ПРЕМИКСЫ

Методы определения витаминов A, D, Е

Издание официальное

ГОССТАНДАРТ РОССИИ Москва

Электронная версия

Предисловие

1    РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН МТК 4, АООТ «Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности» (АООТ «ВНИИКП»)

2    ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 29 июля 1996 г. № 487

3    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

4    ПЕРЕИЗДАНИЕ

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Госстандарта России

II    148

ГОСТ Р 50928-96

После этого меняют светофильтр, устанавливая рабочую длину волны 254 нм, и при этих условиях снимают хроматограммы для растворов анализируемой пробы и стандарта витамина D, приложение Б, рисунок Б.2.

Высоты пиков, соответствующие времени удерживания витаминов A, D, Е, измеряют металлической линейкой, как расстояние от вершины пика до линии, проведенной в основании пика. Значения высот пиков (в миллиметрах) используют для вычисления содержания витаминов A, D, Е в анализируемом образце.

4.4 Обработка результатов контроля Содержание витамина А Х_х, МЕ/г, рассчитывают по формуле

_{х =} QaKKSKK ¹ K-KZ    ’

содержание витамина А в стандартном растворе, ME;

объем стандартного раствора витамина А, взятый на омыление, см³;

объем мерной колбы с исходным стандартным раствором витамина А, см³;

объемы загрузки в колонку растворов пробы и стандарта, полученные после омыления,

мкдм³;

объемы экстрактов пробы и стандарта после проведения подготовительных операций (омыление и т.д.), см³;

высота пика витамина А на хроматограмме премикса, мм; высота пика на хроматограмме для стандарта витамина А, мм; масса навески премикса, г.

п . V' ■ V " ■ V^ст • V ■ h

У _ Уд ^гп % "заг ^ух "ж

^л 2 -    у '■ V’ ■ V ^х ■ V ■ h а    ’

' к ' к ^у заг ^у ст ™ст ^и

где Од — содержание витамина D₂ в стандартном препарате, ME;

V_n' — объем стандартного раствора витамина D₂, взятый для последующего разбавления, см³; V_K' — объем колбы со стандартным раствором витамина D₂, см³;

V_n" — объем стандартного раствора витамина D₂, взятый на омыление, см³;

V_K" — объем колбы со стандартным раствором витамина D₂ после первого разведения, см³; К/'¹, К_ш'_г — объемы загрузки в колонку омыленных растворов стандарта и пробы, мкдм³;

V_x, V_CT— окончательные объемы растворов пробы и стандарта, подготовленные для хроматографии, см³;

/г_ст, h_x — соответствующие высоты пиков витамина D₂ на хроматограммах стандарта и премикса, мм;

а — масса навески премикса, г.

Примечание — При обогащении премиксов витамином D3 в числитель формулы следует вводить коэффициент 0,97 (отношение коэффициентов экстинций витамина D₂ к D3).

Содержание витамина Е A3, мкг/г, рассчитывают по формуле

у ₌ Q

³ к • ^ ■ Кг К ■« ’

где Q_e — масса навески а-токоферола-стандарта, мкг;

V_n — объем стандартного раствора витамина Е, взятый на омыление, см³;

V_K — объем мерной колбы со стандартным раствором витамина Е, см³;

Kar > KK ~ объемы загрузки растворов пробы и стандарта в хроматографическую колонку, мкдм³; V_x, V_CT — окончательные объемы растворов пробы и стандарта, подготовленные для хроматографии, см³;

157

Электронная версия

h_x, h_CT — высоты пиков витамина Е на хроматограммах стандарта и премикса, мм; а — масса навески премикса, г.

Результат контроля вычисляют с точностью до первого десятичного знака и округляют до целого числа.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое значение двух или более параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности Р = 0,95 не должны превышать 10% относительно среднего арифметического значения.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности Р = 0,95 не должно превышать 20% по отношению к среднему арифметическому значению результатов измерений.

