.0 г двузамешенного фосфорнокислого натрия растворяют в I дм³ кипящей дистиллированной воды. Добавляют 10,0 г лактозы и 5 см' I %-ного раствора индикатора фенолового красного. Устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он соответствовал при температуре (2511) *С 7.410.1. Разливают в пробирки по 10 см³ и стерилизуют при температуре (12111) ’С в течение 15 мин. Хранят при температуре (412) *С не более 21 сут. Перед употреблением среду кипятят в течение 10 мин на водяной бане.

3.2.6.    Среда для изучения редукции жиратов и подвижности бактерий: 5,0 г галактозы. 5.0 г глицерина. 1.0 г нитрата калия (не содержащего нитрит). 2.5 г двузамешенного фосфорнокислого нафия (безводного), 3.0 г агара растворяют в 1 дм³ кипящего мясо-пептон нога бульона. Устанавливают pH раствора таким образом, чтобы после стерилизации он соответствовал при температуре (2511) ‘С

7.310.1. Разливают в пробирки но 10 см³ и стерилизуют при температуре (12111) *С в течение 20 мин. В готовой питательной среде контролируют по ГОСТ 10444.8 отсутствие нитритов.

Хранят при температуре (412) *С не более 28 сут. Перед употреблением среду кипятят в течение 10 мин в кипящей водяной бане и быстро охлаждают до комнатной температуры. Среда должна иметь студнеобразную консистенцию.

3.2.7.    Среду Роберта готовят по ГОСТ 10444.1.

3.2.8.    Молоко лакмусовое готовят по ГОСТ 10444.1.

3.2.9.    Сахарный кровяной агар по Цейсслеру с антибиотиками: к 100 см³ сахарного кровяного агара по Цейсслеру. приготовленного по ГОСТ 10444.1, перед розливом по чашкам Петри добавляют I см³ раствора массовой концентрации цнклосернна 40 г/дм³ или 0.5 см³ раствора массовой конценфа-цией неомицина сульфата 10 г/дм³.

Хранят при температуре (412) *С не более 3 сут.

4. ПРОВЕЛЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ

4.1.    Выявление характерных колоний.

4.1.1.    Для проведения испытания отбирают объем (110.1) см³ подготовленной пробы продукта, его разведения или разведения культуральной жидкости.

Допускается для получения раздельных колоний проводить посев культуральной жидкости петлей (штрихом) на поверхность питательной среды.

4.1.2.    Подготовленную пробу продукта, его разведения или разведения культуральной жидкости высевают глубинным методом по ГОСТ 26670 параллельно в две чашки Петри. Посевы заливают триптоэо-сульфит-циклосериновым или сульфит-полимнксин-неомициновым агаром, или сахарным кровяным агаром по Цейсслеру. или агаром Вильсон-Блера. Содержимое чашек Петри бысфо, осторожными круговыми движениями перемешивают. Посте застывания среды чашки подсушивают и заливают той же средой гак. чтобы высота второго слоя питательной среды была нс менее 4 мм.

4.1.3.    Посевы на чашках Петри термостатируют при температуре (37±1) ‘С в течение 18—24 ч в анаэростатах с разряжением 0.6—0.8 атм |(0,4—0.6) • 10* Па| или в анаэробных условиях. указанных в ГОСТ 30425.

4.1.4.    После окончания термостатаровання отбирают те чашки, на которых выросло от 15 до 150 характерных колоний. Подсчитьпыют количество выросших характерных колоний. Характеристика колоний С. perfringens на селективных питательных средах приведена в приложении.

Корректировку подсчета количества С. perfringens проводят посте изучения морфологических и биохимических особенностей микроорганизмов из колоний, характерных для С. perfringens.

4.2. Подтверждение принадлежности характерных катоний к С. perfringens.

4.2.1.    Для подтверждения принадлежности обнаруженных каюний к С. perfringens отбирают про-извольно не менее пята, характерных для С. perfringens. катоний и пересевают их в жидкую (вязкую) среду для мезофильных анаэробных микроорганизмов (см. и. 3.2.4).

Жидкие (вязкие) среды подготавливают к анализу но ГОСТ 30425.

Посевы термостатаруют при температуре (37± 1) ‘С в течение 18—24 ч. Культуральную жидкость испальзуют для изучения морфологических и биохимических свойств микроорганизмов.

4.2.2.    Если катонии в посевах на чашках Петри растут в виде ковра тын среди обнаруженных колоний много нетипичных дш С. perfringens. то мазок из ковра или кажущиеся характерные колонии пересевают, как указано в п. 4.2.1. в питательные жидкие (вязкие) среды для мезофильных анаэробов и термостатируют при температуре (37± I) *С в течение 18—24 ч. полученную культуральную жидкость вновь высевают на чашки Петри (см. 4.1.2) так, чтобы получить раздельные катонии. предназначенные для определения культуральных, морфологических и биохимических свойств микроорганизмов, предположительно относящихся к С. perfringens. Питательные среды, используемые для вторичного посев;! на чашки Петри, не должны содержать циклосерина. Вторичные посевы термостатируют. как указано в п. 4.1.3.

4.2.3.    Из посевов (см. пи. 4.2.1, 4.2.2) готовят препараты, окрашивают их по Граму по ГОСТ 30425 и ми крое кот тируют. С. perfringens представляет собой фам положительные палатки размером 0.9— 1.3x3.0—9.0 мкм. плохо или необразующие в посевах споры. Палочки с закругленными концами располагаются в одиночку, попарно, в виде цепочек штакетообразных скоплений.

