ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

СОКИ ФРУКТОВЫЕ И ОВОЩНЫЕ

Метод определения содержания общих каротиноидов и их фракционного состава

Издание официальное

ГОССТАНДАРТ РОССИИ Москва

Предисловие

1    РАЗРАБОТАН Всероссийским научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильней промышленности (ВНИИКОП)

ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 93 «Продукты переработки плодов и овощей»

2    ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 22 декабря 1999 г. № 598-ст

3    Стандарт гармонизирован с европейским стандартом ЕН 12136:1997 «Соки фруктовые и овощные. Определение содержания общих каротиноидов и их фракционного состава*

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

© ИПК Издательство стандартов.2000

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Госстандарта России

II

Содержание

1    Область применения........................................

2    Нормативные ссылки.......................................

3    Определения и обозначения..................................

4    Сущность метода...........................................

5    Средства измерений, лабораторное оборудование, реактивы и материалы

6    Отбор и подготовка проб.....................................

7    Подготовка к проведению испытаний...........................

8    Проведение испытаний......................................

9    Обработка и оформление результатов...........................

Приложение А Библиография..................................

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

СОКИ ФРУКТОВЫЕ И ОВОЩНЫЕ

Метол опрсле.чения содержания общих каротиноилов и их фракционною состава

Fruit and vegetable juices.

Method for determination of total carotinoid content and content of individual carotinoid fractions

Дата введения 2001-01-01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на фруктовые н овощные соки и подобные им продукты и устанавливает метод определения массовой концентрации или массовой доли общих каротиноидов и их фракционного состава.

Диапазон определения массовой концентрации каротиноидов — от I до 60 мг/дм\ массовой доли — от I до 60 мг/кг, массовых долей отдельных фракций каротиноидов — от 3 до 60 % содержания общих каротиноидов.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия

ГОСТ 2603-79 Ацетон. Технические условия

ГОСТ 4166-76 Натрий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4174-77 Цинк сернокислый 7-водный. Технические условия

ГОСТ 4207-75 Калий железистосинеродистый 3-водный. Технические условия

ГОСТ 5789-78 Толуол. Технические условия

ГОСТ 24104-88 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26313-84 Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора

проб

ГОСТ 26671-85 Продукты переработки плодов и овощей, консервы мясные и мясорастительные. Подготовка проб для лабораторных анализов

ГОСТ 29169-91 (ИСО 648—77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть I. Общие требования

ГОСТ Р 51431-99 Соки фруктовые и овощные. Метод определения относительной плотности ИСО 3696—87* Вода для лабораторного анализа. Технические условия и методы испытаний

• Действует до введения в действие ГОСТ Р. разработанного на основе стандарта ИСО.

Издание официальное

3    Определения и обозначения

3.1    Определения

В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями:

3.1.1    фракция I каротиноидов (в основном углеводороды): Вещества, элюируемые петролейным эфиром, как описано в 8.3.

3.1.2    фракция II каротиноидов (эфиры кри1ггоксантна): Вещества, элюируемые смесью А, как описано в 8.3.

3.1.3    фракция III каротиноидов (эфиры ксантофилла): Вещества, элюируемые смесью Б. как описано в 8.3.

3.1.4    фракция IV каротиноидов: Вещества, элюируемые ацетоном, как описано в 8.3.

3.2 Обозначения

В настоящем стандарте используют следующее обозначение:

g — ускорение силы тяжести.

4    Сущность метода

Метод основан на количественном адсорбционном осаждении каротиноидов цинком гсксано-ферратом (II) при обработке растворами Карреза I и Карре за II, экстракции каротиноидов из осадка ацетоном и переэкстракции их петролейным эфиром с последующим спсктрофотомстричсскнм определением содержания общих каротиноидов (в пересчете на Р-каротин). Спсктрофотомстрнчсс-кое определение относительного содержания отдельных фракций каротиноидов осуществляется после их разделения с помощью хроматографической колонки с оксидом алюминия.