158

ПРИЛОЖЕНИЕ В (справочное)

Библиография

[1]    ТУ 25—05.2830—83 Жидкостный хроматограф «Милихром»

[2]    ТУ 6.09—402—87 2-пропанол (изопропиловый спирт химически чистый)

[3]    ТУ    6—09—6628—70 Пропиловый спирт (пропанол-1)

[4]    ТУ    6—09—06—1092—83 Ацетонитрил. Технические условия

[5]    ТУ    2.833.104—85 Микрошприцы

[6]    ТУ    84—11—99—89 Этиловый абсолютированный спирт

[7]    ТУ    6—09—3375—78 Гексан

[8]    ТУ    6—09—3916—85 Окись алюминия для хроматографии

[9]    ТУ 6—09—1181—89 Бумага индикаторная универсальная для определения pH 1—10 и 7—14

[10]    ТУ 6—09—1678—86 Фильтры обеззоленные (белая, красная, синяя ленты)

[11]    ГФ    СССР—X ст. 579 Раствор ретинола ацетата 3,44; 6,88 или 8,60%    в    масле

[12]    ГФ    СССР—X ст. 695 Токоферола ацетат (витамина Е ацетат)

[13]    ГФ    СССР—X ст. 627 Эргокальциферол кристаллический (витамин    D2)

ОКС 65.120.19    С19    ОКП    92    9600

Ключевые слова: стандарт, метод, хроматография, премикс, витамин, хроматограмма

160

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРЕМИКСЫ Методы определения витаминов A, D, Е

Premixes.

Methods for determination of vitamins A, D, E

Дата введения 1997—01—01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на премиксы и устанавливает хроматографические методы определения витаминов A, D, Ев премиксах с различными наполнителями из одной навески.

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия

ГОСТ 4166-76 Натрий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 5962-67 Спирт этиловый ректификованный. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9412-93 Марля медицинская. Технические условия

ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия ГОСТ 19627-74 Гидрохинон (парадиоксибензол). Технические условия ГОСТ 24104-88 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия

ГОСТ 24363-80 Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26573.0-85 Премиксы. Технические условия

ГОСТ 29169-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой ГОСТ 29227-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

3    Определение витаминов А, Б обращение-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографией

Сущность метода заключается в экстракции витаминов А (ретинола ацетат) Е (а-токоферола ацетат) из премикса изопропиловым спиртом и последующем анализе содержания витаминов с использованием жидкостного хроматографа «Милихром».

Издание официальное

Электронная версия

3.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Хроматограф жидкостный микроколоночный «Милихром» по нормативному документу [1] или его последующие модификации со спектрофотометрическим детектором и спектральным диапазоном 190—360 нм.

Спектрофотометр со спектральным диапазоном работы 186—1100 нм.

Колонка хроматографическая одного из указанных размеров: 2x64, 2x80, 2x120 мм с числом теоретических тарелок не менее 4 тыс., заполненная одним из следующих сорбентов: Силасорб С 18, Силасорб РНС 18, Сепарон С 18.

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Насос водоструйный по ГОСТ 25336.

Баня водяная с терморегулятором.

Колбы конические со шлифом вместимостью 25, 50 см³, КН-2-25-18МХС по ГОСТ 25336.

Пипетки 1-1-(1, 2)-1 по ГОСТ 29169.

Пипетки 1-1-1 (2)-1(10) по ГОСТ 29227.

Цилиндры 1(2, 3, 4)-100, 1(2, 3, 4)-500 по ГОСТ 1770.

Колбы мерные 2-25-1(2) (исполнения 2, вместимостью 25 см³, 1-го или 2-го класса точности) по ГОСТ 1770.

Колбы мерные 2-50-1(2) по ГОСТ 1770.

Воронка ВФО-40-ПОР 16 ХС по ГОСТ 25336.

Холодильник ХПТ-1-100-18 ХС по ГОСТ 25336.

Ретинол ацетат по нормативному документу [11].

Витамин Е-ацетат по нормативному документу [12].

