ГОСТ P 51228-98 (ИСО 3983-77) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ЗЕРНО И ЗЕРНОВЫЕ ПРОДУКТЫ

Колориметрический метод определения активности альфа-амилазы

Издание официальное

2

ГОССТАНДАРТ РОССИИ Москва

Предисловие

1    РАЗРАБОТАН Всероссийским научно-исследовательским институтом зерна и продуктов его переработки (ВНИИЗ)

ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 2 «Зерно, продукты его переработки и маслоссмена»

2    ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 15 декабря 1998 г. № 447

3    Настоящий стандарт представляет собой аутентичный текст ИСО 3983—1977 «Зерно и зерновые продукты. Колориметрический метод определения альфа-амилазной активности* кроме раздела 6

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

<0 ИПК Издательство стандартов, 1999

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Госстандарта России

II

Содержание

1    Область применения...................................................... 1

2    Нормативные ссылки..................................................... 1

3    Определение............................................................ 1

4    Сущность метода......................................................... 1

5    Реактивы...........

6    Аппаратура.........

7    Лабораторная проба . .

8    Анализируемая навеска

9    Методика анализа....

10    Обработка результатов

11    Отчет об анализе ....

III

ГОСТ Р 51228-98 (ИСО 3983-77) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ЗЕРНО И ЗЕРНОВЫЕ ПРОДУКТЫ

Колориметрический метод определения активности альфа-амилазы

Cereals and cereal products. Determination of alpha-amylase activity. Colorimetric method

Дата введения 1999—07—01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает колориметрический метод определения активности альфа-амилазы зерна и зерновых продуктов, варьирующей от очень низких до очень высоких значений. Метод используют также для оценки активности альфа-амилазы в добавках грибкового или бактериального происхождения.

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ ИСО 2170-97 Зерновые и бобовые. Отбор проб размолотых продуктов

ГОСТ 7698-93 (ИСО 1666—73) Крахмал. Правила приемки и методы анализа

ГОСТ 29143-91 (ИСО 712—85) Зерно и зернопродукгы. Определение влажности (рабочий контрольный метод)

ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950—79) Зерновые. Отбор проб зерна

3    Определение

Активность альфа-амилазы продукта равна 1 единице, если фермент, извлеченный из 1 г продукта, в объеме 1 дм³, при определенных условиях вызывает за одну секунду гидролитическое расщепление 1.024x10“* единиц субстрата бета-конечного декстрина в пересчете на единицу наличного субстрата. Бета-конечный декстрин является продуктом полного расщепления крахмала бета-амилазой.

4 Сущность метода

Фермент осуществляет расщепление субстрата — бета-конечного декстрина (далее — конечный декстрин). В ходе реакции через определенные интервалы времени аликвоты реакционной смеси добавляют к раствору йода. Снижение интенсивности окраски при увеличении времени реакции характеризует ферментную активность.

Издание официальное

ГОСТ Р 51228-98

5 Реактивы

Вес реактивы должны быть квалификации чистый для анализа ч.д.а. Используют дистиллированную воду или воду, соответствующую по чистоте дистиллированной.

5.1    Йод, основной раствор

Растворяют 11,0 г йодистого калия в минимальном количестве воды и добавляют 5,50 г кристаллов йода. Перемешивают до полного растворения йода и разбавляют до (250±0,5) см³. Хранят раствор в темноте в склянке из коричневого стекла. Срок хранения раствора 1 мес.

5.2    Йод, разбавленный раствор

Растворяют 40,0 мг йодистого калия в воде, добавляют 4,00 см³ основного раствора (5.1) и разбавляют до (1000±1) см³. Раствор следует готовить в день использования.

5.3    Буферный раствор

Растворяют 120 см³ ледяной уксусной кислоты и 164 г безводного уксуснокислого натрия или 272 гтригндрата уксуснокислого натрия (CHjCOONa • ЗН₂0) в воде и разбавляют до (1000±1) см³.

5.4    Хлористый кальций, раствор 2 г/дм³

Растворяют 2,0 г безводного хлористого кальция или 2,6 г дигидрата хлористого кальция (СаС1₂ • 2Н₂0), или 3,9 г гексагилрата хлористого кальция (СаС1₂ • 6Н₂0) в воде и разбавляют до (1000±1) см³.