5    Средства измерений, лабораторное оборудование, реактивы и материалы

Спектрофотометр с диапазоном измерения, позволяющим проводить исследования при длине волны 450 нм, с допустимой абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1 %: кюветы стеклянные или кварцевые, нс имеющие существенного поглощения при длине волны 450 нм. рабочей длиной 10 мм.

Центрифуга, обеспечивающая ускорение 2000 g на дне центрифужной пробирки.

Примечание — Скорость крашения ротора центрифуги п, мин^-1, необходимую дзя создания требуемого ускорения, рассчитывают по формуле

(D

где /" — фактор разделения (отношение создаваемого центрифугой ускорения к ускорению силы тяжести g): g — ускорение силы тяжести, м/сек² (£ = 9.81 м/сек²):

г — радиус центрифуги, измеряемый от средней точки (оси центрифуги) до дна центрифужной пробирки. когда пробирка при вращении находится в горизонтальном положении, см.

Центрифужные пробирки вместимостью от 60 до 100 см³.

Хроматографическая колонка длиной от 250 до 300 мм внутренним диаметром 20 мм, снабженная запорным краном из полиэтнлснтетрафталата (ПЭТФ).

Ротационный вакуумный испаритель.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ: поскольку анализ предусматривает использование летучих пожароопасных растворителей, применяемая электрическая аппаратура должна отвечать установленным нормам, связанным с опасностью использования таких растворителей.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г 2-го класса точности.

Колбы мерные по ГОСТ 1770 вместимостью 50 и 100 см³.

Цилиндры мерные по ГОСТ 1770 исполнения 2 вместимостью от 10 до 250 см³.

Воронка делительная по ГОСТ 25336 вместимостью 250 см³.

Пипетки по ГОСТ 29227 вместимостью от I до 25 см³.

Пипетки по ГОСТ 29169 вместимостью от 5 до 50 см³.

Колба круглодонная по ГОСТ 25336 типа К вместимостью 250 см³.

Колба коническая по ГОСТ 25336 типа Кн исполнения I вместимостью 250 см³.

Калий железистосинеродистый 3-водный |K₄Fe(CN)₆ ЗН₂0) по ГОСТ 4207, ч. д. а. Раствор Карреза I: 15 г казня гексацианоферрата (II) растворяют в воде и доводят водой до 100 см³.

ГОСТ Р 51443-99

Цинк сернокислый 7-водный (ZnS0₄-7H₂0) по ГОСТ 4174. ч. д. а. Раствор Карреза II: 30 г 7-водного сульфата цинка растворяют в воде и доводят водой до 100 см⁵.

Натрий сернокислый безводный (Na>S0₄) по ГОСТ 4166, ч. д. а.

Ацетон (СН₃СОСН₃) по ГОСТ 2603. ч. д. а.

Толуол (C₆H₅CH₃) по ГОСТ 5789. ч. д. а.

Пстролейный эфир с температурой кипения от 40 до 60 °С, очищенный на колонке, заполненной оксидом алюминия AUO,.

Оксид алюминия (А1_:0₃) нейтральный, активированный. 1-й степени активности, для колоночной хроматографии и адсорбционного фильтрования, ч. д. а. |1).

Вода для лабораторного анализа по ИСО 3696 не ниже 3-й категории.

Допускается использование других средств измерений, лабораторного оборудования, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками нс ниже указанных.

6    Отбор и подготовка проб

6.1    Отбор проб - по ГОСТ 26313.

6.2    Подготовка проб — по ГОСТ 26671.

Концентрированные продукты разводят водой до заданного значения относительной плотности в соответствии с нормативным или техническим документом на конкретный вид продукта. Определяют относительную плотность разбаатенного продукта по ГОСТ Р 51431 и ее значение указывают в протоколе.

7    Подготовка к проведению испытаний

7.1    Приготовление смесей эдиктов

Смесь А готовят смешиванием четырех объемов петролейного эфира с одним объемом толуола.