Спирт изопропиловый (пропанол-2), х. ч. по нормативному документу [2].

Спирт пропиловый (пропанол-1), х. ч. по нормативному документу [3].

Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, х. ч. по нормативному документу [4].

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.

3.2 Порядок подготовки к проведению контроля

3.2.1    Отбор проб - по ГОСТ 13496.0

3.2.2    Приготовление элюента для хроматографии

Трехкомпонентный элюент готовят смешиванием ацетонитрила, пропилового спирта и дистиллированной воды в объемном соотношении 42:50:8. Для этого в склянку вместимостью 1000 см³ вносят цилиндром 500 см³ пропилового спирта, 420 см³ ацетонитрила и 80 см³ дистиллированной воды.

Приготовленную смесь растворителей фильтруют через стеклянный фильтр и помещают в стеклянный сосуд с притертой пробкой. Полученный раствор можно хранить в течение 1 мес.

3.2.3    Подготовка хроматографической колонки

При использовании новой колонки или колонки после длительного перерыва в работе из нее следует удалить воздух и тщательно промыть элюентом до получения стабильной нулевой линии. Для этого через колонку пропускают элюент в количестве 20—30 свободных объемов колонки, т.е. два полных шприца насоса хроматографа при расходе элюента сначала 50 мкдм³/мин, а затем 100 мкдм³/мин. Промывку колонки заканчивают при получении стабильной нулевой линии.

После промывки колонки проводят ее насыщение витаминами А, Е, для этого выполняют 7—10 анализов наиболее концентрированных градуировочных растворов витаминов А, Е. Насыщение колонки прекращают, когда отношение разности между двумя последовательными определениями концентрации витамина А(Е) к среднему арифметическому значению этих операций не превышает 3%.

При правильной эксплуатации колонка выдерживает 500—600 анализов.

3.2.4    Приготовление растворителя для экстракции витаминов А, Е из премикса

Для экстракции витаминов используют двухкомпонентный экстрагент состава: изопропиловый спирт и дистиллированную воду в объемном соотношении 97:3. Для этого в мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят пипеткой 30 см³ дистиллированной воды и доводят до метки изопропиловым спиртом.

Хранят в стеклянной емкости с притертой пробкой до полного использования экстрагента.

150

ГОСТ Р 50928-96

3.2.5 Определение активности витамина А в масляном препарате

(0,1+0,002) г препарата растворяют в абсолютном спирте в мерной колбе вместимостью 50 см³- Доводят этим же спиртом объем раствора в колбе до метки и перемешивают. Отбирают 1—2 см³ полученного раствора в колбу вместимостью 50 см³, заполняют ее до метки абсолютным спиртом и измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 326 нм в кювете толщиной слоя 1 см. В качестве контрольного раствора применяют абсолютный спирт.

Массовую концентрацию витамина А, X, г/см³, определяют по формуле

D ■V₁ ■ V₂ ■ d т ■ V ■ 100 •1550’

где D — оптическая плотность раствора;

V_x, V₂ — первое и второе разведения, см³; d — плотность препарата, г/см³; т — масса навески препарата, г;

V— объем раствора, используемый для второго разведения, см³;

1550 — удельный показатель поглощения Е _1си при длине волны 326 нм для 100%-ного раствора витамина А в абсолютном спирте;

100 — коэффициент.

Содержание витамина А в 1 см³ соответственно должно быть 0,0310 — 0,0378 г (90000 — 110000 ME), 0,0619 - 0,0757 г (180000 - 220000 ME), 0,0774 - 0,0946 г (225000 - 275000 ME).

Полученные результаты используют для расчета содержания витамина А в стандартном растворе.

3.2.6 Построение градуировочного графика для витамина А

Для приготовления стандартного раствора взвешивают навеску масляного препарата витамина А, необходимую для получения раствора с активностью 30000 ME в 50 см³ или 600 МЕ/см³. Навеску помещают в мерную колбу вместимостью 50 см³, растворяют в изопропиловом спирте, перемешивают и доводят этим спиртом до метки.