5.5    Раствор конечного декстрина

Используют растворимый крахмал Линтнера, специально предназначенный для определения диастатической активности¹). Его влажность определяют в соответствии с ГОСТ 7698 (метод 1).

Используют специальный порошок зерновой бета-амилазы, свободный от альфа-амилазы¹)

Навеску крахмала массой 10,00 г сухого вещества суспендируют 20,0 см³ воды. Приготовленную суспензию медленно, при помешивании, выливают в химический стакан с 300 см³ кипя шей воды. Для полного перенесения крахмала его смывают с помощью промывалки. Раствор медтенно кипятят в течение 2 мин при помешивании и затем охлаждают в проточной воде до температуры нс выше 30 *С. Химический стакан с раствором крахмала покрывают часовым стеклом во избежание образования пленки на поверхности раствора крахмала. Затем добавляют 25 см³ буферного раствора (5.3) и 250 мг бета-амилазы, растворенной приблизительно в 5 см³ воды.

Объем доводят водой до 500 см³, добавляют несколько капель толуола и весь раствор перемешивают.

pH раствора должен составлять (4,7±0,1). Если pH находится вне этих пределов, раствор аннулируют.

Прежде чем раствор используют в качестве субстрата он должен быть выдержан при комнатной температуре не менее 20 ч. Раствор следует хранить нс более 5 дней при температуре нс выше 25 *С.

6 Аппаратура

Используется обычная лабораторная аппаратура, стеклянные изделия и, кроме того:

6.1 Водяная баня с постоянной температурой, отрегулированной на (30,0±0,1) *С.

6.2 Водяная баня с постоянной температурой, отрегулированной на (20,0±0,5) *С.

6.3    Спектрофотометр, способный работать при длине волны 575 нм, или колориметр, снабженный желтым фильтром длиной волны максимального пропускания около 575 нм и соответствующей полушириной полосы, с логарифмической шкалой для измерения значения поглощения света (оптической плотности).

6.4    Секундомер с секундной стрелкой.

^!)Могуг быть использованы следующие крахмалы Линтнера, эквивалентные прежнему № 09903 каталога Merck and Со., N.V., США

—    J.T. Baker Chemical Со, Филлипсбург, США, каталог, jNe 5995120

—    BDH Chemicals Lid. Пул. Великобритания, каталог, № 30260

—    Е.Merck. Дармштадт, ФРГ, каталог, № 1252.

²⁾Используют бета-амилазу фирмы Wallerstcin Со., Штатен-Айлснд 3. N.V., США, или вещество эквивалентного качества.

ГОСТ Р 51228-98

6.5    Сито с продолговатыми отверстиями 1,0 мм (для зерна).

6.6    Сито диаметром отверстий 0,8 мм.

6.7    Лабораторная мельница, желательно молоткового типа (для зерна).

6.8    Центрифуга (для ржи), снабженная стаканами емкостью 100 см³ с фактором разделения 3000 (приблизительно от 1000 до 2000 g).

6.9    pH-метр со стеклянным электродом, откалиброванный при pH 4, и проверенный при pH 10 с использованием соответствующих буферных растворов.

6.10    Весы лабораторные общего назначения с допускаемой погрешностью взвешивания ±0,05 г.

6.11    Весы лабораторные общего назначения с допускаемой погрешностью взвешивания ±0,0004 мг.

7 Лабораторная проба

Представительную пробу отбирают в соответствии с ГОСТ Р 50436 или ГОСТ ИСО 2170.

8 Анализируемая навеска

8.1    Подготовка навески

8.1.1    Зерно

Масса зерна, подлежащая размолу, должна составлять около 300 г. Отбирают вручную крупную сорную примесь, удаляют пыль и другие мелкие примеси путем просеивания на сите с продолговатыми отверстиями (6.5). Оставшееся на сите зерно размалывают на мельнице (6.7) и просеивают через сито с отверстиями 0,8 мм (6.6), затем тщательно перемешивают.

8.1.2    Мука

Навеску муки просеивают через сито с отверстиями 0,8 мм (6.6), разбивая комочки.