Смесь Б готовят смешиванием двух объемом петролейного эфира с одним объемом толуола.

7.2    Приготовление частично деактивированного оксида алюминия

100 г активированного оксида алюминия помешают в колбу с притертой пробкой, добаатяют 12 см³ воды и тщательно встряхивают до тех пор. пока нс будет получена тонкая однородная смесь. Колбу плотно закрывают пробкой и остаатяют на 2 ч.

Деактивированный оксид алюминия имеет степень активности IV V уровня. Поскольку степень активности изменяется при длительном хранении, требуемые катичсства должны быть использованы в течение 2—24 ч с момента приготовления.

8    Проведение испытаний

8.1    Условия проведения испытаний

Каротиноиды чувствительны к свету и теплу, поэтому анализы должны проводиться в месте, защищенном от прямого солнечного света и ультрафиолетового излучения.

8.2    Определение содержания общих каротиноидов

Проводят да) параллельных определения.

Взятую с помощью пипетки пробу исследуемого продукта объемом от 5 до 50 см³ (К,) или навеску продукта массой от 5 до 50 г (/я). хорошо перемешанную, переносят в центрифужную пробирку, разбаатяют, если это необходимо, водой до 50 см³, добаатяют no I см³ раствора Карреза I и раствора Карреза II. каждый раз тщательно перемешиатя содержимое, и выдержиапот примерно 2 мин, после чего центрифугируют при ускорении 2000 £ в течение приблизительно 5 мин.

Примечание — Оптическая плотность конечного экстракта, объем которого доводят до 100 см³, нс должна превышать 0.5 единиц. Чтобы достигнуть этого, необходимо предварительно отрегулировать объем отбираемой для анализа пробы продукта. В качестве отправной точки можно указать следующие объемы пробы: 25 см³ — для апельсинового сока. 50 см³ — для апельсинового нектара, от 5 до 20 см³ — для сока из плодов пассифлоры. 25 см³ — для нектара из плодов пассифлоры. 20 см³ — для мандаринового сока.

Почти бесцветный надосадочный раствор декантируют и отбрасывают.

К осадку в центрифужной пробирке добавляют 40 см³ ацетона, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и продолжают перемешивание примерно 3 мин. Смесь центрифугируют примерно 5 мин и декантируют желтый надосадочный слой ацетона в делительную воронку.

Повторяют экстрактно из осадка в центрифужной пробирке с помощью новой порции ацетона объемом 20 см³ и повторяют все прежние операции, собирая после центрифугирования надосадоч-ный органический экстракт в делительную воронку. Обычно оказывается достаточным однократное

повторение процесса экстракции. Если необходимо, экстракция может быть повторена большее число раз.

Примечание — Если приходится проводить экстракцию больше чем в два этапа, следует остерегаться образовании эмульсин. Если имеется опасность неполной экстракции, рекомендуется начать процедуру с самого начала, используя меньший объем или массу исследуемой порции продукта.

С помощью мерного цилиндра в делительную воронку вносят 50 см³ петролейного эфира. Воронку с содержимым интенсивно встряхивают и дают возможность смеси отстояться в течение небольшого промежутка времени, чтобы отделить органическую фазу.

Водную фазу объемом примерно 10 см ' отбрасывают.

Органическую фазу промывают 50 см³ воды, осторожно взбалтывая экстракт. Как только исчезнет слабое эмульгирование, которое может образоваться во время взбалтывания, отбрасывают водную фазу.

Переносят органическую фазу в центрифужную пробирку, содержащую 2 г безводного сульфата натрия, используемого в качестве обезвоживающего агента. Смесь хорошо перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют. Фазу петролейного эфира аккуратно сливают в мерную колбу вместимостью 100 см³.

Осадок в центрифужной пробирке суспензируют в свежей порции петролейного эфира объемом 30 см³, перемешивая стеклянной палочкой, и снова центрифугируют. Добаатяют полученную сла-боокрашенную фракцию петролейного эфира к первой порции экстракта и доводят петролейным эфиром объем до 100 см³ ( Г₂).