Раствор хранят в холодильнике в емкости с притертой пробкой и используют в течение одной недели.

Из этого раствора готовят градуировочные (рабочие) растворы, содержащие 120, 300, 600, 1200, 3000, 6000, 12000 ME витамина А в 25 см³. Для этого берут соответственно 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 20,0 см³ основного раствора, помещают в мерные колбы вместимостью 25 см³ и доводят до метки изопропиловым спиртом.

Срок годности растворов не более 1 мес при хранении в холодильнике в емкости с притертой пробкой при температуре 4— 10°С.

Полученные рабочие растворы анализируют на жидкостном хроматографе «Милихром» при следующих условиях:

хроматографическая колонка 2x64 (2x80), (2x120) мм;

сорбент — Силасорб Cjg, Силасорб SPHCjg, Сепарон Cjg;

трехкомпонентный элюент на основе ацетонитрила;

объем пробы — 6 мкдм³;

длина волны — 328 нм;

постоянная времени — 0,2 с;

скорость подачи элюента — 150 мкдм³/мин.

Удерживаемый объем пика витамина А составляет 300—360 мкдм³ (может меняться в зависимости от длины колонки).

Каждый раствор хроматографируют 2 раза. После выхода пика колонку промывают, прокачивая через нее 100—200 мкдм³ элюента до выхода на нулевую линию.

Значения средних высот хроматографических пиков, выраженных в единицах оптической плотности (е.о.п.), откладывают по оси ординат градуировочного графика, а по оси абсцисс — значения активности витамина А в 25 см³ раствора.

Градуировочный график строят также, откладывая по оси ординат средние высоты хроматографических пиков, выраженные в миллиметрах.

151

Электронная версия

Построение градуировочных графиков можно заменить расчетом коэффициентов наклона К, МЕ/е.о.п. или МЕ/мм, по формуле

П

X*, _v 1=1

где K_t — коэффициент наклона градуировочного графика для /-го градуировочного раствора, МЕ/е.о.п. или МЕ/мм; п — количество точек, по которым строится градуировочная кривая.

Значение коэффициента наклона K_h МЕ/е.о.п или МЕ/мм, вычисляют по формуле

где C_t — содержание витамина А в соответствующем /-м градуировочном растворе, ME; hj — высота /-го хроматографического пика, е.о.п. или мм.

3.2.7    Построение градуировочного графика для витамина Е

0,02 г витамина Е-ацетата стандарта растворяют в изопропиловом спирте в колбе вместимостью 50 см³, доводят спиртом до метки и перемешивают. Получают основной раствор витамина Е с концентрацией 0,4 мг/см³.

Из полученного основного раствора готовят рабочие растворы, содержащие 7, 5, 3, 1, 0,5, 0,1 и 0,05 мг витамина Е в 25 см³ раствора. Для этого соответственно 17,5; 12,5; 7,5; 2,5; 2,25; 1,25; 0,25; 0,125 см³ основного раствора помещают в мерные колбы вместимостью 25 см³ и объем доводят до метки изопропиловым спиртом. Рабочие растворы анализируют на жидкостном хроматографе при следующих условиях:

хроматографическая колонка 2x64 мм (2x80 мм), (2x120 мм);

сорбент — Силасорб Cjg, Силасорб SPHCjg, Сепарон Cjg;

трехкомпонентный элюент на основе ацетонитрила;

объем пробы — 6 мкдм³;

длина волны — 286 нм;

скорость подачи элюента — 100 мкдм³/мин;

постоянная времени —0,2 с.

Удерживаемый объем пика витамина Е составляет 540—660 мкдм³ (может меняться в зависимости от длины колонки).

Каждый раствор хроматографируют 2 раза. После выхода пика колонку промывают, прокачивая через нее 200—250 мкдм³ элюента до выхода на нулевую линию.

Значение средних высот хроматографических пиков (в единицах оптической плотности или миллиметрах) откладывают по оси ординат градуировочного графика, а по оси абсцисс — значение активности витамина Е в миллиграммах в 25 см³ раствора.