8.2    Влажность

Определение влажности анализируемой навески проводят в соответствии с ГОСТ 29143. ²

ГОСТ Р 51228-98

Этот объем воды используют для настройки спектрофотометра, колориметра по 9.1 и при определении всех значений оптической плотности по 9.4.

Если при настройке прибора было использовано другое количество воды, повторяют юстировку с полученным объемом воды.

9.3    Экстракция фермента

9.3.1    Анализируемая навеска

Взвешивают в колбе или пробирке, снабженных пробками, около 5 г размолотого зерна (8.1.1) или муки (8.1.2) с точностью ±0,05 г. Допускается использование меньшей навески продукта с высокой ферментной активностью, при точности взвешивания 1 % и выше, если масса превышает 2/А грамм, где А — активность продукта в единицах.

9.3.2    Экстракция

К анализируемой навеске добавляют (100,0±0,5) см³ раствора хлористого кальция (5.4), предварительно подогретого до 30 *С в водяной бане (6.1) и тщательно смешивают встряхиванием. После 15, 30 и 45 мин вынимают колбу или пробирку из водяной бани, переворачивают вверх дном и обратно 10 раз и вновь погружают в баню. (Постоянное встряхивание даст варьирующие результаты, поэтому не рекомендуется встряхивать чаше указанных периодов времени).

После 60 мин экстракции колбу или пробирку вынимают и без встряхивания немедленно сливают содержимое в пробирку центрифуги или переносят на фильтр. Растворы не следует оставлять в смесительном сосуде. Необходимо либо центрифугировать суспензию в течение 10 мин при 1000—2000 g, либо отфильтровывать требуемое количество, отбрасывая первые капли, до получения прозрачного экстракта. Экстракты ржи желательно центрифугировать, так как их трудно фильтровать. Анализируют жидкость после фильтрования или центрифугирования.

9.4    Определение расщепления конечного декстрина

15,0 см³ ферментного экстракта (9.3.2) переносят с помощью пипетки в опытную пробирку или колбу емкостью 50 см³, закрывают се пробкой и погружают в водяную баню (6.1) при 30 *С. В другую пробирку' или колбу заливают около 20 см³ субстрата конечного декстрина (5.5), закрывают пробкой и помешают также в водяную баню (6.1) при 30 *С.

Когда экстракт и субстрат прогреются до 30 *С (приблизительно через 5—10 мин), переносят пипеткой (с быстрым истсканием) 5,0 см³ субстрата в пробирку или колбу, содержащую 15,0 см³ экстракта, закрывают пробкой и перемешивают при энергичном встряхивании. Одновременно с внесением субстрата включают секундомер (6.4).

В каждую из опытных пробирок или колб емкостью по 50 см³ вносят пипеткой 10,0 см³ разбавленного раствора йода (5.2), добавляют из бюретки объем воды, установленный при контроле субстратного раствор;! (9.2), смешивают путем вращения, закрывают пробки и погружают в водяную баню (6.2) при 20 *С.

С интервалом 5 или 10 мин выполняют следующие действия:

а)    наливают пипеткой 2,0 см³ смеси фермента и субстрата в одну из опытных пробирок или колб, содержащих смесь разбавленного раствора йода и воды;

б)    смешивают путем вращения;

с) доводят температуру до 20 *С погружением в водяную баню (6.2);

д) заливают в кювету и измеряют оптическую плотность как в 9.2.

Температура растворов в спектрофотометре или колориметре влияет на оптическую плотность и поэтому должна поддерживаться около 20 *С. Временной интервал между отмериванием пипетками и измерением оптической плотности обычно нс имеет непосредственного влияния на результаты, но не должен превышать 1 ч. Измерение оптической плотности серии растворов продолжают пока не будет залита пипеткой последняя порция 2 см³ смеси ферментного экстракта и субстрата.

Концентрация фермента в реакционной смеси должна быть подобрана таким образом, чтобы 35—60 % субстрата разложилось в течение 15—40 мин, т.е. последнее значение оптической плотности должно составлять 40—65 % от оптической плотности, полученной при проверке субстратного раствора (9.2). Если оптическая плотность уменьшается слишком быстро, необходимо разбавить ферментный экстракт раствором хлористого кальция (5.4) и провести новое определение. Если амилазная активность пробы низкая, что наблюдается у некоторых проб муки, то необходимо увеличить время реакции до 60 мин и более для получения точных результатов.