В спороносных палочках спора расположена субгерминально. В посевах устанавливают отсутствие каталазы по ГОСТ 30425.

4.2.4.    Культуры, указанные в пп. 4.2.1. 4.2.2. высевают в пробирки с лакмусовым молоком. Посевы инкубируют при температуре (37±1) *С в течение 8—12 ч.

С. perfringens вызывает бурную ферментацию лактозы с образованием газа, редукцию лакмуса, коагуляцию молока с последующим ст о свертыванием и образованием тубчатого сгустка красноватосиреневого цвета в верхней части пробирки и просветлением сыворотки.

При инкубации посевов при температуре (45±1) 'С характерную реакцию ферментации молока С. perfringens вызывают уже через 3—5 ч.

4.2.5.    Исследуемую культуру высевают бактериологической петлей указом в полужидкую питательную среду для изучения подвижности и редукции нитратов. Посев термосгатаруюг при температуре (37± 1) ‘С в течение 24 ч. С. perfringens неподвижен, он растет но ходу линии посева, не вызывая помутнения всей среды. После учета подвижности в эту же пробирку вносят реактив на нитриты. Редукцию нитратов оценивают по ГОСТ 10444.8. Культуры, которые показывают слабую реакцию на нитриты (т. е. розовый цвет), не учитывают, так как С. perfringens стойко дает сильную и немедленную реакцию (красный цвет).

4.2.6.    Исследуемую культуру высевают бактериологической петлей указом в питательную среду (см. п. 3.2.5) дш определения способности к ферментации лактозы и разжижению желатина. Посев термостатируют при температуре (37± 1) *С в течение 18—24 ч. О ферментации лактозы свидетельствует желтое окрашивание среды и выделение пузырьков газ;! в толще среды. После учета фермен-тации лактозы пробирки с посевом выдерживают при температуре (4±2) *С в течение 1 ч. Если среда вновь не застыла, то это свидетельствует о гидролизе желатина. При сохранении вязкости среды пробирку со средой вновь помешают в термостат с температурой (37± I) *С на 24 ч. охлаждают при температуре (4±2) *С и дают окончательную оценку способности выделенной культуры к та драл и зу желатина.

С. perfringens ферментирует лактозу и. как правило, разжижает желатин.

ГОСТ 10444.9-88 С. 5

4.2.7. Подвижность, редукцию нитратов, разжижение желатина допускается определять путем посева 6—8-часовой культуры, как указано в п. 4.2.1 или 4.2.2 на среду Роберта. Среду непосредственно перед использованием прогревают 20 мин на кипящей водяной бане, охлаждают до застывания в холодильнике. В подготовленную среду посев проводят уколом. Посевы инкубируют при температуре (37±1) *С в течение 24 ч, после этого посевы помещают на 20 мин в холодильник.

С. perfringens на среде Роберта образует прямую (вследствие неподвижности клеток) красную (вследствие редукции нитратов и появлению нитритов) линию, превращая среду в желеобразное состояние и не затвердевающую при температуе 2—4 *С в холодильнике (вследствие разжижения желатина).

5. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1.    Результаты испытания продукта оценивают по каждой пробе отдельно.

5.2.    Если при изучении культуральных, морфологических и биохимических свойств микроорганизмов. выделенных из колоний, обнаружены неподвижные, грамположнтельные. каталазоотрицательные. редуцирующие нитраты, ферментирующие лактозу, разжижающие желатин и дающие характерный рост в лакмусовом молоке палочки, то дают заключение о том. что обнаруженные микроорщ-низмм относятся к С. perfringens.

5.3.    При необходимости подсчета С. perfringens если в 80 % случаев, т. е. не менее чем в четырех из пяти колоний, подтвержден рост С. perfringens. то считают, что все характерные колонии, выросшие в чашке, принадлежат к С. perfringens. В остальных случаях количество С. perfringens определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для изучения мор<|юлогических и биохимических свойств.

5.4.    Результаты испытаний пересчитывают на 1 г или I ехг’ продукта и записывают в соответствии с требованиями ГОСТ 26670.

Если на чашках Петри обнаружено более 150 колоний С. perfringens. допускается выражать результаты следующим образом: количество С. perfringens в 1 г или в 1 см³ более 1.5 • 10^я    .

где л — используемое разведение испытуемого продукта.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Справочное

ХАРАКТЕРИСТИКА КОЛОНИЙ С. PERFRINGENS НА СЕЛЕКТИВНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ

Наиииис питательной среды Характеристика колоний 1.    Агар гриптозо-сульфит-циклоссриновый или агар сульфмг-полимиксин-нсомициновый. или Вильсон— Блсра 2.    Сахарный кровяной агар по Нсйсслсру с антибиотиками Колонии черного цвета различной интенсивности окраски, имеющие форму двояковыпуклой линзы, комочка ваты или «самолетика» Колонии зеленеющие на воздухе окружены олной или двумя зонами гемолиза. Одна полупрозрачная зона гемолиза обусловлена действием лецитиназы. При образовании двух зон гемолиза внутренняя прозрачная зона обусловлена действием гемолизинов, а наружная — действием лецитиназы

279

1

Издание официальное    Перепечатка    воспрещена

2

© Издательство стандартов. 1988 © СТАНДАРТИНФОРМ. 2010

3

С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001. На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008.

276