Построение градуировочного графика можно заменить расчетом коэффициента наклона К по

3.2.6.

3.2.8    Проверка градуировочных графиков

Ерадуировочные графики контролируют не реже 1 раза в неделю. Для этого 1—2 рабочих растворов витаминов А, Е следует хроматографировать по 3.2.6 и 3.2.7.

Отклонение полученных результатов (высота пика, выраженная в единицах оптической плотности или миллиметрах) от измеренных в момент построения градуировочного графика а, %, определяют по формуле

(/г. - /г,) ■ 100 ^{д =}-*;-»

где h_x и h₂ — высота хроматографического пика, определенная при построении градуировочного графика и в момент проверки соответственно, е.о.п. или мм.

При отклонении более 5% строят новый градуировочный график по свежеприготовленным растворам масляного препарата витамина А, витамина Е-ацетат стандарта.

4    152

ГОСТ Р 50928-96

3.3 Порядок проведения контроля

3.3.1 Экстракция витаминов А, Е из премиксов

Из тщательно перемешанной пробы исследуемого премикса берут навеску с погрешностью не более 0,0005 г. Затем навеску премикса помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 25 см³ или 50 см³ и приливают раствор для экстракции в соответствии с таблицей 1.

Таблица 1

Содержание витамина А в премиксе, МЕ/г Содержание витамина Е в премиксе, мкг/г Масса навески премикса, г Объем экстрагента, см3 40-100 50-100 10 20 100-2000 100-500 5 15 2000-6000 500-1000 2 10

Колбу соединяют с обратным холодильником и нагревают на водяной бане при температуре (75+1) °С в течение 10 мин. Колбу с экстрактом премикса отсоединяют от обратного холодильника, закрывают притертой пробкой, охлаждают под струей воды до комнатной температуры и фильтруют через фильтр ПОР-16 с размером пор 10—16 мкм с использованием водоструйного вакуумного насоса. Фильтрат собирают в мерную колбу вместимостью 25 см³. Коническую колбу и осадок на фильтре тщательно промывают два-три раза небольшими порциями (2—3 см³) изопропилового спирта. Раствор в мерной колбе доводят до метки изопропиловым спиртом, тщательно перемешивают и хроматографируют.

3.3.2 Хроматографирование

Полученные экстракты хроматографируют по 3.2.6 и 3.2.7. Примеры хроматограмм экстрактов витаминов А, Е из премиксов представлены в приложении А, рисунок А. 1.

При возникновении сомнений в правильности выбора пика (по объему или времени удержания), соответствующего витамину А(Е), необходимо в анализируемый экстракт внести небольшое количество одного из градуировочных растворов витамина А(Е) (объемное соотношение экстракт — раствор витамина А(Е) равно 10 : 2 (10 : 5). Увеличение высоты соответствующего пика по сравнению с высотой этого пика на хроматограмме, полученной до введения градуировочного раствора в анализируемый экстракт, свидетельствует, что этот пик соответствует витамину А(Е).

3.4 Обработка результатов контроля

Для определения содержания витаминов А, Е в премиксе проводят две экстракции и каждый экстракт хроматографируют два раза. Находят среднее арифметическое значение высоты пиков, выраженное в единицах оптической плотности или миллиметрах, и по градуировочному графику определяют содержание витаминов А, Е в международных единицах и миллиграммах соответственно.

Содержание в премиксах витаминов А Х_А, Е Х_Е, МЕ/г или мкг/г, определяют по формуле

С_А(С_Е)

где С_А, С_Е — содержание витаминов А, Е, найденное по градуировочным графикам, соответственно ME, мкг; т — масса навески премикса, г.

Содержание в премиксе витамина А Х_А или витамина Е Х_Е, МЕ/г или мкг/г, при использовании коэффициента К вычисляют по формуле

Х_А (Х_Е) - К

где К— коэффициент наклона градуировочного графика для витамина А, Е соответственно, МЕ/е.о.п., мкг/е.о.п.;

/г₄, /г_Г — высота хроматографического пика витамина А, Е соответственно, е.о.п; масса навески премикса, г.