Измеряют оптическую плотность полученного раствора при длине волны 450 нм в кювете с оптическим промежутком 10 мм; в качестве раствора сравнения используют петролейный эфир.

8.3 Определение содержания отдельных фракций каротиноидов

Суспензируют от 28 до 30 г частично деактивированной окиси алюминия (по 7.2) примерно в 30 см³ петролейного эфира и помещают суспензию в хроматографическую колонку, предатрительно закупоренную небольшим тампоном из стеклянной ваты и частично заполненную петролейным эфиром. Петролейный эфир спускают до тех пор. пока уровень его нс установится непосредственно над поверхностью слоя окиси алюминия. Для того чтобы защитить заполнитель колонки от образования в нем пузырьков, принимают меры к тому, чтобы температуры петролейного эфира и окиси алюминия значительно не различались между собой. Высота слоя, заполняющего колонку, должна быть примерно 8 см.

Экстракты общих каротиноидов в петролейном эфире, полученные по 8.2, количественно переносят в круглодонную колбу вместимостью 250 см³ и удаляют растворитель при температуре примерно 40 *С под вакуумом, используя ротационный испаритель. Полученный остаток тотчас же растворяют в нескольких кубических сантиметрах петролейного эфира и с помощью пипетки количественно переносят в хроматографическую колонку. Чтобы гарантировать отсутствие потерь исследуемых веществ, круглодонную колбу ополаскивают небольшими порциями растворителя, используя его примерно 10 см³.

Примечание — При внесении исследуемого раствора в колонку следует избегать какого-либо возмущения слоя оксида алюминия; уровень исследуемого раствора должен достигать поверхности адсорбента без всплеска, благодаря внесению растворителя небольшими порциями.

Элюируют отдельные фракции каротиноидов при скорости примерно 2 капли в секунду, используя:

петролейный эфир для фракции I;

элюирующую смесь А для фракции II;

элюирующую смесь Б для фракции III.

С целью уменьшения общего объема элюата первые бесцветные порции стекающего раствора отбрасывают. Чтобы гарант и ровать полное извлечение каждой из фракций, проводят элюирование до тех нор. пока элюат не становится бесцветным.

Поскольку содержание отдельных фракций каротиноидов завнс!гт от вида фруктов и напитков, не представляется возможным указать определенные требуемые объемы элюентов. Однако практика показывает, что при определении фракций 1нП требуется примерно 50см³ элюента в каждом случае. При высоком уровне содержания фракции II достаточно 100 см' элюента. для фракции III обычно достаточно от 80 до 100 см³. Объем элюатов доводят петролейным эфиром и отмечают значение объема V₂ для каждой из фракций.

Измеряют оптическую плотность растворов для каждой из фракций против холостого раствора — петролейного эфира, при длине волны 450 нм, используя кюветы с 10 мм оптическим промежутком.

ГОСТ Р 51443-99

Примечание — Использование толуола в различных пропорциях нс оказывает влияния на коэффициент поглощении.

Остаток каротиноидов в хрома юфафической колонке может быть элюирован ацетоном как фракции IV.

Сумма фракций каротиноидов, элюированных из колонки, как правило, должна соста&тять нс менее 90 % от содержании общих каротиноидов. Если это число оказывается значительно меньше, то из этого следует, например, что в образен мог быть добавлен биксин. Эго осадок красно-желтого цвета в хроматографической колонке после элюировании фракции IV.

Примечание — Биксин может быть элюирован смесью, состоящей из четырех частей ацетона и одной части аммиака (по объему). Его присутствие может быть подтверждено другими хроматографическими методами.