Примечания

1 Разложение субстрата в диапазоне 35—60 % за определенное время можно легко установить без прибора посредством визуального сравнения. Смешивают 1 часть раствора субстрата конечного декстрина (5.5) с

4

ГОСТ Р 51228-98

ция. Поскольку скорость реакции с конечным декстрином была слишком высокой, ферментный экстракт был разбавлен раствором хлористого кальция. К 1 части экстракта было добавлено 1,5 части раствора хлористого кальция.

Поэтому

/= 1 + 1,5 = 2,5.

Через 5, 10 и 20 мин после смешивания субстрата и ферментного экстракта были получены следующие значения оптической плотности.

Время, мин Оптическая плотность D    lgZ)    (+1)

5    0,498    0,697

10    0,425    0,628

20    0,308    0,489

Из измерений после 5 и 10 мин

Из графика lgD по отношению к / (см. рисунок 1), построенному по всем трем наблюдениям, Ь = 0,01391 мин-¹.

Подставив последний результат в формулу 1, получим

500 х 2,5 х 0,01391    100

5,20 ^Х 100-14,60

10.1.2 Рассчитывают среднее арифметическое значение результатов двух определений с учетом того, что расхождение между этими двумя результатами не должно превышать максимума, указанного в требованиях в 10.2.

ГОСТ Р 51228-98

Если расхождение больше, повторяют определение в двух повторностях и рассчитывают среднее арифметическое значение вновь полученных результатов, учитывая требования 10.2. Округляют в соответствии:

Интервал округлений, единицы 0,1 1 10

100 и т.д.

lgC_L-lg3 ₌ £ ^f2~'l Я

10.2 Сходимость

Огнос1ггельное допускаемое расхождение между результатами двух параллельных определений при вероятности Р = 0,95 нс должно превышать 10 % их среднего арифметического значения.

Абсолютное допускаемое расхождение между результатами двух параллельных определений при вероятности Р— 0,95 нс должно превышать 0,2 единицы при среднем арифметическом значении нс более 2 единиц.

11 Отчет об анализе

В отчете об анализе должен быть указан использованный метод и полученные результаты. Должны быть также упомянуты любые рабочие условия, нс установленные настоящим стандартом или рассматриваемые в качестве факультативных, а также любые обстоятельства, которые могли повлиять на результат.

Отчет должен включать все подробности, необходимые для полной идентификации пробы. ³

1

2

Методика анализа

9.1    Настройка спектрофотометра или колориметра

В химический стакан емкостью 100 см³ наливают пипеткой 2,0 см³ раствора хлористого кальция (5.4) и 10,0 см³ разбавленного раствора йода (5.2). Доливают из бюретки объем воды, который предварительно определяют по 9.2, и смешивают. Доводят до 20 *С, поместив химический стакан в водяную баню (6.2).

Наполняют кювету этим раствором и помещают се в спектрофотометр (отрегулированный на длину волны 575 нм) или калориметр (снабженный соответствующим желтым фильтром) (6.3), и регулируют ширину шели таким образом, чтобы на шкале оптической плотности прибора установился ноль.

Настройку прибора контролируют регулярно в период измерения.

9.2    Контроль раствора субстрата

Приливают пипеткой 5,0 см³ раствора конечного декстрина (5.5) и 15,0 см³ раствора хлористого кальция (5.4) в химический стакан емкостью 100 см³, перемешивают и переносят 2,0 см³ смеси в другой аналогичный сухой стакан. Сюда же вносят пипеткой 10,0 см³ разбавленного раствора йода (5.2) и с помощью бюретки необходимый объем воды, как описано ниже.

Перемешивают содержимое стакана, доводят его температуру до 20 *С погружением стакана в водяную баню (6.2).

Заполняют кювету небольшим количеством этой смеси, помешают ее в выбранный прибор и измеряют оптическую плотность. Кювету, наполненную раствором, приведенным в 9.1, используют для сравнения. Методом проб и ошибок подгоняют объем добавляемой воды из бюретки так, чтобы значения оптической плотности находились между 0,55 и 0,60 (5,5 и 6,0 в определенных приборах).

3