5

Электронная версия

3.5    Оформление результатов контроля

3.5.1    Результаты контроля витаминов в премиксе записывают в специальном журнале для регистрации анализов.

3.5.2    Журнал ведется работником, на которого возложено проведение анализов по определению содержания витаминов в премиксах.

В журнале регистрируют все пробы с обязательным заполнением следующих данных:

-    обозначения премикса и витамина, на который проводится анализ;

-    наименования предприятия-поставщика премикса;

-    массы партии;

-    даты отбора пробы;

-    фамилии и личной подписи лица, отобравшего пробу;

-    результата контроля;

-    фамилии и личной подписи лица, проводившего контроль.

При необходимости в журнал могут быть включены дополнительные сведения.

3.5.3    Записи должны вестись четко, аккуратно.

3.6    Допустимая погрешность контроля

Результат контроля вычисляют с точностью до первого десятичного знака и округляют до целого числа.

За окончательный результат контроля принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности Р = 0,95 не должны быть более 10% для витамина А и 15% для витамина Е относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности Р = 0,95 расхождения не должны превышать 15% для витамина А и 20% для витамина Е соответственно.

4 Определение витаминов A, D, Б нормально-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографией

Сущность метода заключается в омылении навески премикса водно-спиртовым раствором гидроокиси калия, экстракции витаминов A, D, Е гексаном с последующим определением витаминов на жидкостном хроматографе.

Метод применим в диапазоне концентраций витамина А от 10 до 10000 международных единиц на 1 г премикса (МЕ/г), витамина D от 40 до 10000 МЕ/г, витамина Е от 10 до 10000 МЕ/г.

4.1 Аппаратура, материалы и реактивы

Хроматограф жидкостный с фотометрическим детектором и систематической погрешностью измерений не выше 10% отн.: Хром-900 (ЧСФР), Ликвохром (Венгрия), Цвет (РФ) и др. жидкостные хроматографы с аналогичными характеристиками.

Колонка для хроматографии стеклянная или металлическая высотой 150 мм и диаметром 3 мм, заполненная сепароном S6X зернением 7 мкм.

Спектрофотометр со спектральным диапазоном работы от 186 до 1100 нм.

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Линейка измерительная металлическая.

Секундомер механический.

Испаритель ротационный ИР-IM на 2 дм³ или его аналоги.

Баня водяная, обеспечивающая нагрев до 80—100°С.

Холодильники стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336.

Колбы конические со шлифом вместимостью 250 см³ по ГОСТ 25336.

Пипетки 1-1-1(2)-1 по ГОСТ 29169.

Пипетки 1-1-1(2)-1(5) по ГОСТ 29227.

Микрошприцы МШ-10М, МШ-50М по нормативному документу [5].

Колбы мерные 2-25-1(2); 2-50-1(2); 2-100-1(2) по ГОСТ 1770.

Воронки делительные вместимостью 200, 500 см³ по ГОСТ 25336.

Цилиндры 1(2, 3, 4)-50; 1(2, 3, 4)-100; 1(2, 3, 4)-250; 1(2, 3, 4)-1000 по ГОСТ 1770.

Пробирки с притертой пробкой 2-5-0,1(0,2); 2-10-0,1(0,2) по ГОСТ 1770.

Воронки стеклянные диаметром 4—6 см по ГОСТ 25336.

154

ГОСТ Р 50928-96

Склянки с притертой пробкой.

Стеклянные палочки.

Марля медицинская по ГОСТ 9412.

Колонки стеклянные диаметром 2—4 см и высотой 80 см.

Калия гидроокись по ГОСТ 24363.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962 или ГОСТ 18300.

Спирт этиловый абсолютированный для спектрофотометрии или по нормативному документу [6].

Гексан по нормативному документу [7].