9 Обработка и оформление результатов

Массовую концентрацию общих каротиноидов pfC^Hj*). мг/дм\ и их отдельных фракций, выраженную через p-каротин, вычисляют по формуле

р(С₄оН₅₆)-Л 4.00 -1.    (2)

где А — оптическая плотность раствора экстрагированных веществ;

4.00 — показатель, равный отношению массовой концентрации (в миллиграммах на кубический дециметр) раствора Р-каротина в петролейном эфире к его оптической плотности при длине волны 450 нм и длине оптического пути 10 мм.

Примечание — Поскольку промышленно выпускаемый р-каротин может быть разного качества, количество отдельных каротиноидов нс может быть оценено с помощью калибровочной кривой, но может быть определено через средний коэффициент поглощения для |)-каротина, найденный в результате кругового эксперимента.

У₂ — объем экстракта в петролейном эфире (100 см³, по 8.2) или объем рахличных элюатов (по 8.3), см³;

У, — объем исследуемой пробы продукта (от 5 до 50 см³, по 8.2). см³.

Массовую долю p-каротнна р^С^Н*), мг/кг, вычисляют по формуле

Р|<С₄оН₅₆)=Л 4,00    (3)

где т — масса навески, г.

Аналогично определяют содержания отдельных фракций каротиноидов и выражают их в процентах от содержания общих каротиноидов.

Относительное расхождение между результатами двух определений, полученными при анализе одной и той же пробы продукта одним оператором с использованием одного и того же оборудования за возможно минимальный интервал времени, не должно превышать норматива оперативного контроля сходимости г. % (при />- 0,95):

для содержания общих каротиноидов — 10. для фракции I — 20. для фракции 11 — 12, для фракции III — 17.

При соблюдении этого условия за окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений, указываемое с точностью до двух значащих цифр.

Относительное расхождение между результатами определений, полученными для одной и той же пробы продукта в двух различных лабораториях, не должно превышать норматив;! оперативного контроля воспроизводимости R. % (при Р^ш 0.95): для содержания общих каротиноидов — 23, для фракции I — 50, для фракции 11 — 30, для фракции 111 — 35.

5

Пределы относительной погрешности определения при соблюдении условии, регламентируемых настоящим стандартом, не превышают. % (при Р^ш 0.95):

для содержания общих каротиноидов ±16.

для фракции I ±35,

для фракции II ±21.

для фракции III ±25.

В протоколе испытаний указывают:

-    информацию, необходимую для идентификации исследуемого продукта (вид продукта, происхождение. шифр);

-    ссылку на настоящий стандарт;

-    дату и способ отбора проб (по возможности);

-    дату получения пробы для испытаний:

-    дату проведения испытаний;

-    результат испытаний с указанием погрешности и единицы измерения;

-    соблюдение норматива контроля сходимости результатов;

-    особенности проведения испытаний (разведение концентрированной пробы, относительную плотность разведенной пробы и пр.);

-    отклонения условий проведения испытаний от описанных в стандарте, которые могли по-алнить на результат.

ПРИЛОЖЕНИЕ А (справочное)

Библиография

111 Т>' 6-09-3916—75 Алюминия оксид 1-й степени активности для хроматографии

УДК 664.863.001.4:006.354    ОКС    67.160.20    Н59    ОКСТУ    9109

Ключевые слова: фруктовые и овощные соки, определение содержания, общие каротиноиды, фракции общих каротиноидов, метод анализа

Редактор Л. Н. Нахимова Технический редактор Н.С. Гришанова Корректор В.Н.Варенцова Компьютерная верстка А Н. Заютарсяой

Итд. лиц. № 021007 от 10.08.95. Сдано в набор 22.02.2000. Подписано в печать 12.04.2000. Усл.печл. 0,93. Уч.-имл. 0,90.

Тираж 419 жх С 4859. Зак. 322.

ИПК Издательство стандартов, 107076, Москва. Колодеишй пер., 14 Набрано в Издательстве на ПЭВМ Филиал ИПК Издательство стандартов — тип. “Московский печатник”, 103062, Москва. Лялин пер., 6

Плр № 080102