Спирт изопропиловый (пропанол-2) по нормативному документу [2].

Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166.

Ретинол ацетат (витамин А) по нормативному документу [11].

Эргокальциферол кристаллический (витамин D) по нормативному документу [13]. а-токоферолацетат (витамин Е) по нормативному документу [12].

Алюминия окись для хроматографии, нейтральная по нормативному документу [8].

Гидрохинон по ГОСТ 19627.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Бумага универсальная индикаторная по нормативному документу [9].

Фильтры обеззоленные (красная лента) по нормативному документу [10].

Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.

4.2 Порядок подготовки к проведению контроля

4.2.1    Определение массовой концентрации масляного раствора витамина А по 3.2.5.

4.2.2    Приготовление стандартного раствора витамина А

Для приготовления стандартного раствора взвешивают (лучше на часовом стекле) навеску масляного препарата, необходимую для приготовления раствора с активностью витамина 10000 МЕ/см³, переносят ее в мерную колбу вместимостью 25 см³ и растворяют в изопропиловом спирте. Раствор перемешивают и доводят до метки спиртом. Хранят в холодильнике в емкости с притертой пробкой и используют в течение недели.

4.2.3    Приготовление стандартного раствора витамина D₂

Ампулу кристаллического эргокальциферола, содержащую 0,1000 г, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят содержимое колбы до метки изопропиловым спиртом и перемешивают. Полученный раствор (1) содержит 40000 МЕ/см³ витамина 0₂. Из него берут 1 см³ раствора, помещают в мерную колбу вместимостью 50 см³, доводят до метки этим же спиртом и перемешивают. Полученный раствор (2) содержит 800 МЕ/см³ витамина D₂. Раствор хранят в плотно закрытой стеклянной посуде в холодильнике.

4.2.4    Приготовление стандартного раствора витамина Е

Навеску масляного препарата а-токоферолацетата массой 0,0500 г переносят в мерную колбу вместимостью 25 см³, растворяют в изопропиловом спирте, доводят им до метки и тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в емкости с притертой пробкой в течение одной недели.

4.2.5    Подготовка растворителей

Очистку растворителей, применяемых в хроматографии, проводят посредством перегонки, отбрасывая первую и последнюю фракции в количестве Ую от первоначального объема, или пропусканием через колонку, заполненную активированной окисью алюминия.

Окись алюминия активируют при нагревании в течении 1 ч при температуре 400—450°С. Колонку высотой 60—80 см и диаметром 2 см заполняют 80 г активированной окиси алюминия и пропускают через нее 700 см³ растворителя. Для проверки чистоты в колонку жидкостного хроматографа загружают 50 мкдм³ растворителя. В случае его загрязнения на хроматограмме появляются пики, соответствующие времени удерживания витаминов A, D, Е.

4.2.6    Приготовление водно-спиртового раствора гидроокиси калия с массовой долей 10%

Растворяют 20 г гидроокиси калия в смеси из 20 см³ воды и 180 см³ этилового спирта.

Раствор готовят непосредственно перед контролем.

4.3 Порядок проведения контроля

4.3.1 Омыление и подготовка к контролю стандартных растворов витаминов A, D, Е

В конические колбы вместимостью 250 см³, снабженные обратным холодильником, помещают 1 см³ раствора [2] витамина D по 4.2.3, 0,25 см³ ретинолацетата и 0,2 см³ а-токоферолацетата.

155

Электронная версия

Добавляют 0,1 г гидрохинона и 30 см³ 10%-ного водно-спиртового раствора гидроокиси калия. Подвергают омылению в течение 30 мин на водяной бане при температуре 85°С. Содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры под струей холодной воды, добавляют 30 см³ дистиллированной воды и 30 см³ гексана. Полученную смесь тщательно перемешивают и сливают в делительную воронку вместимостью 200 см³.

После расслаивания нижний слой (водно-спиртовый) сливают в коническую колбу, а гексановый слой оставляют в делительной воронке. Эту операцию экстракции гексаном водно-спиртового слоя в конической колбе проводят еще дважды, каждый раз сливая в делительную воронку гексановый слой.

Гексановые вытяжки объединяют и промывают в делительной воронке дистиллированной водой порциями по 30 см³ до нейтральной реакции среды (проверяют по индикаторной бумаге). Промытый экстракт переносят в сухую перегонную колбу, пропуская его через бумажный фильтр и слой безводного сульфата натрия (40—50 г). Делительную воронку и фильтрующий материал промывают свежими порциями гексана (20—30 см³).

Все гексановые растворы объединяют и помещают в колбу роторного испарителя. Температура водяной бани роторного испарителя 70°С. После отгонки гексана сухой остаток растворяют в 3 см³ гексана и переносят в мерную предварительно откалиброванную пробирку с притертой пробкой. Раствор может храниться в темном месте при температуре 4—8°С.

4.3.2    Омыление и подготовка к хроматографированию образцов премиксов

Навеску премикса массой 10 г взвешивают с погрешностью не более 0,0005 г, помещают в коническую колбу вместимостью 250 см³, снабженную обратным холодильником. Добавляют антиоксидант (0,1 г гидрохинона), 50 см³ водно-спиртового раствора щелочи и подвергают омылению на водяной бане при температуре 82—85°С в течение 30 мин.

По окончании омыления содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры, добавляют 50 см³ дистиллированной воды и 50 см³ гексана, смесь тщательно перемешивают и дают отстояться. После расслаивания смеси гексановый слой осторожно сливают в делительную воронку вместимостью 500 см³.

Экстракцию гексаном повторяют дважды порциями по 50 см³, последнюю фракцию переносят в делительную воронку, сливая содержимое колбы через воронку с марлевым слоем. Остаток на марле слегка отжимают стеклянной палочкой и выбрасывают. Воронку обмывают дистиллированной водой (около 50 см³) в делительную воронку, в которой собраны гексановые вытяжки. Содержимое воронки промывают дистиллированной водой порциями по 50 см³ до нейтральной реакции среды (по индикаторной бумаге). Промытый экстракт переносят в сухую перегонную колбу, пропуская его через обеззоленный фильтр, заполненный безводным сульфатом натрия (около 50 г). Делительную воронку и фильтрующий материал промывают 40 см³ гексана. Отгоняют гексан на ротационном испарителе при температуре бани 70°С. Сухой остаток растворяют в 3 см³ гексана, который добавляют порциями, чтобы перенести в предварительно откалиброванную пробирку с притертой пробкой.

Полученный экстракт используют для хроматографического анализа.

4.3.3    Подготовка жидкостного хроматографа к работе

Подготовка хроматографа осуществляется в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.

Перед началом измерений хроматограф прогревают в течение 15 мин. Сначала проводят заполнение насоса элюентом. В качестве подвижной фазы используют смесь гексана с этанолом в объемном отношении 99,5 : 0,5. Устанавливают скорость элюирования, соответствующую эффективности колонки для конкретных премиксов от 0,5 до 2 см³/мин. При определении витаминов А, Е устанавливают светофильтр длиной волны 289 нм, для определения витамина D — светофильтр длиной волны 254 нм. Скорость движения диаграммной ленты регистратора устанавливают равной 0,3—0,6 см/мин.

После промывания колонки элюентом регистрирующий прибор должен показывать нулевую линию без дрейфа нуля. С целью повышения чувствительности и точности измерений для каждого хроматографа подбирают оптимальные условия хроматографирования.

4.3.4    Проведение хроматографических измерений

Для хроматографических измерений используют метод сравнения со стандартом. Сравнивают высоты хроматографических пиков для анализируемой пробы и пробы стандарта.

В колонку последовательно вводят от 3 до 20 мкдм³ исследуемого раствора, стандартного раствора витамина А и стандартного раствора витамина Е. Получают соответствующие хроматограммы при длине волны фотометрического детектора 289 нм, приложение Б, рисунок Б.1.

156